专利名称：一种硫酸化丝素蛋白的新制备方法
技术领域：
本发明涉及一种在不使用有机溶剂的条件下制备硫酸化丝素蛋白的新方法。
背景技术：
血栓疾病是最常见的心脑血管疾病，严重威胁人类的的健康。我国资料表明，脑血 管病是心脏病的第一大死因，每15秒钟就一个人被心脑血管病夺去生命。因此我们应对血 栓疾病有足够的重视。目前血栓疾病的治疗主要是抗血小板治疗(阿司匹林、ADP受体拮 抗体)和抗凝治疗(普通肝素、低分子肝素)。 抗凝血药是一类干扰抗凝因子药物，可以阻止血液凝固。肝素是一类天然的抗凝 血物质，大量存在于动物器官和组织(如小肠和肝脏)，具有起效迅速，在体内外均有抗凝 的作用，但是长期使用会引起出血、导致血小板减少或骨质疏松并发症。而且肝素类药物价 格昂贵，从而限制了它的应用。 丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然的蛋白质。通过生物体整体、细胞和分子生物学3 个水平的实验研究结果表明它应用在人体是安全的。另外，丝素蛋白具有良好的生物相容 性，而且原料来源很丰富，在湿态下力学性能良好、体内容易降解、降解产物无毒。同时丝素 蛋白还具有良好的透氧、透气等许多独特的物理化学性质，易应用于生物医药领域。现已广 泛应用于药物缓释载体，人造皮肤，抗凝血物质等生物材料上。 丝素蛋白中含有许多由6种氨基酸残基交替排列的结构 (Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser-)，其中Ser之间的距离，与肝磷脂中有抗凝血作用的重要基 团硫酸基的距离十分相近，故若能在Ser中引入硫酸基，也能制造出类似肝磷脂的结构，则 可赋予丝素以抗凝血作用。硫酸化丝素蛋白除了有抗凝血作用外还有抗艾滋病作用。由日 本农业生物资源研究所的昆虫新素材开发研究室玉田靖等的研究发现，硫酸化丝素蛋白具 有阻止病毒与免疫细胞表面蛋白质相结合的功能。用丝素制备的硫酸化丝素蛋白具有成本 低，安全性高的特点，是一种很有前途的抗凝血药和抗艾滋病药剂。 关于制备硫酸化丝素蛋白，国内报道的有苏州大学的尹桂波从蚕丝中经脱胶提取 丝素蛋白，用氯磺酸在吡啶中加热反应，得到硫酸化的丝素蛋白。(国外丝绸，2004， (2); 16)。这种方法由于用到了有机溶剂吡啶，而残留的吡啶等有机溶剂将会对其在食品或药 品中的应用产生不利影响。还有浙江中医药大学的楼兰花等申请的中国专利(公开号CN 101029079A)提出了用氯磺酸-惰性溶剂的方法来制备硫酸化丝素蛋白，此方法用到了有 机强酸氯磺酸，反应比较剧烈；该反应中使用了二氯乙烷、二氯甲烷、氯仿、二甲基甲酰胺、 二甲亚砜等惰性溶剂中的一种或几种，这样反应产物中残留的有机溶剂会影响硫酸化丝素 蛋白安全性；另外此反应是在氮气或干燥剂保护条件下发生的，反应条件比较苛刻。
国外有关丝素蛋白制备硫酸化丝素蛋白抗凝血的研究，Yasushi Tamada等从 蚕丝或蚕茧中经脱胶提取丝素蛋白，用硫酸来进行硫酸化反应，得到硫酸化的丝素蛋白。 (Sulfation of silk fibroin by sulfuric acid and anticoagulantactivity. [J]， Journal of Applied Polymer Science, 2003， 2377-2382) 。YasushiTamada还有从蚕丝或蚕
3茧中经脱胶提取丝素蛋白，用氯磺酸在吡啶中加热反应，得到硫酸化丝素蛋白。(Sulfation of silk fibroin by chlorosulfonic acid andthe anticoagulant activity. [J]， Biomaterials 25，2004，377—383)。 总之，当前硫酸化丝素蛋白的制备过程中，普遍使用吡啶等有毒有机溶剂，这样残 留的试剂可能会影响其应用。此外，使用氯磺酸，浓硫酸等强酸使反应激烈，不易控制，而且 会对环境造成影响。
发明内容
本发明的目的是针对目前国内存在的问题和不足，利用原料丰富的蚕丝或蚕茧， 提出了一种在完全不使用有机溶剂的条件下制备硫酸化丝素蛋白的新方法。该方法工艺流 程简单、生产成本低、容易实现工业化生产、无环境污染。与其他硫酸化方法不同，在此制备 技术中，一个最具吸引力的特点就是采用干燥加热的方式来实现丝素蛋白的硫酸化。
为实现上述目的，本发明的硫酸化丝素蛋白的制备方法，主要包括以下内容
(1)蚕茧壳或废蚕丝用浓度为0. 5%的脱胶剂进行脱胶处理，得到丝素蛋白。
(2)丝素蛋白经过盐处理得到水溶性丝素蛋白。
(3)把丝素蛋白溶解于水中，加入硫酸氢盐，调节pH后定容。 (4)冷冻干燥上述溶液后，得到的丝素蛋白-硫酸氢盐混合粉末在50-ll(TC的干 燥加热条件下进行硫酸化反应1-5天。 (5)产物经过透析，冷冻干燥最后得到硫酸化丝素蛋白。 第(1)步所示的丝素是从废蚕茧或废蚕丝中提取的，用质量分数为1-2% (2%最 佳)的蚕丝放入在0. 5% Na2C03煮至沸腾30min，精炼2次，用蒸馏水充分洗涤3次，然后在 8(TC下干燥得到丝素蛋白。 第(2)步制备水溶性丝素蛋白是将脱胶的丝素蛋白投入煮沸的CaCl2溶液中处理 10min。 40% CaCl2的质量浓度为0. 5g/mL，浴比为1 : 20。将处理后得到的溶液灌入最低截 留分子量分别为10kDa的透析袋中，流水透析3d，然后冷冻干燥，可得到水溶性丝素蛋白。
第(3)步-第(4)步将水溶性溶性的丝素蛋白溶解于水中，搅拌30-60min，并在此 溶液中加入硫酸氢盐，调节PH后定容，冷冻干燥上述溶液后，在50-110°C的干燥加热条件 下进行硫酸化反应1-5天。 第(5)步在蒸馏水中透析2-4天，再将透析液冷冻干燥。 上述制备方法中所述的硫酸氢盐为硫酸氢钠，也可以是硫酸氢钾等类似物。 上述制备方法中所述的干燥技术除冷冻干燥之外，如果制备量大时还可用设备是
常规的，技术上众所周知的喷雾干燥等干燥技术。 本发明与现有技术相比，优点如下 1、无污染。本发明中不使用任何有机溶剂，不会对环境造成污染。 2、本发明硫酸酯化试剂是硫酸氢钠，而非以前报道的氯磺酸、浓硫酸等强酸，对环
境危害小。 3、本发明以废蚕丝(落绵)或下脚蚕茧为原料制备硫酸化丝素蛋白，一方面可以 充分利用纺织工业中的废丝下脚料，另一方面可以降低生产成本。此外，该硫酸化丝素蛋白 制备所用的试剂均为常见试剂，价格低廉，操作简单，对生产设备要求不高，生产成本低，容易实现工业化生产。 4、反应条件(反应温度、pH、加热时间)可控。 5、意义深远。本发明中的硫酸化丝素蛋白除了有很好的抗凝血活性，另外对开发 抗癌、抗艾滋病、抗血栓等药物具有深远的意义。
图1是丝素蛋白和硫酸化丝素蛋白的红外光谱比较图。a，丝素蛋白；b，硫酸化丝 素蛋白。
具体实施例方式
下面结合实例，对本发明进行进一步的阐述。
实施例1 硫酸化丝素蛋白的制备0. 5g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。透 析完毕后，加入NaHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在 50°C的干燥加热条件下进行硫酸化反应1天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与水 中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。所 得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测定 硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为2. 90%。
实施例2 硫酸化丝素蛋白的制备0. 5g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。透 析完毕后，加入NaHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在 80°C的干燥加热条件下进行硫酸化反应1天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与水 中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。所 得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测定 硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为2. 60%。
实施例3 硫酸化丝素蛋白的制备0. 5g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。透 析完毕后，加入NaHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在 IO(TC的干燥加热条件下进行硫酸化反应1天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与 水中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。 所得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测 定硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为6. 90%。
实施例4 硫酸化丝素蛋白的制备1. 0g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。 透析完毕后，加入KHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在IO(TC的干燥加热条件下进行硫酸化反应1天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与 水中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。 所得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测 定硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为7. 10%。
实施例5 硫酸化丝素蛋白的制备1. 0g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。透 析完毕后，加入NaHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在 IO(TC的干燥加热条件下进行硫酸化反应2天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与 水中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。 所得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测 定硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为8. 10%。
实施例6 硫酸化丝素蛋白的制备1. 0g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。透 析完毕后，加入NaHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在 IO(TC的干燥加热条件下进行硫酸化反应3天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与 水中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。 所得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测 定硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为6. 50%。
实施例7 硫酸化丝素蛋白的制备1. 0g的丝素蛋白加入沸腾的40%的CaCl2溶液中，加热 2-5min至丝素蛋白溶解。迅速冷却，进行离心，除去不溶物。上清液在流水中进行透析。透 析完毕后，加入NaHS04，用NaOH调节pH ;冷冻干燥上述丝素蛋白_硫酸氢纳混合溶液；在 IO(TC的干燥加热条件下进行硫酸化反应5天，反应结束后，把丝素蛋白-硫酸氢纳溶解与 水中并在流水中透析2天以除去未反应的硫酸氢盐，最后冷冻干燥得到硫酸化丝素蛋白。 所得的硫酸化丝素蛋白经红外光谱(IR)分析，在618cm—工处可观察到SS03振动峰；通过测 定硫酸化丝素蛋白的硫酸根含量为4. 30%。 最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限 于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接 导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
一种硫酸化丝素蛋白的新制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)将废蚕茧和废蚕丝经过脱胶剂进行脱胶得到丝素蛋白；(2)丝素蛋白经过盐处理得到水溶性丝蛋白；(3)将水溶性丝素蛋白溶解于水中，搅拌30-60min，并在此溶液中加入硫酸氢盐溶液，调节pH后定容；(4)冷冻干燥上述溶液后，在50-110℃的干燥加热条件下进行硫酸化反应1-5天；(5)反应产物经过透析、冷冻干燥后得到硫酸化丝素蛋白。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(1)中，脱胶剂为N C(V
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(2)中，用CaC^来进行盐处理。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(3)中，丝素蛋白的硫酸化反应是在硫酸氢钠或其类似物存在时发生。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(3)中，丝素蛋白的硫酸化反应是在干燥加热的条件下发生。
6. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(3)中，丝素蛋白的硫酸化反应温度是50-1 l(TC
7. 如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(3)中，丝素蛋白的硫酸化反应时间是1-5天。
全文摘要
本发明公开了一种硫酸化丝素蛋白的新制备方法。具体就是包括将丝素蛋白溶于含有硫酸氢盐的溶液；调节pH后冷冻干燥；把冷冻干燥后的硫酸氢盐-丝素蛋白混合物在干燥条件下加热1-5天进行硫酸化反应；透析、冷冻干燥后得到硫酸化丝素蛋白等步骤。本发明的优点为制备过程中完全不使用有机溶剂，硫酸化产物安全且可避免环境污染；工艺流程简单，条件可控，生产成本低，易于实现工业化生产；本发明中的硫酸化丝素蛋白可应用在抗凝血药物上，具有显著的抗凝血、抗血栓活性。在抗凝血、抗癌活性，对开发抗凝血材料等生物材料有重要的意义。
文档编号A61K38/16GK101704876SQ20091021824
公开日2010年5月12日 申请日期2009年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者张媛圆, 成伟华, 李灿鹏, 赵卉 申请人:云南大学