酵母融合菌混菌剂及其液体菌剂的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明主要涉及微生物的菌剂的制备方法，尤其涉及利用轻工食品行业产生的废 水发酵制备酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌五菌组合的液体 菌剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 我国每年约有20亿立方的高浓度有机废水排放，占全国工业废水排放量的6%，因 为这些高浓度有机废水分布广泛而水量又大，特别在西北甘肃定西市是盛产马铃薯的地 区，马铃薯淀粉加工企业约有30余家，每年约有500余万立方的高浓有机淀粉废水在排放， 这些马铃薯淀粉废水中含有高浓度的有机物(⑶!^在 100001118凡以上），这些高浓度废水在 夏、秋天极易滋生蚊蝇，产生恶臭气体对当地的生态环境造成严重污染和影响，虽然这些马 铃薯淀粉加工企业也在多方寻找治污措施，但由于存在治污设备投资大，废水处理成本高， 处理效果不理想等原因，所以治污难题已严重影响这些企业的正常生产。马铃薯的生产是 定西市干旱地区的支柱产业，深加工制做马铃薯淀粉也是这些地区脱贫致富的主要手段。 其实这些马铃薯淀粉有机废水中含有丰富的可溶性有机物如蛋白质、氨基酸、有机酸、淀 粉、糖分、有机盐和维生素等，这些营养物质却是发酵培养有益微生物的好原料，一方面我 们利用这些马铃薯淀粉有机废水培养和制备了有益微生物液体混菌剂产品，该菌剂产品能 广泛用于农业种植、禽畜养殖、有机生物堆肥发酵接种剂、改良土壤和环境治理等方面，并 已取得了较好的作用和效果；另一方面也解决了这些马铃薯淀粉食品加工企业的治污难 题，是一举多得生物技术。
[0003] 传统的微生物液体菌剂的制备方法，所用的培养基原料是葡萄糖、蛋白胨、糖蜜、 牛肉膏、维生素，无机盐和水配制成液体培养基，从试管斜面菌种上刮取菌苔再转种在液体 培养基中，经好氧或厌氧培养而制备成液体菌剂，其缺点是:所用原料成本高，生产工艺复 杂，不能节约能源。
[0004] 混合菌剂传统做法，是将各种不同的菌种(好氧和厌氧)在各自不同的培养基中培 养菌种，然后再从每个菌种的培养物中刮取菌苔制取各个菌的液体菌悬液，再转种于各自 的液体培养液经通气或厌氧发酵培养后离心制取活性细胞菌沉淀物，将各自沉淀物经喷雾 干燥制成粉剂，按不同比例制成不同菌的组合混合剂。其缺点是：制备工艺复杂，发酵周期 长，成本高，应用受到限制。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于避免现有微生物液体菌剂生产技术不足之处而提供一种酵母 融合菌混菌剂。它包括有酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌液 体菌剂。
[0006] 本发明的又一目的在于提供一种酵母融合菌混菌液体菌剂的制备方法。使用酵母 融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌根霉菌和嗜酸乳杆菌配伍，以新鲜豆腐或粉丝或玉米或 马铃薯淀粉产生的废水为原料，添加少量的红糖无机盐经发酵制备酵母融合菌、地衣芽孢 杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌的液体菌剂。
[0007] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为:一种酵母融合菌混菌剂，其特征在于 包括有酉孝母融合菌（Fusant between Candida tropicalisand Saccharmycescevisiae) F105，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址为:北京市朝 阳区北辰西路号院3号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为 CGMCC N0.10263;地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)B-36购自中国农业微生物菌种 保藏中心编号为六(：(^11080;圆褐固氣菌(六2〇1：(^&(^61'(3]11'〇〇(3〇(311111)11^-09，保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为:北京市朝阳区北辰西路号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏时间为2010年4月26日，保藏编号为CGMCC N0.3768;根霉 菌(他丨20卩118)1?和嗜酸乳杆菌(1^〇1：(^&〇；[1^118-&(^(10卩11；[111111)1^两菌种均为市场公开销售菌 种，其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%，地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌 数的15-30%，圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%，根霉菌的活菌数为总活菌数的 15-30%，嗜酸乳杆菌的活菌数为总活菌数的15-35%。
[0008] 所述的酵母融合菌混菌剂，还包括有发酵淀粉废水为玉米、豆类、小麦、大麦、薯类 农产品加工生产淀粉时所产生的废水或豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或马铃薯淀 粉废水，废水有机物C0D CT为10000-50000mg/L。
[0009] 所述的酵母融合菌混菌剂，所述的酵母融合菌的制备有如下步骤:将酒精酵母菌 作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使 用1 %的纤维素酶和1 %蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33°C，得到酒精酵母原生 质体;将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2.5小 时，温度33°C，得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经0.1 %碘乙酸灭活， 与酒精酵母原生质体以1:1混合，将沉淀悬于35%聚乙二醇的促溶剂中，30°C水浴静止处 理，pH6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高渗基础培养基和 高渗完全培养基平板培养基上，经30°C、7天培养，平板生长出酵母融合菌。
[0010] 所述的酵母融合菌混菌剂，所述的圆褐固氮菌的制备有如下步骤：
[0011] (1)采样：圆褐固氮菌是从兰州市南北两区地区的暗灰钙土，淡灰钙土，红泥土和 碱土的四种不同土壤类型和多个植物根区的CKlOcm、10-20cm、20-30cm 土壤深度的266份土 样；
[0012] (2)分离培养:取10g新鲜土样加入盛有100ml无菌水的500ml三角烧瓶中，放摇床 上振荡l〇min使土样均勾地分散在稀释液中成为土壤悬液，吸取lml上清液加到9ml无菌水 中，按10倍法依次稀释至1〇_ 4-1〇_6,各重复四次;在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝 (Ashby)的固体琼脂培养基，待凝固后用移液枪吸取100ul 土壤稀释液加到培养基表面，然 后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀；用相同的方法将样本不同稀释度的稀释液从高稀释度 到低稀释度依法涂抹;将接种稀释的培养皿倒置放在28-32°C恒温培养箱内培养2-3d后取 出，挑取具有特征性的水溶性褐色色素，光滑凸起的圆褐固氮菌菌落，转种在阿须贝琼脂斜 面试管培养基上，经28-32°C恒温培养2-3d，取出后即为圆褐固氮菌母钟，保存在4-8°C冰箱 内备用；
[0013] (3)诱变：将母种再经紫外线（30s)，亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴 定，最后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上，即得保藏菌种。
[0014] -种酵母融合菌混菌液体菌剂的制备方法，其主要特点在于有如下步骤：
[0015] A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
[0016] a.酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备：
[0017] 酵母膏0.5-2 %、葡萄糖0.5-2 %、蛋白胨0.2-0.6 %、琼脂粉1-3 %、无菌水80-120ml，加热溶解后用1 %的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114°C，30-35分钟蒸汽灭菌， 然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
[0018] b.地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备：
[0019] 蛋白胨含量重量百分比为0.25-1 %，氯化钠的含量重量百分比为0.25-1 %，牛肉 膏的含量重量百分比为0.2-0.5%，琼脂粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，该培 养基的PH为6.5-7.5;
[0020] c.圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备：
[0021] 甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2%，碳酸|丐的含量重量百分比为0.2-0.8%， 磷酸二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%，硫酸镁(含七个结晶水）的含量重量百分比 为0.01-0.03%，氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03 %，硫酸钙(含两个结晶水）的含量 重量百分比为0.005-0.015%，琼脂粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，所述培养 基的 PH 为 6.8-7.0;
[0022] d.根霉菌马铃薯-蔗糖(PDA)琼脂斜面培养基的制备：
[0023] 马铃薯的含量重量百分比为15-25%，蔗糖的含量重量百分比为1.5-2.5%，琼脂 粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，所述培养基的PH为5.5-6.5;