液加到9ml无菌水 中，按10倍法依次稀释至1〇_4-1〇_6,各重复四次;在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝 (Ashby)的固体琼脂培养基，待凝固后用移液枪吸取100ul 土壤稀释液加到培养基表面，然 后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀；用相同的方法将样本不同稀释度的稀释液从高稀释度 到低稀释度依法涂抹;将接种稀释的培养皿倒置放在28-32°C恒温培养箱内培养2-3d后取 出，挑取具有特征性的水溶性褐色色素，光滑凸起的圆褐固氮菌菌落，转种在阿须贝琼脂斜 面试管培养基上，经28-32°C恒温培养2-3d，取出后即为圆褐固氮菌母钟，保存在4-8°C冰箱 内备用；
[0045] (3)诱变：将母种再经紫外线（30s)，亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴 定，最后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上，即得保藏菌种。
[0046] 实施例5:-种酵母融合菌混菌液体菌剂的制备方法，其主要特点在于有如下步 骤：
[0047] A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养：
[0048] a.酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备：
[0049] 酵母膏0.5-2 %、葡萄糖0.5-2 %、蛋白胨0.2-0.6 %、琼脂粉1-3 %、无菌水80-120ml，加热溶解后用1 %的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114°C，30-35分钟蒸汽灭菌， 然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用；
[0050] b.地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备：
[00511蛋白胨含量重量百分比为0.25-1 %，氯化钠的含量重量百分比为0.25-1 %，牛肉 膏的含量重量百分比为0.2-0.5%，琼脂粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，该培 养基的PH为6.5-7.5;
[0052 ] c.圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备：
[0053] 甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2 %，碳酸钙的含量重量百分比为0.2-0.8%， 磷酸二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%，硫酸镁(含七个结晶水）的含量重量百分比 为0.01-0.03%，氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03 %，硫酸钙(含两个结晶水）的含量 重量百分比为0.005-0.015%，琼脂粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，所述培养 基的 PH 为 6.8-7.0;
[0054] d.根霉菌马铃薯-蔗糖(PDA)琼脂斜面培养基的制备：
[0055] 马铃薯的含量重量百分比为15-25%，蔗糖的含量重量百分比为1.5-2.5%，琼脂 粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，所述培养基的PH为5.5-6.5;
[0056] e嗜酸乳杆菌琼脂斜面培养的制备：
[0057] 番茄酵母吐温-80醋酸盐培养基：蛋白胨的含量重量百分比0.8-1.2，牛肉膏的含 量重量百分比〇 .8-1.2,葡萄糖的含量重量百分比0.8-1.2,酵母霄的含量重量百分比0.8-1.2，番前汁的加量重量百分比15-20毫升，吐温-80的含量重量百分比0.03-0.07毫升，琼脂 含量重量百分比1.8-2.2，另加醋酸缓冲液(PH5.4)含量重量百分比0.03-0.06mol，分别用 58.84Kpa，15分钟灭菌，用时混合；
[0058]对以上酵母融合菌，地衣芽孢杆菌，圆褐固氮菌，根霉菌和嗜酸乳杆菌五种菌，分 别取母钟转种各自制备的琼脂试管斜面培养基上，培养为一级菌种；
[0059] B液体培养基及液体菌种的制备
[0060] a液体培养基的制备：在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或马铃薯 淀粉废水中加入红糖l_2g，硫酸铵l_2g，碳酸钙l-2g，磷酸0.5-lml，用1 %石灰水调PH6.2-7.5，分装于5001111三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4，然后经110-112°(3,30-35分钟高压 灭菌，冷却后备用；
[0061] b分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌的一级菌 种，在无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中，经28-32°C，24-72h静置培养。其培养 菌液为二级菌种；
[0062] c分别将酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌的二级菌 种，在无菌条件下转种于液体三角烧瓶培养基中，上摇床进行震荡培养，振幅100-120转/分 钟，温度28-32°C，时间24-72h，其培养液为三级菌种，根据需要继续可逐级扩大培养；
[0063] d分别将重量百分比为酵母融合菌为25-40%、地衣芽孢杆菌15-30%、圆褐固氮菌 15-30%、根霉菌15-30%、嗜酸乳杆菌15-30%的三级菌种再扩大培养，五种液体菌同时转 种在同一发酵罐中经28-32°C，18-24h通气搅拌发酵培养，其培养液为酵母融合菌混菌剂。 [0064]实施例6:见图1，所述的酵母融合菌混菌发酵豆腐废水制备液体菌剂的方法
[0065] (1)试管液体菌的培养，取新鲜的豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液 100ml，加入红糖0 · lg(NH4)2S〇4〇 · lg，Ca⑶30 · lg，H3P〇4〇 · 05ml，充分溶解后调节PH至6 · 2-7.2，分装于15*1.5cm的干燥试管中，经112°C，30分钟高压灭菌，冷却至32°C，分别接种酵母 融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌于试管液体培养基中，经28-32°C培养24-48小时，即为试管液体菌种(一级菌种）
[0066] (2)三角烧瓶液体菌中的培养
[0067]取新鲜的豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液1000ml，加入红糖lg(NH4) 2S〇4lg，CaC03lg，H3P〇4〇. 5ml，充分溶解后调节PH至6.2-7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装 量为瓶子总量的1/4,经112°C，30分钟高压灭菌，冷却至32°C，将试管液体菌种接种在液体 三角烧杯培养基中，经28-32°C培养24-48小时静置培养，即为液体三角烧杯菌种（二级菌 种）
[0068] (3)液体扩大培养生产菌种
[0069] 取新鲜的豆腐废水经煮沸10分钟自然沉淀取上清液10000ml，加入红糖10g(NH4) 2S〇4lOg，CaC0310g H3P〇45ml，充分溶解后调节PH至6.2-7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装 量为瓶子总量的1/4,经112°C，30分钟高压灭菌，冷却至32°C，将二级菌种接种在液体三角 烧杯培养基中，上摇床震荡培养，振幅为100-120r/min，经温度28-32°C培养18-24小时发酵 培养，其培养液为三级菌种。
[0070] (4)取三级菌种再扩大培养，上发酵罐，所用新鲜豆腐废水不灭菌，将重量百分比 为酵母融合菌为40%、地衣芽孢杆菌为15%，圆褐固氮菌为15%、根霉菌为15%、嗜酸乳杆 菌为15 %五菌培养菌液接入发酵罐后，经28~32°C培养18~24小时，通气搅拌发酵培养，其 发酵液即为酵母融合菌F105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌、嗜酸乳杆菌液体混合菌 剂，活细胞数为〇. 5~1.5x109个/ml;
[0071] (5)根据需要可逐级扩大产量。
[0072]实施例7:见图1，所述的酵母融合菌混菌发酵粉丝废水制备液体菌剂的方法 [0073] (1)试管液体菌种的培养，取新鲜粉丝废水100ml，加入红糖0.1g(NH4) 2S〇4〇.lg， CaC〇3〇. lg，H3PO40.05ml，充分溶解后调节pH至6.2~7.2，分装于15x1.2cm的干燥试管中，经 112°C，30分钟高压灭菌，冷却至32°C，分别接种酵母融合菌T105、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮 菌、根霉菌、嗜酸乳杆菌于试管液体培养基中，经28~32°C培养24~48小时，即为试管液体 菌种(一级菌种）。
[0074] (2)三角烧瓶液体菌种的培养
[0075] 取新鲜粉丝废水1000ml，加入红糖18(顺4)23〇4化{&0)318，!^〇4〇.51111，充分溶解 后调节PH至6.2~7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112°C，30 分钟高压灭菌，冷却至32°C，将试管液体菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，经28~32°C培 养24~48小时，静置培养即为液体三角烧瓶菌种(二级菌种）。
[0076] (3)液体扩大培养生产菌种：
[0077]取新鲜粉丝废水 10000ml，加入红糖 10g(NH4)2S04l0g，CaC0310g，H3P045ml，充分溶 解后调节PH至6.2~7.2，分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子总量的1/4，然后经112°C， 30分钟高压灭菌，冷却至32°C，将二级菌种接种在液体三角烧瓶培养基中，上摇床振荡培 养，振幅为100~120r/min，经温度28~32°C培养