实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种酵母融合菌混菌剂，其特征在于包括有酵母融合菌(FusantbetweenCandida tropicalisandSaccharmycescevisiae)F105，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心保藏，保藏时间为2014年12月30日，保藏编号为CGMCCNO. 10263;地衣芽孢杆菌 (BacillusLicheniformis)B_36购自中国农业微生物菌种保藏中心编号为Acccll080;圆 褐固氮菌(Azotobacterchroococum)LGN_09,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏时间为2010年4月26日，保藏编号为CGMCCNO. 3768;根霉菌(Rhizopus)R 和嗜酸乳杆菌(1^〇1：〇63〇；[1^118-3(^(1〇卩11；[111111)1^两菌种均为市场公开销售菌种，其中所述酵 母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40%，地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30%， 圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30%，根霉菌的活菌数为总活菌数的15-30%，嗜酸 乳杆菌的活菌数为总活菌数的15-35%。2. 如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂，其特征在于还包括有发酵淀粉废水为玉米、 豆类、小麦、大麦、薯类农产品加工生产淀粉时所产生的废水或豆腐废水或粉丝废水或玉米 淀粉废水或马铃薯淀粉废水，废水有机物C0DCT为10000-50000mg/L。3. 如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂，其特征在于所述的酵母融合菌的制备有如 下步骤:将酒精酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培养14小时后，用EDTA-巯 基乙醇进行预处理，使用1 %的纤维素酶和1%蜗牛酶进行酶解脱壁，时间为2小时，温度33 °C，得到酒精酵母原生质体;将热带假丝酵母菌作母种的斜面菌转种和培养，在液体振荡培 养14小时后，用EDTA-巯基乙醇进行预处理，使用1.5%的纤维素酶和0.5%蜗牛酶进行酶解 脱壁，时间为2.5小时，温度33°C，得到热带假丝酵母原生质体;将热带假丝酵母原生质体经 0.1%碘乙酸灭活，与酒精酵母原生质体以1:1混合，将沉淀悬于35%聚乙二醇的促溶剂中， 30°C水浴静止处理，pH6.0，时间为40min，融合菌液经高渗磷酸缓冲液反复冲洗，涂布于高 渗基础培养基和高渗完全培养基平板培养基上，经30°C、7天培养，平板生长出酵母融合菌。4. 如权利要求1所述的酵母融合菌混菌剂，其特征在于所述的圆褐固氮菌的制备有如 下步骤： (1) 采样：圆褐固氮菌是从兰州市南北两区地区的暗灰钙土，淡灰钙土，红泥土和碱土 的四种不同土壤类型和多个植物根区的0-lOcm、10-20cm、20_30cm土壤深度的266份土样； (2) 分离培养:取10g新鲜土样加入盛有100ml无菌水的500ml三角烧瓶中，放摇床上振 荡10min使土样均勾地分散在稀释液中成为土壤悬液，吸取lml上清液加到9ml无菌水中，按 10倍法依次稀释至1〇_4-1〇_6,各重复四次；在已灭菌的培养皿中倾注15-20ml阿须贝 (Ashby)的固体琼脂培养基，待凝固后用移液枪吸取100ul土壤稀释液加到培养基表面，然 后立即用涂布棒将稀释液涂抹均匀；用相同的方法将样本不同稀释度的稀释液从高稀释度 到低稀释度依法涂抹;将接种稀释的培养皿倒置放在28-32°C恒温培养箱内培养2-3d后取 出，挑取具有特征性的水溶性褐色色素，光滑凸起的圆褐固氮菌菌落，转种在阿须贝琼脂斜 面试管培养基上，经28-32°C恒温培养2-3d，取出后即为圆褐固氮菌母钟，保存在4-8°C冰箱 内备用； (3) 诱变:将母种再经紫外线（30s)，亚硝基胍(NTG)诱变处理以及生化形态学鉴定，最 后鉴定获得的菌种转种于阿须贝琼脂斜面试管培养基上，即得保藏菌种。5. -种酵母融合菌混菌液体菌剂的制备方法，其特征在于有如下步骤： A.琼脂斜面培养基的制备及菌种的培养： a. 酵母融合菌酵母膏琼脂斜面培养基的制备： 酵母膏〇. 5-2%、葡萄糖0.5-2 %、蛋白胨0.2-0.6 %、琼脂粉1-3 %、无菌水80-120ml，加 热溶解后用1 %的氢氧化钠调pH值至5.5-6.5，经110-114°C，30-35分钟蒸汽灭菌， 然后在无菌条件下分装于15*1.5cm的干燥灭菌的试管摆成斜面待凝固后备用； b. 地衣芽孢杆菌营养牛肉膏琼脂斜面培养基的制备： 蛋白胨含量重量百分比为〇 . 25-1 %，氯化钠的含量重量百分比为0.25-1 %，牛肉霄的 含量重量百分比为〇. 2-0.5%，琼脂粉的含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，该培养基 的PH为6.5-7.5; c. 圆褐固氮菌阿须贝(Ashby)琼脂斜面培养基的制备： 甘露醇的含量重量百分比为0.8-1.2%，碳酸|丐的含量重量百分比为0.2-0.8%，磷酸 二氢钾的含量重量百分比为0.01-0.03%，硫酸镁（含七个结晶水）的含量重量百分比为 0.01-0.03%，氯化钠的含量重量百分比为0.01-0.03%，硫酸钙(含两个结晶水）的含量重 量百分比为0.005-0.015%，琼脂粉的含量重量百分比为1-3 %，其余为无菌水，所述培养基 的PH为6.8-7.0; d.根霉菌马铃薯-蔗糖(PDA)琼脂斜面培养基的制备： 马铃薯的含量重量百分比为15-25%，鹿糖的含量重量百分比为1.5-2.5%，琼脂粉的 含量重量百分比为1-3%，其余为无菌水，所述培养基的PH为5.5-6.5; e嗜酸乳杆菌琼脂斜面培养的制备： 番茄酵母吐温-80醋酸盐培养基：蛋白胨的含量重量百分比0.8-1.2，牛肉膏的含量重 量百分比〇. 8_1.2,葡萄糖的含量重量百分比0.8_1.2,酵母霄的含量重量百分比0.8-1.2， 番前汁的加量重量百分比15-20毫升，吐温-80的含量重量百分比0.03-0.07毫升，琼脂含量 重量百分比1.8-2.2，另加醋酸缓冲液（PH5.4)含量重量百分比0.03-0.06mol，分别用 58.84Kpa，15分钟灭菌，用时混合； 对以上酵母融合菌，地衣芽孢杆菌，圆褐固氮菌，根霉菌和嗜酸乳杆菌五种菌，分别取 母钟转种各自制备的琼脂试管斜面培养基上，培养为一级菌种； B液体培养基及液体菌种的制备 a液体培养基的制备:在一升新鲜豆腐废水或粉丝废水或玉米淀粉废水或马铃薯淀粉 废水中加入红糖l_2g，硫酸铵l-2g，碳酸钙l-2g，磷酸0.5-lml，用1 %石灰水调PH6.2-7.5， 分装于500ml三角烧瓶中，分装量为瓶子容量的1/4,然后经110-112°C，30-35分钟高压灭 菌，冷却后备用； b分别取酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌的一级菌种，在 无菌条件下分别转种于液体三角烧瓶培养基中，经28-32°C，24-72h静置培养。其培养菌液 为二级菌种； c分别将酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌的二级菌种，在 无菌条件下转种于液体三角烧瓶培养基中，上摇床进行震荡培养，振幅100-120转/分钟，温 度28-32°C时间24-72h，其培养液为三级菌种，根据需要继续可逐级扩大培养； d分别将重量百分比为酵母融合菌为25-40%、地衣芽孢杆菌15-30%、圆褐固氮菌15-30%、根霉菌15-30%、嗜酸乳杆菌15-30%的三级菌种再扩大培养，五种液体菌同时转种在 同一发酵罐中经28-32°C，18-24h通气搅拌发酵培养，其培养液为酵母融合菌混菌剂。
【专利摘要】本发明主要涉及微生物的菌剂的制备方法，尤其涉及利用轻工食品行业产生的废水发酵制备酵母融合菌、地衣芽孢杆菌、圆褐固氮菌、根霉菌和嗜酸乳杆菌五菌组合的液体菌剂的制备方法。一种酵母融合菌混菌剂，其主要特点在于包括有酵母融合菌F105；地衣芽孢杆菌；圆褐固氮菌；根霉菌R和嗜酸乳杆菌L两菌种均为市场公开销售菌种，其中所述酵母融合菌的活菌数为总活菌数的25-40％，地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15-30％，圆褐固氮菌的活菌数为总活菌数的15-30％，根霉菌的活菌数为总活菌数的15-30％，嗜酸乳杆菌的活菌数为总活菌数的15-35％。CGMCC NO.1026320141230
【IPC分类】C12R1/645, C12N1/20, C12R1/74, C12N1/02, C12R1/065, C12R1/865, C12R1/845, C12N13/00, C12N15/04, C12R1/10, C12N1/14, C12N1/19, C12R1/23
【公开号】CN105483047
【申请号】CN201511025145
【发明人】孙荣高, 代积文, 代凤雷, 曾学平, 高小青
【申请人】甘肃长业生态生物科技集团有限公司
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月30日