鸡白痢沙门菌spiC-rfaH双基因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于禽沙门菌病的防治领域，具体涉及一种鸡白痢沙门菌spiC-rfaH双基 因敲除减毒株及其DIVA疫苗应用。
【背景技术】
[0002] 鸡白痢是由鸡白痢沙门菌(Salmonella Pullorum)引起的一种多发性传染病，对 我国的养鸡业危害极大。该病原菌除了能够水平传播，还可经蛋垂直传播而导致孵化率和 出雏率的降低，多侵害20日龄以内雏鸡，以白色下痢为特征，表现急性败血症经过，发病率 和病死率相当高;成年鸡多为慢性或隐性感染，一般无明显临诊症状。防治此病的传统方法 是使用抗生素类药物，长期使用易引起药物残留和细菌耐药性增强等诸多影响，因此，以疫 苗预防鸡白痢的研究颇受重视。
[0003] 根据长期以来对鸡白痢沙门菌防控措施的探索和实践，鸡白痢沙门菌的控制依赖 一个地区的感染程度。感染水平低或可实施检疫淘汰制度的地区可采取血清学检测和扑杀 的办法控制鸡白痢，感染水平高或者无法进行淘汰扑杀的地区考虑使用疫苗。因此，理想的 鸡白痢沙门菌减毒活疫苗除了应具备安全性和有效性外，最好还应具备D I V A (Differentiation of Infected and Vaccinated Animals, DIVA)的特点，即通过简单有 效的血清学检测方法，就能区分疫苗免疫动物和自然感染动物，以指导生产现场的疫苗使 用。〇-抗原是革兰阴性菌细胞最外层结构脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)的主要组成部 分，不仅是病原菌的致病因子，其特异多糖重复单元的数目差异也是〇-血清分型的依据。基 于LPS特异性的玻板凝集试验以其简单易行的操作特点，目前在国内外被广泛用于鸡白痢 的检疫诊断。综上所述，〇-抗原可作为新型鸡白痢沙门菌减毒活疫苗的操作靶点和选择标 志，用以构建DIVA疫苗。
[0004] DIVA活疫苗已在畜禽中成功应用于防止病毒感染。
[0005] 重组自杀质粒技术和Red同源重组技术作为基因突变方法已经被广泛应用于细菌 的基因敲除与基因替换。沙门菌spiC与致病性密切相关，rfaH参与细菌LPS的生物合成。双 基因敲除极大地降低了减毒活疫苗在实际应用过程中发生回复突变的可能性，在不影响免 疫原性的前提下，最大程度的规避毒力返祖的风险，保证了疫苗的安全性。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种鸡白痢沙门菌spiC-rfaH 双基因敲除减毒株及其制备与应用。
[0007] 为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明的第一方面，提供一种鸡白痢沙门菌SpiC-rfaH双基因敲除减毒株，为spiC 基因和rfaH基因都不表达的鸡白痢沙门菌。
[0009] 优选的，所述鸡白痢沙门菌spiC-rfaH双基因敲除减毒株，为spiC基因和rfaH基因 都被敲除的鸡白痢沙门菌。
[0010] 鸡白痢沙门菌为现有技术，具体信息为:Accession:NC_021984.1;GI:529218781。 spiC基因为现有技术，具体信息为Accession: JN673268.1;GI :374304599dfaH基因为现 有技术，具体信息为 ACCESSION: CP006575 ;REGI0N: 3520762 …3521250。
[0011] 只要将鸡白痢沙门菌中的spiC基因和rfaH基因都进行敲除，使得spiC基因和rfaH 基因都不表达，即可获得鸡白痢沙门菌spiC-rfaH双基因敲除减毒株。
[0012] 优选地，本发明一实施例中，被敲除的spiC基因的序列如SEQ ID NO. 1所示，具体 为：
[0013] TCTGAGGAGGGATTCATGCTGGCAGTTTTAAAAGGCATTCCATTAATTCAGGATATCAAGGCCGAAGGTAATAGCCG ATCCTGGATAATGACTATTGATGGGCATCCTGCCAGAGGAGAAATTTTCTCAGAAGCATTTTCTATTTCTTTGTTCT TAAATGACCTGGAAAGCTTACCTAAGCCTTGTCTTGCCTATGTGACACTACTGCTTGCAGCACACCCGGACGTACAT GATTATGCTATACAGCTCACAGCGGATGGGGGATGGTTAAACGGTTATTATACCACAAGTAGTAGCTCTGAGCTTAT TGCTATTGAGATAGAAAAACACCTGGCTTTAACTTGCATTTTAAAAAATGTAATACGCAATCACCATAAACTTTATT CGGGTGGGGTATAA〇
[0014] 优选地，本发明一实施例中，被敲除的rfaH基因的序列如SEQ ID NO.2所示，具体 为：
[0015] ATGCAATCCTGGTATTTACTGTACTGCAAACGCGGGCAACTTCAGCGTGCTCAGGAACACCTCGAAAGACAAGCGGT AAGTTGCCTGACACCGATGATCACCCTGGAAAAAATGGTACGCGGAAAACGTACCTCCGTCAGCGAACCGCTCTTTC CTAATTATCTGTTCGTTGAATTTGATCCGGAAGTGATACATACCACTACAATCAACGCCACGCGCGGCGTCAGCCAT TTTGTGCGCTTTGGCGCGCATCCTGCGATCGTGCCTTCCAGCGTTATTCATCAGCTTTCTATCTACAAGCCCGAAGG CGTTGTCGATCCTGAAACCCCCTATCCCGGCGATAGCGTC ATCATCACGGAAGGCGCATTTGAAGGGCTGAAAGCGATTTTTACCGAACCGGATGGCGAAACGCGTTCGATGTTACT GCTTAATTTACTCAATAAAGAAGTGAAGCAGAGCGTAAAAAACACCGGTTTTCGCAAGATTTAG〇
[0016] 进一步地，所述减毒株还可经过其他基因改造。
[0017]所述的其他基因改造是指除spiC基因和rfaH基因双敲除以外的基因改造。所述其 他基因改造可以是单个目标基因的改造或者为多个感兴趣目标基因的改造。感兴趣目标基 因并不特指，可以根据研究需要设定并改造。例如，可以是一个、两个、三个以上目标基因的 改造。理论上可以不断对其进行基因改造，对于目标基因的改造数量可以按照需要操作，没 有特别限制。
[0018]基因改造具体是指通过生物或化学或物理的手段使基因相比改造前在结构上发 生变化。这种变化主要是指碱基对组成的变化，包括但不限于一个或多个碱基对的替换、增 添、缺失引起的改变。所述基因改造包括但不限于目标基因的敲入、目标基因的敲除等。目 标基因的敲入、目标基因的敲除可以采用基因打靶、同源重组等技术来完成。
[0019]优选地，本发明另一实施例中，如SEQ ID N0.2所示的rfaH基因被敲除并替换为 FRT位点序列。所述FRT位点序列如SEQIDN0.3所示，具体为：
[0020] Tgggaattagccatggtccatatgaatatcctccttagttcctattccgaagttcctattctctagaagtataggaa cttcgaagctgctccagcctaca〇
[0021]上述FRT位点序列的引入，并不影响鸡白痢沙门菌SpiC-rfaH双基因敲除减毒株的 性能。
[0022]本发明的第二方面，提供了前述鸡白痢沙门菌spiC-rfaH双基因敲除减毒株的构 建方法，包括步骤:将鸡白痢沙门菌中的sp i C基因和rfaH基因都敲除。
[0023]可以采用现有的基因编辑方法敲除所述spiC基因和rfaH基因。优选地，可采用同 源重组的方法敲除spiC基因和rfaH基因。在优选的实施例中，采用Red同源重组的方法敲除 spiC基因和rfaH基因。还可采用其他方法实现基因敲除，并不限于实施例所列举的方式。 [0024] 基于spiC基因的敲除，spiC基因的完整序列从染色体DNA中去除;基于rfaH基因的 敲除，rfaH基因的完整序列从染色体DNA中被去除。
[0025]在一实施例中，先构建spiC基因敲除的鸡白痢沙门菌突变株，并在此基础上敲除 rfaH基因。
[0026]本发明的第三方面，提供了前述鸡白痢沙门菌spiC-rfaH双基因敲除减毒株在制 备鸡白痢沙门菌活疫苗中的用途。
[0027] 本发明的第四方面，提供了一种鸡白痢沙门菌活疫苗，含有前述鸡白痢沙门菌 spiC-rfaH双基因敲除减毒株。
[0028] 进一步的，所述鸡白痢沙门菌活疫苗中还含有佐剂。
[0029]本发明的第五方面，提供了 spiC基因和rfaH基因共同作为靶基因在筛选鸡白痢沙 门菌感染治疗药物中的用途。
[0030] 本发明所述鸡白痢沙门菌感染治疗药物为以spiC基因和rfaH基因为治疗靶基因， 使spiC基因和rfaH基因敲除、不表达的药物或者以spiC基因和rfaH基因表达的蛋白为拮抗 对象的药物;或者以sp i C基因、rfaH基因和其他基因共同作为靶基因加以沉默的药物。以 spiC基因和rfaH基因为靶点，筛选使这两个基因不表达的药物，用于使鸡白痢沙门菌毒性 减弱，以治疗鸡白痢沙门菌感染。例如，该鸡白痢沙门菌感染治疗药物可以通过RNA干扰或 者基因重组的方法使spiC基因和rfaH基因敲除或不表达;或者通过制备spiC蛋白和rfaH蛋 白拮抗剂，使spiC基因和rfaH基因表达的蛋白不发挥作用。
[0031] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032]本发明旨研制了一种spiC-rfaH双基因敲除的鸡白痢沙门菌减毒株，本发明通过 动物试验发现，所述突变株毒力显著降低，在宿主体内定殖时间明显缩短，接种后鸡只无不 良反应，对强毒力鸡白痢沙门菌提供良好的保护作用，可有效清除强毒力菌株感染。
[0033]进一步的，采用所述减毒株做制备的鸡白痢沙门菌活疫苗，其毒力相对于野生型 鸡白痢沙门菌显著降低，表现在其对1日龄海兰白雏鸡的致死剂量明显提高。接种本发明鸡 白痢沙门菌减毒活疫苗后，宿主不产生针对〇-抗原的抗体，通过鸡白痢鸡伤寒多价检测抗 原，可有效的应用玻板凝集试验对免疫接种鸡和自然感染鸡予以区分。所述疫苗具有良好 的免疫原性，对雏鸡可提供坚实的免疫保护效果，并且可以通过玻板凝集试验快速地区分 疫苗接种鸡与自然感染鸡。亦即，所述疫苗具有区分免疫接种鸡和自然感染鸡的功能，通过 玻板凝集试验即可加以区别，疫苗应用不影响鸡白痢阳性鸡检疫淘汰制度的实施。
【附图说明】
[0034] 图1:鸡白