靶向硫酸软骨素聚糖的制作方法

靶向硫酸软骨素聚糖的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含VAR2CSA最小结合片段的功能结合片段,涉及针对这种VAR2CSA结合片段的抗体、编码这种VAR2CSA片段的核酸，以及用于生产其的方法。本发明进一步涉及包含所述最小结合片段的VAR2CSA多肽的缀合物和融合蛋白及其用途，尤其是用于与硫酸软骨素A(CSA)的表达如硫酸软骨素A(CSA)的不适当表达相关的病症的治疗的用途。
【专利说明】靶向硫酸软骨素聚糖发明领域
[0001]本发明涉及包含VAR2CSA最小结合片段的功能结合片段，涉及针对这种VAR2CSA结合片段的抗体、编码这种VAR2CSA片段的核酸，以及用于生产其的方法。本发明进一步涉及包含所述最小结合片段的VAR2CSA多肽的缀合物和融合蛋白及其用途，尤其是用于与硫酸软骨素A(CSA)的表达、如硫酸软骨素A(CSA)的不适当表达相关的病症的治疗的用途。
[0002]发明背景
[0003]蛋白聚糖是与一个或多个糖胺聚糖(GAG)链缀合的蛋白质。这些蛋白质分布在细胞内部、细胞膜上和细胞外基质中，起到多种作用:软骨基质的形成；组织的结构构成；基底膜的构成；调节分泌小泡的作用；结合细胞因子、趋化因子、生长因子、和形态发生素(morphogen);蛋白酶受体和蛋白酶抑制剂；共同受体，酪氨酸激酶型生长因子受体；作为内吞受体(endocytic receptor);促进细胞附着、细胞_细胞相互作用、和细胞运动性以及细胞迁移。
[0004]痕疾寄生物恶性痕原虫(Plasmodium falciparum)在其复杂生命周期的几乎所有阶段中利用宿主细胞蛋白聚糖。子孢子(sporozoite)通过与高度硫酸化的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)相互作用的表面表达的环子孢子蛋白(circumsporozoite protein)感染肝脏中的肝细胞。红细胞的裂殖子(merozoite)感染是由与血型糖蛋白A上的唾液酸结合的EBA-175介导的。此外，介导宿主内皮粘附的许多恶性疟原虫红细胞膜蛋白I(PfEMPl)蛋白已经被描述为结合聚糖的。这些中的一种是VAR2CSA，其为PfEMPl蛋白家族中的独特成员。VAR2CSA以高亲和力结合不常见的、低硫酸化形式的硫酸软骨素A(CSA)，其在胎盘绒毛间隙中附着至蛋白聚糖，所谓的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)。VAR2CSA是在恶性疟原虫(P.falciparum)感染的红细胞上(IEs)的表面上表达的大型多结构域蛋白(350kDa)，并且VAR2CSA-CSA相互作用是造成胎盘疟疾(placental malaria, PM)中胎盘特异性隔离(placenta specific sequestrat1n)的原因。重要的是，来自FCR3和3D7型寄生物的重组全长VAR2CSA胞外结构域(ecto-domain)已经显示出对在低纳摩尔范围内的CSA的亲和力。
[0005]CSA属于糖胺聚糖(GAG)家族，其为附着至蛋白聚糖的、交替的氨基糖和己糖醛酸残基的直链聚合物。存在多种类型的GAG，包括:硫酸软骨素(CS)、硫酸皮肤素(DS或CSB)、硫酸乙酰肝素(HS)和肝素。尽管这些GAG的多糖骨架简单，但是仍在修饰如硫酸化和糖醛酸盐(酯)差向异构中出现大量的差异。这是不同GAG的结构域结构和生物活性广泛多样的基础。
[0006]CS与许多重要的因子如生长激素、细胞因子、趋化因子、和粘附分子相互作用，并且被认为参与结构稳定化、胞质分裂、细胞增殖、分化、细胞迁移、组织形态发生、器官发生、感染、和创伤修复。CS链由N-乙酰基-D-半乳糖胺(GalNAc)和葡萄糖醛酸残基的交替单元组成。葡萄糖醛酸可以在其C2位置硫酸化并且GalNAc可以在C4和/或C6硫酸化，得到多种二糖单元。糖骨架的不同修饰允许CS链的结构和功能异质性。粘附胎盘的恶性疟原虫寄生物与仅在GalNAc的C4硫酸化的低硫酸化CSA特别相关。
[0007]早期的研究指出CSA是造成胎盘中IE隔离的原因。然而特异性受体是未知的。经过进一步研究，发现人类胎盘含有三种不同类型的硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)，但是IE与绒毛间隙中低硫酸化CSPG特异性粘附。对于这种类型的CSPG，特殊的是，仅2-8%的二糖单元是C4硫酸化的。在同时进行的旨在确定对CSA的特异性结构要求的研究中，发现利用含有30-50%之间的C4硫酸化而其余50-70%二糖单元未硫酸化的CSA抑制了寄生物粘附至CSPG。显示对CSA的最小结合抑制要求是含有最少2-3或4-5个C4硫酸化的二糖单元的十二糖(六个二糖)。
[0008]硫酸软骨素蛋白聚糖4 (CSPG4)，也被称为高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)或黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MSCP)，是已经显示由黑素瘤细胞表达的细胞表面蛋白聚糖。
[0009]CSPG4/MSCP/HMV-MAA是大型蛋白聚糖，其特征在于在蛋白骨架上具有CS链。这些CS链的硫酸化似乎主要在GalNAc (CSA)的C4上，尽管硫酸化程度是未知的。
[0010]发明目的
[0011]本发明的实施方案的一个目的是，提供适用于硫酸软骨素聚糖的靶向和/或检测的VAR2CSA最小功能结合片段。本发明的实施方案的其他目的是，提供用于治疗与硫酸软骨素聚糖(如CSA)的表达、如不适当表达相关的病症的方法，其中VAR2CSA多肽或其片段单独或作为缀合物或融合蛋白质的一部分用于靶向和/或检测具有硫酸软骨素聚糖的表达、如不适当表达的组织或细胞。
[0012]发明概述
[0013]本发明的发明人已经发现，VAR2CSA利用多肽序列的最小结构元件保持其以高亲和力和特异性结合某些硫酸软骨素蛋白聚糖的能力。更重要的是，本发明的发明人已经发现，VAR2CSA多肽以高且特异性的亲和力结合癌细胞和组织，本发明的发明人提示这种结合借助于与在癌细胞的表面上或周围的细胞外基质中的硫酸软骨素蛋白聚糖特异性相互作用。因此，本发明的发明人建议将这种特异性和高亲和力的结合用于靶向具有这种具体类型硫酸软骨素蛋白聚糖的高的或其他的表达、如不适当表达的癌细胞或者其他组织或细胞。
[0014]因此，在第一方面中，本发明涉及一种VAR2CSA的分离的蛋白片段，所述片段由以下连续的(sequential)氨基酸序列组成:
[0015]a) IDl 和
[0016]b)DBL2Xb，以及任选的
[0017]c)ID2a。
[0018]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA的分离的蛋白片段包含ID2a。
[0019]在第二方面中，本发明涉及一种抗体，所述抗体特异性结合VAR2CSA蛋白片段，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb、以及任选地c) ID2a的连续的氨基酸序列组成。在一些实施方案中，根据本发明的抗体不结合全长VAR2CSA多肽。
[0020]在第三方面中，本发明涉及编码VAR2CSA蛋白片段的核酸分子，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb、以及任选地c) ID2a的连续氨基酸序列组成。本发明进一步涉及一种核酸探针，所述核酸探针能够在严格条件下与这种核酸序列杂交。
[0021]在进一步的方面中，本发明涉及一种载体，所述载体包含根据本发明的分离的核酸分子。
[0022]在进一步的方面中，本发明涉及一种包含载体的宿主细胞，所述载体包含根据本发明的分尚的核酸分子。
[0023]在进一步的方面中，本发明涉及一种用于制备根据本发明的蛋白片段的方法，所述方法包括在允许多核苷酸构建体表达的条件下在适当的生长培养基中培养如在本文中所定义的细胞，以及从所述培养基回收得到的蛋白片段。
[0024]在进一步的方面中，本发明涉及一种缀合物或融合蛋白，其包含VAR2CSA多肽和治疗或诊断效应部分，如细胞毒性部分、萤光标记、和/或放射性标记。
[0025]应该理解的是，对于包含VAR2CSA多肽的缀合物、融合或嵌合蛋白来说，可以使用任何如在本文中限定的VAR2CSA多肽。因此，该方面不限于使用最小结合片段。无论何时使用术语VAR2CSA多肽都适用，当用于医学治疗、靶向或诊断时，因此是同等相关的。
[0026]在进一步的方面中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的抗体、或根据本发明的缀合物。
[0027]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的抗体、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物，其用作药物或诊断剂。
[0028]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的抗体、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物，其用于诊断。
[0029]在进一步的方面中，本发明涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物。
[0030]在进一步的方面中，本发明涉及一种用于在生物样品中检测如在本文中所定义的蛋白片段、或根据本发明的缀合物的方法，所述方法包括:a)获得生物样品；b)使所述生物样品与根据本发明的抗体接触；以及c)检测所述抗体与所述蛋白片段或缀合物的复合物，如果存在的话；作为所述样品中存在所述蛋白片段或缀合物的指示。
[0031]因此，提供用于测量生物样品中VAR2CSA蛋白片段的水平的方法。可以将其作为治疗的一部分、用于监视治疗的进度、或者备选地作为制备根据本发明的VAR2CSA多肽的制备方法的一部分而使用和应用。
[0032]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物用于制备药物的用途。
[0033]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物，用于治疗与涉及CSA的表达、如不适当表达的病症相关的任何适应证，如在癌症、关节炎、关节病、多发性硬化、神经损伤后的愈合、软骨修复、伤口愈合中，以及在银屑病中。
[0034]在进一步的方面中，本发明涉及一种用于治疗与CSA的表达、如不适当表达相关的任何适应证的方法，如在癌症、关节炎、关节病、多发性硬化、由神经损伤导致的病理病症、软骨和疤痕组织的病症中，如在风湿病、软骨修复或伤口愈合中，或者在银屑病中；所述方法包括向需要其的受试者施用治疗上或预防上有效量的如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物。
[0035]在进一步的方面中，本发明涉及一种用于预防与CSA的表达、如不适当表达相关的适应证或病症的发生的方法，如在癌症、多发性硬化、关节炎、关节病、由神经损伤导致的病理病症、软骨和疤痕组织的病症中，如在风湿病、软骨修复或伤口愈合中，或者在银屑病中；所述方法包括向需要其的受试者施用治疗上或预防上有效量的如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物。
[0036]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物的用途，所述用途是在体液如血液、血浆、尿液、唾液、粪便、脑脊液、淋巴液、胃液、胸膜液、软骨液、精子，和/或组织中作为生物标记物，如用于检测CSA的表达、如不适当表达的工具，用于与CSA的表达、如不适当表达相关的适应证或病症的诊断和/或预后，如恶性疾病、关节炎、关节病、由神经损伤导致的病理病症、软骨和疤痕组织的病症中，如在风湿病或伤口愈合中，或者癌症疾病，如脑肿瘤、肝肿瘤和生殖道中的肿瘤。
[0037]应该理解的是，如在本文中所使用的，术语生物标记物意指，当被引入至生物体中以检测CSA表达时，根据本发明的VAR2CSA多肽、缀合物和融合蛋白作为用于与CSA的表达、如CSA的不适当表达相关的适应证或病症的诊断和/或预后的工具的用途。
[0038]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物的用途，所述用途是用于受试者的免疫，如在疫苗中。
[0039]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物的用途，所述用途是作为靶向部分，用于分离表达⑶44和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的细胞。
[0040]表1.由VAR2CSA多肽靶向的潜在分子
[0041]蛋白IDl蛋白ID2基因名称
NG2CSPG4cspg4
神经聚糖(neurogl^can)和神经 CSPG5ngc
聚糖-C_'___
神经菌毛蛋白(neuropilin)-l NRP-1-CSNRPl
CS___
APLP2和APP(并且当加入淀粉样前体状蛋白2APLP2
CSA时蛋白被称为硫酸软骨素蛋白聚糖(Appicans))___
SnoreSnorc
Tom?rc}iulii1-2TENB2TMEFF2
血栓调节蛋白 CD141 THBD(Ihrombon1diilin)___
β聚糖转化生长因子β受体IIITGFBR3
多配体蛋白聚糖(syndecan)lCDI38SDCl
多配体蛋白聚糖2CD362SDC2
多配体蛋白聚糖3SDC3
多配体蛋白聚糖4双栖蛋白聚糖(amphiglycan)SDC4
CSPG8CSPG8Cd44
磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC1-6
(glvpican)l-6(kun I og 5)___
短蛋白聚糖(brevican)CSPG7
润滑素(Iubricin)蛋白聚糖4PRG4
牙本质基质蛋白(dentin matrixDMPI
protein)!___
神经蛋白聚糖(neurocan)CSPG3iican
多功能蛋白聚糖(versican)CSPG2vcan
软骨蛋白聚糖(aggrecan)CSPGlacan
BainccanCSPG6smc3
SRPX2含Sushi重复的蛋白SRPX2
丝甘蛋白聚糖(serglycin)造血蛋白聚糖核心蛋白SRGN
核心蛋白聚糖(decorm)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家^ ^dcn
__m__
双糖链蛋白聚糖(biglycan) 小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家 bgn
__M__
基膜蛋白聚糖(Iumican)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家^ ^Ium
__M__
纤调蛋白(fibromoduliii)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家 fmod
__M__
角蛋白聚糖(keratocan)小亮氨酸富集蛋白聚糖(SLRP)家^ ^kera
__^__
Mimecan骨甘蛋白聚糖(osteoglycin)Ogn
[0042] 睾丸蛋白聚糖(teStiCan)l-3 细胞外钙结合蛋白质的SPOCKl
__BM-40/SPARC/骨结合素家族__
磷酸蛋白聚糖(phosphacan) 受体型酪氨酸酪氨酸蛋白磷酸酶PTPRZI
__ζ__
Leprecan亮氨酸脯氨酸富集蛋白聚糖i LEPREI
基底膜蛋白聚糖(perlecan) 基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白HSPG2 _聚糖核心蛋白__
[0043]在进一步的方面中，本发明涉及一种用于分离生物样品中表达⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的细胞如癌症干细胞的方法，所述方法包括:
[0044]a)获得包含表达⑶44、和/或CSPG4和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的细胞的生物样品；
[0045]b)使所述生物样品与任选地与固体支持物偶联的如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物接触；以及
[0046]c)纯化或分离所述表达⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的细胞与所述蛋白片段或缀合物的复合物。
[0047]在进一步的方面中，本发明涉及一种诊断方法，所述诊断方法用于检测对恶性疾病(malignancy)或与不适当的CSA表达相关的其他病症做出反应的体液如血液、血楽；、尿液、脊髓液、胸腔积液、关节液、骨髓、胃液、粪便、精液、精子、前列腺液、唾液、眼液、肺吸出物、和淋巴液中升高的CSA水平，所述方法包括下列步骤:使所述体液与如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物接触，以及检测与所述体液中CSA形成的复合物。
[0048]在进一步的方面中，本发明涉及一种用于纯化生物样品中⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的方法，所述方法包括:
[0049]a)获得包含⑶44、和/或CSPG4和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的生物样品；
[0050]b)使所述生物样品与任选地与固体支持物偶联的如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物接触；以及
[0051]c)纯化或分离所述⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖与所述蛋白片段或缀合物的复合物。
[0052]在进一步的方面中，本发明涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽或缀合物、或根据本发明的药物组合物，其与任何其他适合的抗癌药组合。
[0053]发明详述
[0054]本发明基于以下事实，一部分疟疾蛋白，即通常所说的VAR2CSA，可以与癌症特异性抗原和细胞外CSPG以非常高的特异性和非常高的结合强度结合。
[0055]VAR2CSA介导专门针对附着至孕妇胎盘中的蛋白聚糖(CSPG)的低硫酸化的硫酸软骨素A(CSA)的寄生物粘附。已经显示重组蛋白与CSA以空前高的亲和力和特异性结合。这可能归因于与CSA的相互作用，其不仅取决于带电的硫酸盐而且还取决于CS骨架。本发明的发明人预见胎盘中存在的CS与包括癌症干细胞在内的多种癌细胞上出现的CS非常相似。这通过以下事实证实，表达VAR2CSA的疟疾寄生物特异性地粘附至C32黑素瘤细胞上的CSA以及粘附至人类脑癌细胞。
[0056]因此，本发明依赖于VAR2CSA重组蛋白与低硫酸化的CSA之间的高亲和力和特异性。通过标记这种蛋白，本发明可以用于包括体内转移的追踪在内的广泛的应用，并且用于诊断转移性疾病。通过将VAR2CSA与细胞凋亡或细胞毒性试剂偶联，本发明可以用于特异性地靶向并清除癌细胞和癌症干细胞。借助使用VAR2CSA重组蛋白的简单治疗，将可以中和CSA的活性，从而抑制肿瘤发生和/或表达CSA的癌细胞的转移。CSA可以存在于许多蛋白骨架上，例如CSPG4、CD44、双糖链蛋白聚糖(biglycan)、核心蛋白聚糖(decorin)、多功能蛋白聚糖(versican)、软骨蛋白聚糖(aggrecan)(软骨中主要的CSPG)、基底膜蛋白聚糖(perlecan)、多配体蛋白聚糖(syndecan)、以及在表I中列出的其他物质。
[0057]预见本发明与恶性黑素瘤癌症特别相关，包括在黑素瘤细胞表面上具有含CSA链的CSPG4的皮肤、眼和结膜黑素瘤。据信这种GAG链参与有丝分裂和转移。然而，CSPG4不只对黑素瘤是特异性的。发明人基于来自多组人类组织和细胞系的数据进行的微阵列和组织阵列分析提出，CSPG4和其他类型的含CSA蛋白聚糖可以存在于来源于全部三个细胞胚层的大范围癌症类型。这些癌症类型包括癌(carcinoma)(乳腺癌(breast carcinoma)、膜腺癌(pancreatic carcinoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、子宫内膜癌(endometrial carcinoma)、肝细胞癌(hepatocellular carcinoma)、肺癌(lung carcinoma)、结肠癌(colon carcinoma)、前列腺癌(prostate carcinoma)、宫颈癌(cervix carcinoma)、睾丸癌(testis carcinoma)、基底细胞皮肤癌(basal cell skincarcinoma)、透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、角化头颈鱗状细胞癌(kreatinized head and neck squamous cell carcinoma)、皮肤鱗状细胞癌(skinsquamous cell carcinoma)、夕卜阴角化鱗状细胞癌(vulvar kreatinized squamous cellcarcinoma)和外阴基底细胞癌(vulvar basal cell carcinoma)),肉瘤(sarcoma)(乳腺脂肪肉瘤(breast liposarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、去分化软骨和脂肪肉瘤(dedifferentiated chondro-and liposarcoma)、平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、月旨肪肉瘤(liposarcoma)、粘液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)、子宫体平滑肌肉瘤(uterinecorpus le1myosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma))，造血系统癌(hematopoietic cancer)(慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphatic leukaemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphaticleukaemia，ALL)、急性髓细胞白血病(acute myeloid leukaemia AML)、B 细胞、T 细胞和大颗粒状淋巴瘤(large granular lymphoma))，神经上皮组织的肿瘤，如(星形细胞瘤(astrocytoma))(多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、纤维型星形细胞瘤(fibrillary astrocytoma)、间变型星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、多形性胶质母细胞瘤(gl1blastoma multiforme))、少突神经胶质瘤(oligodrendrogl1ma)、室管膜瘤(ependymoma)、脉络丛肿瘤(choroid plexus turmor)、少星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、神经胶质肉瘤(gl1sarcoma)、神经节神经胶质瘤(gangl1gl1ma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、神经细胞瘤(neurocytoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)(嗅神经母细胞瘤(esthes1neuroblastoma)和神经节母细胞瘤(gangl1neuroblastoma))、髓母细胞瘤(medul1blastoma)、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor)和所有类型的神经内分泌癌(neuroendocrinecancer)。
[0058]硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)还构成包括眼睛在内的中枢神经系统(CNS)和关节软骨的细胞外基质的重要组分。细胞外CSPG与关节炎的发病和神经损伤后再生的缺失密切相关。细胞外CSPG的缺失对关节炎和关节病的发展至关重要，并且高局部浓度的细胞外CSPG阻止神经损伤后的神经向外生长。
[0059]VAR2CSA重组蛋白不仅可以用于治疗与恶性生长相关的适应证,如在癌症中。增加或降低细胞外环境中存在的CSPG的疗法可以用于治疗关节炎、关节病，并且用于增强包括多发性硬化在内的神经突触损伤后的神经恢复。对于这些策略来说，本发明的发明人预见，可以使用VAR2CSA作为直接抑制剂或作为将改变CSPG代谢的药物靶向并维持至受感染组织的分子。
[0060]本发明的发明人已经鉴别了以1nM以下的亲和力结合胎盘绒毛间隙中的CSA的疟疾蛋白。已经以高产率制备了 VAR2CSA的较小重组部分，其以与全长和天然VAR2CSA蛋白相似的特征结合CSA。重组VAR2CSA蛋白不结合其他CS如硫酸软骨素C(C6S)或高度硫酸化的GAG如硫酸乙酰肝素(HS)。可以制备重组蛋白，从而以高亲和力结合在S2细胞、T.Ni细胞、CHO细胞以及包括BL21和Shuffle细胞的大肠杆菌菌株之间的各种表达系统中的 CSA(tm Lifetechnologies)。
[0061]本发明的发明人也已经鉴别了以非常高的亲和力(nM)和高特异性结合CSA的单一小型(75kDa)抗原。表3 (参见实施例2)列出了所有使用生物传感器技术分析的VAR2CSA蛋白的CSA亲和力。
[0062]本发明的发明人已经示出，这种VAR2CSA重组蛋白在低浓度下强烈结合大范围的癌细胞系，包括皮肤黑素瘤(C32、MeWo)、肺癌(lung carcinoma) (A549)、乳腺癌(breastcarcinoma) (HCC1395)、骨肉瘤(U20S、MNNG/H0S)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma) (RH30)和皮肤T细胞淋巴瘤(表4和5)。使用另一种VAR2CSA蛋白作为对照分子，除了分子的C端部位截短151个氨基酸之外，其与最小结合VAR2CSA构建体相同。这种截短消除了 CSA结合。重组VAR2CSA结合所有表达CSPG4的细胞系和表达具有CSA链的其他CSPG分子的癌细胞系(例如T细胞淋巴瘤)。重组VAR2CSA蛋白不与人红细胞和外周血单核细胞(PBMC)相互作用(表4)。
[0063]本发明的发明人已经在本文中示出，疟疾寄生物很可能通过CSPG4与VAR2CSA之间的特异性相互作用粘附至C32黑素瘤细胞。因此，预见可以将重组VAR2CSA及其缀合物用作靶向各种癌细胞上的CSA的治疗性化合物。
[0064]利用VAR2CSA靶向癌细胞上的CSA超过其他当前开发中的疗法的优点很多:
[0065]I) VAR2CSA与CSA之间的相互作用是空前高亲和力的并且是高度特异性的。
[0066]2) VAR2CSA是进化的改进的疟疾蛋白并且因此在患者中治疗将破坏耐受并引起自身免疫反应是不大可能的。
[0067]3) VAR2CSA是被充分表征的稳定蛋白并且能够在符合大规模蛋白生产的生物体中高度表达。
[0068]4)VAR2CSA是具有许多血清变体(serovariant)的多形态蛋白。可以由不同的血清变体提供重复的治疗，以避免与中和抗体有关的问题。
[0069]5) VAR2CSA在细胞外自然暴露在恶性疟原虫感染的红细胞上并且因此在人血清中本质上是稳定的蛋白，并且已经显示是高度蛋白酶抗性的。
[0070]本发明以VAR2CSA与CSA之间的相互作用为中心。这种相互作用是高亲和力的相互作用并且主要用途是靶向表达CSA的癌细胞。
[0071]CSA还可能与其他疾病和病理病症有关，比如，例如，在关节炎、关节病、多发性硬化、和神经损伤后的愈合、软骨修复、伤口愈合、和银屑病中。因此，VAR2CSA多肽或缀合物可以用于任何这种疾病或病症的治疗。
[0072]此外，可以使用VAR2CSA与CSA之间的相互作用作为生物技术工具，例如用于蛋白纯化和细胞分选测定。
[0073]因此，本发明的发明人预见本发明的多种用途:
[0074]I)可示踪重组VAR2CSA多肽或缀合物可以用于示踪癌症患者中的肿瘤和转移。
[0075]2)重组VAR2CSA多肽或缀合物可以用于直接靶向和中和癌细胞中的CSA活性。
[0076]3)重组VAR2CSA多肽或缀合物，如与细胞毒性分子偶联的VAR2CSA多肽，可以用于以对CSA阴性组织最小的有害毒性来靶向癌细胞。
[0077]4)可以使用标记的重组VAR2CSA多肽或缀合物作为研究癌细胞上CSA的研究或临床开发工具。
[0078]5)在生物技术和生命科学中，标记的重组VAR2CSA多肽或缀合物可以用于测定以分选CSA阳性细胞。这可以通过将重组VAR2CSA与树脂偶联而完成，以使其可以用于纯化表达CSPG4的细胞，如癌症干细胞，从而提供新型且有效的生物技术工具。
[0079]6)VAR2CSA多肽或缀合物可以用于表达CSPG4的细胞，如癌细胞的体外消耗(invitro deplet1n),作为自体移植的一部分。
[0080]7)VAR2CSA多肽或缀合物可以用于抗CSPG4疫苗。通过用CSPG4-VAR2CSA复合物或缀合物免疫动物，VAR2CSA可以以破坏对CSPG4的耐受为目的，起到作为用于针对CSPG4的免疫应答的载体和加强物的作用。
[0081]8)VAR2CSA多肽或缀合物可以用于监视对恶性疾病做出反应的体液(即尿液、脊髓液、胸腔积液、关节、骨髓、和淋巴液)中增加的CSA水平。这是基于以下事实，VAR2CSA多肽对低硫酸化CSA具有特异性并且可以检测由于未硫酸化CS (COS)的增加的比例的作用而引起的肿瘤进展。
[0082]9)VAR2CSA多肽或缀合物可以用于关节炎和关节病的治疗。VAR2CSA多肽可以阻断或靶向在关节炎和关节病期间阻断蛋白酶介导的软骨蛋白聚糖(aggrecan)降解的药物。VAR2CSA多肽还可以用于将抗炎药物靶向至受感染组织并且用于递送抑制剂如ADAMTS4和-5抑制剂。VAR2CSA多肽可以用于靶向促进借助软骨细胞的软骨蛋白聚糖的产生的药物。重复静脉内(1.v.)注射与VAR2CSA多肽偶联的软骨蛋白聚糖可以用于诱导对软骨蛋白聚糖的耐受。
[0083]10)VAR2CSA多肽或缀合物可以通过与神经突触组织中的细胞外CSPG结合来消除对神经突触生长的CSPG作用，例如通过阻断经由酪氨酸磷酸酶σ受体的信号传导。VAR2CSA肽可以靶向在受感染的神经组织中降解CSPG或抑制CSPG产生的药物。例如，下列药物可以被认为与VAR2CSA偶联:软骨素酶ABC，其切断CSPG分子的蛋白核心的糖链。木糖苷(xylocide)，其减少CSPG的产生，或者抑制对CSPG产生重要的酶如软骨素合酶或软骨素聚合因子的药物。此类药物的实例包括:4_氟代-葡糖胺、对硝基苯基-β-D-木糖苷、4-甲基-伞形酮酸- β -D-卩比喃木糖苷(4-methyl-umbelliferyl-beta-D-xylopyranoside)。
[0084]11)VAR2CSA多肽或缀合物还可以用于靶向和维持细胞因子如ILl-α，其促进ADAMTS4的产生，所述ADAMTS4随后裂解CSPG。
[0085]12)癌细胞上的CSPG4表达可以影响耐药性。许多患者中肿瘤通常开始时对治疗响应，但是随时间产生化学抗性以及癌症进展。CSPG4表达与多重耐药性有关并且通过其与PI3K途径的整联蛋白诱导的活化关联而介导。靶向癌细胞上的CSPG4的重组VAR2CSA多肽可以降低或阻止化学抗性，并且因此可以用于与例如PLX4032、BRAFV600E抑制剂的组合疗法。
[0086]定义
[0087]如在本文中所使用的术语“VAR2CSA多肽”是指由与硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)相互作用的恶性疟原虫表达的特异性红细胞膜蛋白I(PfEMPl)蛋白的细胞外部分，并且其特征在于具有SEQ ID N0:55或SEQ ID NO:56的序列或者其片段或变体，其具有结合可以在蛋白聚糖(CSPG)上出现的硫酸软骨素A(CSA)的能力。
[0088]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA多肽至少包含VAR2CSA蛋白片段，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb的连续氨基酸序列组成。
[0089]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA多肽至少包含VAR2CSA的蛋白片段，所述片段由a) IDl和b)DBL2Xb、和c) ID2a的连续氨基酸序列组成。
[0090]包括在VAR2CSA多肽的定义之内的是在Salanti A.等人Mol.Micro2003年7月；49 (I): 179-91 中，在 Khunrae P.等人，J Mol B1l.2010 年 4 月 2 日；397 (3): 826-34 中，在 Srivastava A.等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2010 年 3 月 16 日；107 (11):4884-9中，在DahlbackM.等人，J B1l Chem.2011 年 5 月 6 日；286 (18): 15908-17 中，或在Srivastava A.等人，PLoS One.2011 年；6 (5): e20270 中描述的多肽。
[0091]如在本文中所使用的术语“ID1”是指VAR2CSA的结构域，其特征在于具有与鉴别为SEQ ID NO:1的1-152的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
[0092]如在本文中所使用的术语“DBL2Xb”是指VAR2CSA的结构域，其特征在于具有与鉴别为SEQ ID NO:1的153-577的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
[0093]如在本文中所使用的术语“ID2a”是指VAR2CSA的结构域，其特征在于具有从SEQID NO:1的氨基酸578-640的N端开始的至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少
25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少
56、至少57、至少58、至少59、至少60、至少61、或至少62、如63个连续氨基酸的氨基酸序列，并且所述氨基酸序列与这种连续氨基酸的序列具有至少70%序列同一性。
[0094]在一些实施方案中，在本文中被称为与鉴别为SEQ ID NO: 1_75的任一序列或其片段的至少70%的氨基酸序列同一性是指，与该序列具有至少71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或 99%序列同一性的序列。
[0095]如在本文中所使用的术语“变体”或“多个变体”是指具有SEQ ID N0:55或SEQID N0:56的氨基酸序列的VAR2CSA多肽，包含SEQ ID NO: 1_54的氨基酸序列的VAR2CSA多肽的片段，所述片段或变体保持结合蛋白聚糖(CSPG)上的硫酸软骨素A(CSA)的能力，其中已经用另一种氨基酸置换了一个或多个氨基酸，和/或其中已经缺失了一个或多个氨基酸，和/或已经将一个或多个氨基酸插入在多肽中，和/或已经将一个或多个氨基酸加入至多肽中。这种加入可以发生在N端末端或在C端末端或者二者。在此定义内的“变体”或“多个变体”在能够结合硫酸软骨素A(CSA)方面仍具有功能活性。在一些实施方案中，变体与 SEQ ID NO:1-75 的序列，如 SEQ ID NO: 1、3_5、10、11、29、34、36-38、41、43_45、48、53_56、60-70,72-75 的序列具有至少 70%，如至少 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、8、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或 99%序列同一性。
[0096]如在本文中所使用的短语“功能变体”、“功能片段”、和“功能衍生物”是指SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:56的变体、片段、截短形式、以及衍生物，如SEQ ID NO: 1、3_5、10、11、
29、34、36-38、41、43-45、48、53-56、60-70、72-75 中的任一个，该多肽包含 SEQ ID N0:55 或SEQ ID NO:56的基本结合序列部分并且至少具备结合硫酸软骨素A(CSA)的能力。应该理解的是，VAR2CSA功能变体或功能片段可以具有选自作为二者、变体、和/或片段和/或衍生物的两种或三种特征。
[0097]当如在本文中所描述的测定中测试时，VAR2CSA多肽的功能变体或片段包括表现出在相同细胞类型中产生的野生型VAR2CSA多肽的结合亲和力的至少约25%、如至少约50%、如至少约75%、如至少约90%的那些。
[0098]如在本文中所使用的术语“免疫学片段”是指具备将要由抗体识别的基本相同的功能活性和相同的空间取向的氨基酸序列的片段。因此，特异性抗体将会结合多肽及其免疫学片段二者。
[0099]如在本文中所使用的术语“另一种氨基酸”意指与在该位置天然存在的氨基酸不同的一种氨基酸。这包括但不限于可以由多核苷酸编码的氨基酸。在一些实施方案中，所述不同的氨基酸是天然L型的并且可以由多核苷酸编码。
[0100]如在本文中所使用的术语“衍生物”意在表示相对于鉴别为SEQ ID NO:55或SEQID NO: 56的野生型VAR2CSA表现出基本相同或提高的生物活性的VAR2CSA多肽或其片段，其中已经将亲本肽的氨基酸中的一个或多个化学改性,例如通过烷基化、聚乙二醇化、酰基化、酯形成或酰胺形成等。
[0101]术语"构建体"意在表示多核苷酸区段，其可以基于全部或部分天然存在的编码目标多肽的核苷酸序列。构建体可以任选地含有其他多核苷酸区段。以相似的方式，术语“可以由多核苷酸构建体编码的氨基酸”涵盖可以由以上限定的多核苷酸构建体编码的氨基酸，即氨基酸如 Ala、Val、Leu、Ile>Met>Phe> Trp>Pro>Gly> Ser> Thr> Cys>Tyr> Asn>Glu>Lys、Arg、His、Asp 和 Gin。
[0102]如在本文中所使用的术语“载体”意指能够在宿主细胞中扩增的任何核酸实体。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制独立，例如质粒。备选地，载体可以是当被引入至宿主细胞时整合至宿主细胞基因组中并且与被其整合的一个或多个染色体一起复制的载体。载体的选择通常应取决于其将要引入至其中的宿主细胞。载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒或黏粒(cosmid)载体。载体通常含有复制起点和至少一个可选择基因，即编码容易被检测或者其存在是细胞生长所必需的产物的基因。
[0103]如在本文中所使用的术语“适当的生长培养基”意指含有细胞生长和编码本发明的VAR2CSA多肽的核酸序列的表达所需的营养物质和其他组分的培养基。
[0104]在上下文中，术语“治疗”意指包括预防、治愈和缓解(如在癌症中)涉及CSA的表达、如不适当表达的疾病、紊乱或病症的症状。根据本发明的VAR2CSA多肽、缀合物或衍生物的预防性和治疗性施用因此包括在术语“治疗”中。
[0105]如在本文中所使用的术语“受试者”意指任何动物，尤其是哺乳动物，如人，并且在适当时可以与术语“患者”互换使用。
[0106]如本领域中已知的术语“序列同一性”是指如通过比较序列而确定的、两个以上多肽分子或两个以上核酸分子的序列之间的关系。在本领域中，“同一性”也意指核酸分子之间或多肽之间的序列相关性程度，根据情况可以由两个以上核苷酸残基或两个以上氨基酸残基的字符串(string)之间的匹配数量而确定。“同一性”度量两个以上序列中的较小者与空位比对(如果存在的话)之间的相同匹配的百分数，其通过特定的数学模型或计算机程序(即，“算法”)处理。
[0107]术语“相似性”是相关的概念，但是与“同一性”不同，是指包括相同匹配和保守性置换匹配二者的序列关系。如果两个多肽序列具有例如(分数(10/20))相同的氨基酸，并且其余部分全部是非保守性置换，则百分比同一性和相似性将会均为50%。在相同的实例中，如果存在5个额外的具有保守性置换的位置，则百分比同一性仍为50%，但是百分比相似性将为75% (分数(15/20))。因此，在具有保守性置换的情况下，两个多肽之间的相似性的程度将会高于这两个多肽之间的百分比同一性。
[0108]对SEQ ID NO: 1_56、60_70、和72_75的氨基酸序列的保守性修饰(以及对编码核苷酸的相对应的修饰)将会产生具有与天然存在的VAR2CSA多肽的那些相似的功能和化学特性的VAR2CSA多肽。相比之下，VAR2CSA多肽的功能和/或化学特性的实质性修饰可以通过在SEQ ID NO: 1-56、60-70、和72-75的氨基酸序列中选择置换来完成，所述置换在它们对保持以下的作用中明显不同:(a)在置换区域中的分子骨架的结构，例如，作为折叠片或螺旋构象、(b)在靶位点处的分子的电荷或疏水性、或(C)侧链的体积。
[0109]例如，“保守性氨基酸置换”可以包括利用使得对在该位置的氨基酸残基的极性或电荷几乎没有影响或没有影响的非天然残基置换天然氨基酸残基。此外，还可以用丙氨酸置换多肽中的任何天然残基，如之前已经针对“丙氨酸扫描诱变(alanine scanningmutagenesis) ”描述的(参见,例如，讨论丙氨酸扫描诱变的MacLennan等人，1998，ActaPhys1l.Scand.Suppl.643:55-67 ；Sasaki 等人,1998, Adv.B1phys.35:1-24)。
[0110]所需的氨基酸置换(无论是保守性或非保守性的)可以由本领域技术人员在需要这种置换时确定。例如，氨基酸置换可以用于鉴别VAR2CSA多肽的重要残基，或者用于增加或降低在本文中所描述的VAR2CSA多肽的亲和力。
[0111]可以基于常见的侧链性质将天然存在的残基分为多种类型:
[0112]I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile ;
[0113]2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ;
[0114]3)酸性:Asp、Glu ;
[0115]4)碱性:His> Lys> Arg ；
[0116]5)影响链取向的残基:Gly、Pro ;和
[0117]6)芳香性:Trp、Tyr、Phe。
[0118]例如，非保守性置换可以包括这些类型之一的成员与另一类型的成员交换。可以将这种被置换的残基引入至恶性疟原虫VAR2CSA多肽的与非恶性疟原虫VAR2CSA多肽同源的区域中，或者引入至分子的非同源区域中。
[0119]在进行这种变化时,可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。每种氨基酸均基于其疏水性和电荷特性而指定亲水指数，这些是:异亮氨酸(+4.5);缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8);苯丙氨酸(+2.8);半胱氨酸/胱氨酸(+2.5);甲硫氨酸(+1.9);丙氨酸(+1.8);甘氨酸(-0.4);苏氨酸(-0.7);丝氨酸(-0.8);色氨酸(-0.9);酪氨酸(-1.3);脯氨酸(-1.6);组氨酸(-3.2);谷氨酸(-3.5);谷氨酰胺(-3.5);天冬氨酸(-3.5);天冬酰胺(-3.5);赖氨酸(-3.9);和精氨酸(-4.5) ο
[0120]在本领域中，了解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物功能中的重要性(Kyte等人，J.Mol.B1l.，157:105-131 (1982))。已知的是，某些氨基酸可以置换具有相似的亲水指数或评分的其他氨基酸，并且仍然保持相似的生物活性。在基于亲水指数进行变化时，亲水指数在±2以内的氨基酸的置换是优选的，亲水指数在±1以内是特别优选的，并且亲水指数在±0.5以内是甚至更特别优选的。
[0121]在本领域中，还应理解的是，可以基于亲水性高效地进行相似氨基酸的置换，尤其是在由其产生的生物学功能上等价的蛋白质或肽预期用于免疫学实施方案的情况下，如在本申请的情况下。由其相邻氨基酸的亲水性控制的蛋白质的最大局部平均亲水性与其免疫原性和抗原性相关，即与蛋白质的生物学性质相关。
[0122]已经将下列亲水性数值分配给氨基酸残基:精氨酸(+3.0);赖氨酸(，3.0);天冬氨酸(+3.0±1);谷氨酸(+3.0±1);丝氨酸(+0.3);天冬酰胺(+0.2);谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(O);苏氨酸(-0.4);脯氨酸(_0.5±1);丙氨酸(-0.5);组氨酸(-0.5);半胱氨酸(-1.0);甲硫氨酸(-1.3);缬氨酸(-1.5);亮氨酸(-1.8);异亮氨酸(-1.8);酪氨酸(-2.3);苯丙氨酸(-2.5);色氨酸(-3.4)。在基于相似的亲水性数值进行变化时，亲水性数值在±2以内的氨基酸的置换是优选的，亲水性数值在±1以内是特别优选的，并且亲水性数值在±0.5以内是甚至更特别优选的。还可以基于亲水性从一级氨基酸序列鉴别表位。这些区域也被称为“表位核心区域(epitopic core reg1ns) ”。
[0123]本领域技术人员将能够利用公知的技术确定如在SEQ ID NO: 1_75中给出的多肽的适合的变体。为了鉴别可以被改变而不破坏活性的分子的适合的区域，本领域技术人员可以靶向据信对活性不重要的区域。例如，当已知来自相同物种或其他物种的具有相似活性的相似多肽时，本领域技术人员可以将VAR2CSA多肽的氨基酸序列与这种相似多肽进行比较。通过这种比较，可以鉴别残基和分子的在相似多肽之间保守的部分。应该理解的是，VAR2CSA多肽的相对于这种相似多肽不保守的区域中的变化将不大可能对VAR2CSA多肽的生物活性和/或结构造成负面影响。本领域技术人员还将知道，即使在相对保守区域中，也可以在保持活性的同时用化学相似的氨基酸置换天然存在的残基(保守性氨基酸残基置换)。因此，在不破坏生物活性或不负面影响多肽结构的情况下，甚至对生物活性或对结构重要的区域也可以接受保守性氨基酸置换。
[0124]另外，本领域技术人员可以回顾鉴别对活性或结构重要的相似多肽中残基的结构功能研究。基于这种比较，可以预测与相似多肽中对活性或结构重要的氨基酸残基相对应的VAR2CSA多肽中氨基酸残基的重要性。本领域技术人员可以选择本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的预测的重要氨基酸残基的化学相似的氨基酸置换。
[0125]本领域技术人员还可以分析相似多肽中的三维结构和与该结构有关的氨基酸序列。基于该信息，本领域技术人员可以预测VAR2CSA多肽的氨基酸残基的关于其三维结构的比对。本领域技术人员可以选择不对被预测在蛋白质的表面上的氨基酸残基进行根本性的改变，因为这种残基可以参与同其他分子的重要相互作用。此外，本领域技术人员可以产生在每个所需的氨基酸残基处含有单一氨基酸置换的试验变体。之后可以使用如在本文中所描述的活性测定筛选变体。这种变体可以用于收集与适合的变体有关的信息。例如，如果发现对特定的氨基酸残基的改变产生破坏的、不希望地降低的、或不适合的活性，则将避免具有这种改变的变体。换句话说，基于由这种常规实验收集的信息，本领域技术人员能够容易地确定在其中应该单独或与其他突变组合避免进一步置换的氨基酸。
[0126]许多科学出版物已经致力于二级结构的预测。参见Moult J.，Curr.0p.1n B1tech., 7 (4):422-427 (1996), Chou 等人，B1chemistry (生物化学)，13(2):222-245(1974) ;Chou 等人，B1chemistry(生物化学)，113 (2):211-222 (1974) ；Chou 等人，Adv.Enzymol.Relat.Areas Mo 1.B1l, 47:45-148(1978) ；Chou 等人，Ann.Rev.B1chem.，47:251-276 以及 Chou 等人，B1phys.J.，26:367-384(1979)。此外，目前计算机程序可用于辅助预测二级结构。预测二级结构的一种方法基于同源模建(homology modeling)。例如，具有大于30%的序列同一性或大于40%的相似性的两种多肽或蛋白质通常具有相似的结构拓扑(structural topology)。最近蛋白质结构数据库(PDB)的出现已经提供了提高的二级结构可预测性，包括多肽的或蛋白质的结构内折叠的潜在数量。参见Ho I m等人,Nucl.Acid.Res., 27 (I): 244-247 (1999)。已经提出(Brenner 等人,Curr.0p.Struct.B1l.,7(3): 369-376 (1997))，在给定的多肽或蛋白质中存在有限数量的折叠，以及一旦已经解析临界数量的结构，则结构预测将会在准确性方面显著提高。
[0127]预测二级结构的额外方法包括“串线(threading) ” (Jones, D.，Curr.0pin.Struct.B1l., 7 (3):377-87 (1997) ； S ippI 等人,Structure (结构)，4 ⑴:15-9 (1996)), “profile analysis (轮廓分析)” (Bowie 等人,Science (科学)，253:164-170 (1991) ；Gribskov 等人，Meth.Enzymol.，183:146-159 (1990) ；Gribskov等人，Proc.Nat.Acad.Sc1., 84 (13):4355-4358 (1987)),以及“evolut1nary linkage (进化谱系)”(参见上述Home和上述Brenner)。
[0128]可以通过已知的方法方便地计算相关的多肽的同一性和相似性。这种方法包括但不限于在以下描述的那些:Computat1nal Molecular B1logy(计算分子生物学),Lesk, A.M., ed.,牛津大学出版社，纽约，1988 ；B1computing:1nformatics andGenome Projects (生物计算:信息学与基因组工程)，Smith, D.ff., ed., Academic Press,纽约，1993 ;Computer Analysis of Sequence Data, Part I (序列数据的计算机分析，第 I 部分)，Griffin, A.Μ.,和 Griffin, H.G., eds., Humana Press,新泽西,1994 ；SequenceAnalysis in Molecular B1logy (分子生物学中的序列分析)，von Heinje, G., AcademicPress, 1987 ；Sequence Analysis Primer (序列分析引物)，Gribskov, M.和Devereux, J., eds., M.Stockton Press,纽约，1991 ;以及 Carillo 等人，SIAM J.AppliedMath.,48:1073 (1988) ο
[0129]用于确定同一性和/或相似性的优选的方法被设计为在所测试的序列之间提供最大的匹配。用于确定同一性和相似性的方法描述于可公开获得的计算机程序中。用于确定两个序列之间的同一性和相似性优选的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括 GAP (Devereux 等人，Nucl.Acid.Res.，12:387 (1984) ；Genetics ComputerGroup (遗传学计算机组)，University of Wisconsin, Madison, ffis.)、BLASTP> BLASTN、和 FASTA(Altschul 等人，J.Mol.B1l., 215:403-410 (1990))。BLASTX 程序可从 Nat1nalCenter for B1technology Informat1n(国家生物技术信息中心,NCBI)以及其他来源公开获得(BLAST Manual (BLAST 手册)，Altschul 等人，NCB/NLM/NIH Bethesda, Md.20894 ;上述Altschul等人)。还可以使用公知的Smith Waterman算法确定同一性。
[0130]某些用于比对两个氨基酸序列的比对方案可以仅产生两个序列的短区域的匹配，并且尽管两个全长序列之间不存在明显的关系，但是这个小比对区域可以具有非常高的序列同一性。因此，在优选实施方案中，选择的比对方法(GAP程序)将会产生横跨靶多肽的至少50个连续氨基酸的比对。
[0131]例如，使用计算机算法GAP (Genetics Computer Group (遗传学计算机组),University of Wisconsin, Madison, ffis.)，比对将要确定百分比序列同一性的两个多肽，用于其各自氨基酸的最佳匹配(如通过算法确定的“匹配间距(matched span) ”)。开放空位罚分(gap opening penalty)(计算为平均对角线的3倍；其中“平均对角线”是使用的比较矩阵的对角线的平均值；“对角线”是通过具体比较矩阵为每个完美氨基酸匹配指定的得分或数字)和延伸空位罚分(gap extens1n penalty)(通常为开放空位罚分的{分数(1/10)}倍)，以及比较矩阵，如PAM 250或BLOSUM 62，与该算法一起使用。该算法也使用标准比较矩阵(关于PAM 250比较矩阵,参见Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequenceand Structure (蛋白质序列和结构图)，vol.5，supp.3 (1978);关于BLOSUM 62比较矩阵,参见 Henikoff 等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA, 89:10915-10919 (1992))。
[0132]多肽序列比较的优选的参数包括下列:
[0133]算法:Needleman等人，J.Mol.B1l, 48:443-453 (1970);比较矩阵:BL0SUM 62，来自 Henikoff 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 89:10915-10919 (1992);空位罚分:12，空位长度罚分:4，相似性阈值:0。
[0134]GAP程序使用以上参数。对于使用GAP算法的多肽比较(末端空位无罚分)来说，前述参数是默认参数。
[0135]核酸分子序列比较的优选的参数包括以下:算法=Needleman等人，J.MolB1l.,48:443-453(1970);比较矩阵:匹配=+10，错配=0，空位罚分:50，空位长度罚分:3。
[0136]GAP程序也使用以上参数。对于核酸分子比较来说，前述参数是默认参数。
[0137]可以使用其他示例性算法、开放空位罚分、延伸空位罚分、比较矩阵、相似性阈值等，包括在 Program Manual, Wisconsin Package, Vers1n 9, 1997 年 9 月中给出的那些。对本领域技术人员来说，做出特定的选择将会是显而易见的，并且该选择将会取决于所要进行的特定比较，如DNA与DNA、蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA ;并且此外，无论比较是在给定的序列对之间(在这种情况下，GAP或BestFit—般是优选的)的还是在一个序列与大型序列数据库之间(在这种情况下，FASTA或BLASTA是优选的)的比较。
[0138]本发明的发明人现在已经解决并发现对以下与PM中胎盘粘附之后的分子机制有关的关键问题的答案:1)所描述的差异CSA粘附是否与VAR2CSA序列有关2)对于VAR2CSA结合CSA来说，确切的最小结构要求是什么3)VAR2CSA与CSA之间存在的化学相互作用的类型是什么以及最后4)此信息是否能够用于设计最佳疫苗抗原？
[0139]通过表达相同的FCR3和3d7VAR2CSA截短物，本发明的发明人示出，VAR2CSA以相似的亲和力和特异性结合CSA，而无论寄生物菌株来源如何。这两个序列具有79.6%的序列同一性。本发明的发明人进一步说明，在多个较短片段中保留高CSA结合亲和力，并且包含侧翼结构域间(flanking interdomain)的小区域的DBL2X形成含有高亲和力CSA结合位点的致密核心。在计算机中，本发明的发明人限定了 VAR2CSA中推定的GAG结合部位，并且通过缺失和置换，本发明的发明人表明在这些部位中的突变对CSPG结合没有影响。利用聚电解质-蛋白质相互作用的理论，本发明的发明人已经表明，VAR2CSA-CSA相互作用可以不只取决于离子相互作用。最后，本发明的发明人已经表明，多个短VAR2CSA片段能够诱导粘附阻断性抗体的产生，并且抗粘附抗体靶向所提出的CSA结合区域。这些数据提供了针对PfEMPl分子与其配体之间相互作用的生物化学性质的首次详细的见解。
[0140]本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的制备
[0141]本发明还涉及制备如上所述的本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的方法。可以借助重组核酸技术来制备在本文中所描述的本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽。通常，修饰克隆的野生型VAR2CSA核酸序列以编码所需的蛋白质。之后将这种修饰的序列插入至表达载体中，进而将其转化或转染至宿主细胞中。可以将更高级的真核细胞，尤其是培养的哺乳动物细胞，用作宿主细胞。也可以使用原核细胞如乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)或大肠杆菌(E.coli)来表达多肽，只要这些原核生物能够产生二硫键或者蛋白质是或可以是正确地重折叠的即可。此外，也可以使用酵母菌株来表达蛋白质，这里包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母属(P.Pichia)。
[0142]可以通过多种技术实现氨基酸序列改变(alterat1n)。核酸序列的修饰可以借助定点诱变(site-specific mutagenesis)。用于定点诱变的技术是在本领域内公知的并且描述于，例如，Zoller 和 Smith(DNA 3:479-488，1984)或“Splicing by extens1noverlap (借助延伸重叠的剪接)Norton等人，Gene77, 1989，pp.61-68。因此，使用VAR2CSA的核苷酸和氨基酸序列，可以引入选择的一个或多个改变。同样地，用于利用使用特定引物的聚合酶链式反应制备DNA构建体的过程对本领域技术人员来说是公知的(参考PCRProtocols (PCR 方案),1990, Academic Press, San Diego, California, USA)。
[0143]本发明的多肽也可以包括非天然存在的氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，丙氨酸、脱氨基组氨酸、反式-3-甲基脯氨酸、2，4-甲醇脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、轻乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺(homoglutamine)、哌唳酸(pipecolicacid)、噻唑烧羧酸(thiazolidine carboxyl ic acid)、脱氢脯氨酸、3_和4_甲基脯氨酸、3，3- 二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。在本领域中已知多种方法用于将非天然存在的氨基酸残基结合至多肽中。例如，可以采用在其中使用化学氨基酰化抑制物tRNA抑制无义突变的体外系统。用于合成氨基酸和将tRNA氨基酰化的方法在本领域中是已知的。在包含大肠杆菌S30萃取物和可商购的酶和其他试剂的无细胞系统中进行含有无义突变的质粒的转录和翻译。通过层析来纯化多肽。参见，例如，Robertson 等人，J.Am.Chem.Soc.113:2722, 1991 ；Ellman等人,Methods Enzymol.202:301, 1991 ；Chung 等人,Science (科学)259:806-9，1993 ；以及 Chung 等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:10145-9，1993)。在第二种方法中，通过突变mRNA和化学氨基酰化的抑制物tRNA的显微注射,在爪蟾卵母细胞(Xenopus oocytes)中进行翻译(Turcatti等人，J.B1l.Chem.271:19991-8，1996)。在第三种方法中，在不存在所要替换的天然氨基酸并且存在所需非天然存在的一种或多种氨基酸的情况下，培养大肠杆菌细胞(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)。将非天然存在的氨基酸结合至多肽中，以代替其天然氨基酸对应物。参见Koide等人，B1chem.33:7470-6, 1994。可以通过体外化学修饰将天然存在的氨基酸残基转化为非天然存在的物种。可以将化学修饰与定点诱变(site-directed mutagenesis)组合，以进一步扩大置换的范围(Wynn 和 Richards, Protein Sc1.2:395-403，1993)。
[0144]编码本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的核酸构建体可以适宜地属于基因组或cDNA来源，例如通过准备基因组或cDNA文库并且根据标准技术(参考Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)，第二版.ColdSpring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)，冷泉港，New York, 1989)借助使用合成寡核苷酸探针的杂交来筛选编码全部或部分多肽的DNA序列获得的。
[0145]编码VAR2CSA多肽的核酸构建体也可以以合成方式通过确立的标准方法制备，例如，由 Beaucage 和 Caruthers, Tetrahedron Letters (四面体通讯)22 (1981), 1859-1869 描述的亚磷酰胺法或者由Matthes等人，EMBO Journal 3 (1984)，801-805描述的方法。根据亚磷酰胺法，例如在自动DNA合成器中合成寡核苷酸，并且将其纯化、退火、连接并在适合的载体中克隆。编码本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列也可以通过使用特定引物的聚合酶链式反应制备，例如，如在US 4，683，202、Saiki等人，Science (科学)239 (1988)，487-491、或上述Sambrook等人中描述的。
[0146]此外，核酸构建体可以属于根据标准技术通过连接合成的、基因组的或cDNA来源的片段(适当时)制备的混合的合成和基因组的、混合的合成的和cDNA或者混合的基因组和cDNA来源，所述片段对应于整个核酸构建体的多个部分。
[0147]核酸构建体优选为DNA构建体。用于制备根据本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列通常将会在VAR2CSA的氨基端编码前原多肽(pre-pro polypeptide)，以获得适当的翻译后加工以及从宿主细胞的分泌。
[0148]通常将编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列插入至重组载体中，所述重组载体可以是可以方便地对其进行重组DNA操作的任何载体，并且载体的选择通常将会取决于将要将其引入至其中的宿主细胞。因此，载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制与染色体复制独立，例如质粒。备选地，载体可以是当被引入至宿主细胞时整合至宿主细胞基因组中并且与被其整合的一个或多个染色体一起复制的载体。
[0149]载体优选为表达载体，其中编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列可操作地连接至DNA转录所需的另外的区段。通常，表达载体来源于质粒或病毒DNA，或者可以含有这两种元件。术语“可操作地连接”表示，将区段布置成其发挥与其预期目的一致的作用，例如转录在启动子中起始并且前进经过编码多肽的DNA序列。
[0150]用于表达根据本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的表达载体将包含能够指导克隆基因或cDNA的转录的启动子。启动子可以是任何DNA序列,其显示所选择的宿主细胞中的转录活性，并且可以来源于编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
[0151]哺乳动物细胞中用于指导编码恶性疟原虫VAR2CSA多肽的DNA的转录的适合的启动子的实例是 SV40 启动子(Subramani 等人，Mol.Cell B1l.1 (1981)，854-864)、MT-1 (金属硫蛋白基因(metalloth1nein gene))启动子(Palmiter 等人，Science (科学)222 (1983)，809-814)、CMV 启动子(Boshart 等人,Cell(细胞)41:521-530，1985)或者腺病毒 2 主要晚期启动子(adenovirus 2 major late promoter) (Kaufman 和 Sharp, Mol.Cell.B1l, 2:1304-1319，1982)。
[0152]用于昆虫细胞的适合的启动子的实例是多角蛋白(polyhedrin)启动子(US
4,745, 051 ;Vasuvedan 等人，FEBS Lett.311, (1992) 7-11)、P10 启动子(J.Μ.Vlak 等人，J.Gen.Virology 69，1988，pp.765-776)、苜猜尺蠖(Autographa californica)多角体病毒(polyhedrosis virus)基本蛋白启动子(EP397485)、杆状病毒立即早期基因I启动子(US
5,155,037 ；US 5，162，222)、或者杆状病毒39K延迟早期基因启动子(US 5, 155,037 ；US5，162，222)。
[0153]用于酵母宿主细胞的适合的启动子的实例包括来自酵母糖酵解基因(Hitzeman等人，J.B1l.Chem.255 (1980)，12073-12080 ；Alber 和 Kawasaki,J.Mol.Appl.Gen.1 (1982), 419-434)或醇脱氢酶基因(Young 等人，在 Genetic Engineering ofMicroorganisms for Chemicals (用于化学的微生物的基因工程)(Hollaender等人编)中，Plenum Press, New York, 1982)的启动子，或者 TPIl (US 4, 599, 311)或ADH2-4c (Russell 等人，Nature (自然)304 (1983)，652-654)启动子。
[0154]用于丝状真菌宿主细胞的适合的启动子的实例是，例如，ADH3启动子(McKnight等人，The EMBO J.4(1985)，2093-2099)或tpiA启动子。其他可用的启动子的实例是来源于编码以下的基因的启动子:米曲霉(A.0ryzae)TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉(A.niger)中性α淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸稳定性α淀粉酶、黑曲霉(A.niger)或泡盛曲霉(A.awamori)葡糖淀粉酶(gluA)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米曲霉(A.0ryzae)碱性蛋白酶、米曲霉(A.0ryzae)磷酸丙糖异构酶或构巢曲霉(A.nidulans)乙酰胺酶。优选的是TAKA淀粉酶和gluA启动子。在例如EP 238023和EP 383779中，提及了适合的启动子。
[0155]编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列也可以(如果需要的话)可操作地连接至适合的终止子，如人生长激素终止子(Palmiter等人,Science (科学)222, 1983, pp.809-814)或 TPIl(Alber 和 Kawasaki, J.Mol.Appl.Gen.1，1982，pp.419-434)或 ADH3 (McKnight 等人，The EMBO J.4，1985，pp.2093-2099)终止子。表达载体还可以含有位于启动子下游和VAR2CSA序列本身的插入位点上游的一组RNA剪接位点。可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因获得优选的RNA剪接位点。表达载体中还含有位于插入位点下游的多聚腺苷酸化信号。特别优选的多聚腺苷酸化信号包括来自SV40的早期或晚期多聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，ibid.)、来自腺病毒5Elb区的多聚腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等人Nucl.AcidsRes.9:3719-3730, 1981)或来自恶性疟原虫、人或牛基因的多聚腺苷酸化信号。表达载体还可以包括非编码病毒前导序列，如位于启动子与RNA剪接位点之间的腺病毒2三联前导序列；和增强子序列，如SV40增强子。
[0156]为了将本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽引导至宿主细胞的分泌途径中，可以在重组载体中设置分泌信号序列(也被称为前导序列、前原序列(preprosequence)或前序列)。以正确的阅读框将分泌信号序列与编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码肽的DNA序列的5’。分泌信号序列可以是与蛋白质通常相关的序列，或者可以来自编码另一种分泌性蛋白质的基因。
[0157]对于来自酵母细胞的分泌来说，分泌信号序列可以编码任何信号肽，其确保表达的根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽有效指向进入细胞分泌途径。信号肽可以是天然存在的信号肽、或其功能部分，或者其可以是合成肽。已经发现了适合的信号肽为α因子信号肽(参考US4，870，008)、小鼠唾液淀粉酶的信号肽(参考0.Hagenbuchle等人，Nature (自然)289，1981，pp.643-646)、修饰的羧肽酶信号肽(参考L.A.Valls等A,Cell(细胞)48，1987，pp.887-897)、酵母 BARl 信号肽(参考 WO 87/02670)、或酵母天冬氨酸蛋白酶 3(YAP3)信号肽(参考 M.Egel-Mitani 等人，Yeast 6，1990，pp.127-137)。
[0158]对于酵母中的有效分泌来说，还可以将编码前导肽的序列插入信号序列的下游和编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列的上游。前导肽的功能是允许将表达的肽从内质网引导至高尔基体，并进一步引导至分泌小泡，以向培养基中分泌(即根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽横跨细胞壁或至少经由细胞膜向酵母细胞的周质空间中输出)。前导肽可以是酵母α因子前导序列(其用途描述于，例如US 4，546，082、US 4，870，008、EP 16201、EP 123294、EP 123544 和 EP 163529 中)。备选地，前导肽可以是合成前导肽，即未在自然中发现的前导肽。例如，可以如在WO 89/02463或WO 92/11378中描述的构建合成前导肽。
[0159]对于在丝状真菌中使用来说，信号肽可以方便地来源于编码曲霉属(Aspergillussp.)淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，编码米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶或蛋白酶或者柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶的基因。信号肽优选来源于编码米曲霉(A.0ryzae)TAKA淀粉酶、黑曲霉(A.niger)中性α淀粉酶、黑曲霉(A.niger)酸稳定性淀粉酶、或黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶的基因。在例如EP 238023和EP 215 594中公开了适合的信号肽。
[0160]对于在昆虫细胞中使用来说，信号肽可以方便地来源于昆虫基因(参考WO90/05783),如鱗翅类烟草夜蛾(Manduca sexta)脂动激素(adipokinetic hormone)前体信号肽(参考US 5，023, 328)。
[0161]用于连接编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列与启动子和任选的终止子和/或分泌信号序列的操作，以及用于将其插入至含有复制所需信息的适合的载体的操作，对本领域技术人员来说是公知的(参考，例如，Samtoook等A , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆:实验室手册)，冷泉港，NewYork,1989)。
[0162]转染哺乳动物细胞和表达引入至细胞中的DNA序列的方法描述于，例如Kaufman 和 Sharp, J.Mol.B1l.159(1982)，601-621 ;Southern 和 Berg,J.Mol.Appl.Genet.1(1982)，327-341 ；Loyter 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 79(1982)，422-426 ；Wigler 等人,Cell (细胞)14 (1978), 725 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (体细胞遗传学)(体细胞遗传学)7 (1981)，603，Graham 和 van der Eb, Virology52 (1973)，456 ；以及 Neumann 等人，EMBO J.1 (1982)，841-845。
[0163]通过例如磷酸钙介导的转染(Wigler等人，Cell(细胞)14:725-732, 1978 ；Corsaro 和 Pearson, Somatic Cell Genetics (体细胞遗传学)7:603-616,1981 ；Graham 和 Van der Eb, Virology 52d:456-467, 1973)或电穿孔(Neumann 等人，EMBOJ.1:841-845，1982)，将克隆的DNA序列引入至培养的哺乳动物细胞中。为了鉴别和选择表达外源DNA的细胞，通常将赋予可选择表型(可选择标记)的基因随目标基因或cDNA—起引入至细胞中。优选的可选择标记包括赋予对药物如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、和甲氨蝶呤(methotrexate)的抗性的基因。可选择标记可以是可扩增的可选择标记。优选的可扩增的可选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。可选择标记由 Thilly 综述(Mammalian Cell Technology (哺乳动物细胞技术)，ButterworthPublishers, Stoneham, MA,通过引用结合在本文中)。本领域技术人员将能够容易地选择适合的可选择标记。
[0164]可以将可选择标记与目标基因在分别的质粒上同时引入至细胞中，或者可以在相同的质粒上将它们引入。如果在相同的质粒上，可选择标记和目标基因可以处于不同启动子或相同启动子的控制下，后一种布置产生双顺反子信使(dicistronic message)。这种类型的构建体在本领域中是已知的(例如,Levinson和Simonsen,美国4，713, 339)。将被称为“载体DNA”的另外的DNA加入至被引入至细胞中的混合物中也可以是有利的。
[0165]在细胞已经吸收DNA之后，使它们在适当的生长培养基中生长，通常1-2天，以开始表达目标基因。如在本文中所使用的术语“适当的生长培养基”意指含有细胞生长和目标恶性疟原虫VAR2CSA多肽的表达所需的营养物质和其他组分的培养基。培养基通常包含碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、盐、磷脂、蛋白质和生长因子。之后进行药物选择以选择以稳定方式表达可选择标记的细胞的生长。对于已经用可扩增的可选择标记转染的细胞来说，可以增加药物浓度以选择增加的拷贝数的克隆序列，从而增加表达水平。之后筛选稳定转染的细胞的克隆，以表达目标恶性疟原虫VAR2CSA多肽。
[0166]向其中引入编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列的宿主细胞可以是任何细胞，其能够产生翻译后修饰的多肽并且包括酵母、真菌和更高级的真核细胞。
[0167]用于本发明的哺乳动物细胞系的实例是COS-UATCC CRL 1650)、幼仓鼠肾脏(BHK)和 293 (ATCC CRL 1573 ;Graham 等人，J.Gen.Virol.36:59-72，1977)细胞系。优选的 BHK 细胞系是 tk_tsl3BHK 细胞系(Waechter 和 Baserga, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA79:1106-1110，1982，通过引用结合在本文中)，在下文中被称为BHK 570细胞。BHK 570细胞系已经以ATCC保藏编号CRL 10314存放在美国模式培养物保藏中心(American TypeCulture Collect1n), 12301Parklawn Dr., Rockville, Md.20852? tk_tsl3 BHK 细胞系也可以以保藏编号CRL 1632从ATCC获得。此外，在本发明中可以使用许多其他细胞系，包括大鼠H印I (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL 1600)、大鼠H印II (大鼠肝细胞瘤；ATCC CRL1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、人肺(ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL9.1)、CHO (ATCCCCL 61)和 DUKX 细胞(Urlaub 和 Chasin, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:4216-4220，1980)。
[0168]适合的酵母细胞的实例包括酵母菌属(Saccharomyces spp.)或裂殖酵母属(Schizosaccharomyces spp.),尤其是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)的菌株。用于利用异源DNA转化酵母细胞并且由其产生异源多肽的方法描述于，例如 US 4，599，311、US4, 931，373、US 4，870，008,5, 037，743、和US 4，845，075，它们全部通过引用结合于此。通过由可选择标记确定的表型来选择转化的细胞，可选择标记通常是抗药性或在不存在特定营养物(例如，亮氨酸)的情况下生长的能力。用于酵母的优选的载体是US 4，931，373中公开的POTl载体。例如，如上所述的，编码根据本发明的恶性疟原虫VAR2CSA多肽和其他多肽的DNA序列的前面可以是信号序列和任选的前导序列。适合的酵母细胞的另外的实例是下列菌株:克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(K.1actis),汉逊酵母属(Hansenula)例如多形汉逊酵母(H.poIymorpha),或者毕赤酵母属(Pichia)例如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)(参考Gleeson 等人，J.Gen.Microb1l.132，1986，pp.3459-3465 ；US 4，882，279)。
[0169]其他真菌细胞的实例是丝状真菌的细胞,例如曲霉属(Aspergillus spp.)、链孢霉属(Neurospora spp.)、键刀菌属(Fusarium spp.)或木霉属(Trichoderma spp.),尤其是下列的菌株:米曲霉(A.0ryzae)、构巢曲霉(A.nidulans)或黑曲霉(A.niger)。使用曲霉属(Aspergillus spp.)表达蛋白质描述于，例如，EP 272277,EP 238023,EP 184438。例如，如由Malardier等人，1989, Gene 78:147-156描述的,可以进行尖抱键刀菌(F.0xysporum)的转化。例如，如在EP 244234中描述的,可以进行木霉属(Trichoderma spp.)的转化。
[0170]当使用丝状真菌作为宿主细胞时，可以方便地通过将DNA构建体整合在宿主染色体中用本发明的DNA构建体将其转化，以获得重组宿主细胞。这种整合通常被认为是优势，因为DNA序列更有可能被稳定地维持在细胞中。可以根据常规方法，例如通过同源或异源重组,进行DNA构建体向宿主染色体中的整合。
[0171]如在US 4, 745, 051 ；US 4, 879, 236 ；US 5, 155, 037 ；5, 162, 222 ；EP 397,485)中描述的，它们全部通过引用结合在本文中，可以进行昆虫细胞的转化和在其中异源多肽的制备。用作宿主的昆虫细胞系可以适宜地为鳞翅目(L印idoptera)细胞系，如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)细胞(参考US5，077，214)。培养条件可以适宜地为，如在例如WO 89/01029或WO 89/01028，或者任何前述参考文献中中描述的。
[0172]之后在允许恶性疟原虫VAR2CSA多肽的表达的条件下在适合的营养培养基中培养上述转化或转染的宿主细胞，之后可以从培养物中回收全部或部分得到的肽。用于培养细胞的培养基可以是适用于使宿主细胞生长的任何常规培养基，如基本培养基或含有适当补充物的复合培养基。适合的培养基可从供应厂商获得或者可以根据公开的配方制备(例如，在美国模式培养物保藏中心的目录下的)。之后可以通过常规操作从培养基中回收由细胞产生的恶性疟原虫VAR2CSA多肽，所述操作包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，借助盐例如硫酸铵使上清液或滤液的蛋白质水性组分沉淀，通过多种层析操作纯化，例如离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等，这取决于所讨论的多肽的类型。
[0173]可以采用转基因动物技术制备本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽。优选的是在宿主雌性哺乳动物的乳腺内产生蛋白质。在乳腺中表达和随后向乳汁中的分泌目标蛋白，克服了许多从其他来源分离蛋白所遇到的困难。乳汁可以容易大量收集，并且是在生物化学上充分表征的。此外，主要的乳汁蛋白以高浓度存在于乳汁中(通常约I至15g/l)。
[0174]从商业观点来看，具有高乳汁产率的物种显然优选用作宿主。尽管可以使用较小的动物如小鼠和大鼠(并且在原理论证阶段是优选的)，但是优选的是使用家畜哺乳动物，包括，但不限于，猪、山羊、绵羊和牛。绵羊是特别优选的，这归因于先前在此物种中转基因的历史、乳汁产率、成本和用于收集绵羊乳汁设备的易得性的因素(关于影响宿主物种选择的因素的比较，参见，例如，WO 88/00239)。通常希望的是，选择用于产奶用途繁殖的一个品种的宿主动物，如东弗里斯兰(East Friesland)绵羊，或者通过在日后繁殖转基因品系而引入产奶家畜。在任何情况下，应该使用已知的、良好健康状态的动物。
[0175]为了获得在乳腺中的表达，使用来自乳汁蛋白基因的转录启动子。乳汁蛋白基因包括编码酪蛋白的那些基因(参见美国5，304，489)、β乳球蛋白、乳清蛋白、和乳清酸性蛋白。β乳球蛋白(BLG)启动子是优选的。在牛β乳球蛋白基因的情况中，通常将会使用基因的至少近端406bp的5’侧翼序列(flanking sequence)的区域，尽管至多约5kbp的较大部分的5’侧翼序列是优选的，如包含β乳球蛋白基因的5’侧翼启动子和非编码部分的约 4.25kbp DNA 区段(参见 Whitelaw 等人，B1chem.J.286:3139 (1992))。来自其他物种的启动子DNA的相似片段也是适合的。
[0176]也可以将β乳球蛋白基因的其他区域结合在构建体中，所要表达的基因的基因组区域也可以如此。在本领域中通常所接受的是，缺少内含子的构建体，例如，与含有这种DNA序列的那些相比表达得差(参见Brinster等人,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:836840(1988) ;Palmiter 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 88:478482(1991) ；Whitelaw等人，Transgenic Res.1:313(1991) ；W0 89/01343 ;以及WO 91/02318,其每一个通过引用结合在本文中)。就此而言，在可能的情况下，通常优选的是，使用含有编码目标蛋白质或多肽的基因的天然内含子中的全部或一些的基因组序列，因此进一步包含来自例如β乳球蛋白基因的至少一些内含子是优选的。一个这种区域是从牛β乳球蛋白基因的3’非编码区域开始的允许内含子剪接和RNA多聚腺苷酸化的DNA区段。当置换基因天然3’非编码序列时，这种牛β乳球蛋白区段可以同时增强和稳定目标蛋白质或多肽的表达水平。在其他实施方案内，VAR2CSA序列的起始ATG周围的区域被来自乳汁特异性蛋白基因的相应序列替换。这种替换提供了用于增强表达的推定的组织特异性起始环境。方便的是，用例如BLG基因的那些替换整个VAR2CSA前原和5’非编码序列，尽管可以替换较小的区域。
[0177]对于在转基因动物中根据本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽的表达来说，编码VAR2CSA的DNA区段可操作地连接至其表达所需的另外的DNA区段以产生表达单元。这种另外的区段包括上述启动子，以及允许转录终止和mRNA的多聚腺苷酸化的序列。表达单元还将包括可操作地连接至编码修饰VAR2CSA的区段的编码分泌信号序列的DNA区段。分泌信号序列可以是天然分泌信号序列，或者可以是另一种蛋白质如乳汁蛋白的序列(参见，例如，von Heijne, Nucl.Acids Res.14:46834690 (1986);以及 Meade 等人，U.S.4，873，316，其通过引用结合在本文中)。
[0178]通过将VAR2CSA序列插入至含有另外的DNA区段的质粒或噬菌体载体中，方便地进行用于转基因动物的表达单元的构建，尽管可以通过基本上任何连接的序列构建表达单元。特别方便的是，提供含有编码乳汁蛋白的DNA区段的载体以及将用于乳汁蛋白的编码序列替换为VAR2CSA变体的编码序列；从而创建包含乳汁蛋白基因的表达控制序列的基因融合。在任何情况下，质粒或其他载体中表达单元的克隆均有助于VAR2CSA序列的扩增。方便地在细菌(例如大肠杆菌)宿主细胞中进行扩增，因此载体通常将会包含复制起点和在细菌宿主细胞中起作用的可选择标记。之后将表达单元引入至所选择的宿主物种的受精卵中(包括早期胚胎)。可以通过多种途径中的一种完成异源DNA的引入，所述途径包括显微注射(例如美国专利号4，873，191)、逆转录病毒感染(Jaenisch, Science 240:14681474(1988))或者利用胚胎干(ES)细胞的定点整合(由Bradley等人综述，B1/Technology 10:534539 (1992))。之后将卵植入假孕雌性的输卵管或子宫中，并且使其发育足月。其种系中携带所引入的DNA的后代可以以正常的孟德尔遗传方式(Mendelian fash1n)将该DNA传递给后代，允许转基因畜群的发展。用于产生转基因动物的一般操作在本领域中是已知的(参见，例如，Hogan等人，Manipulatingthe Mouse Embryo: A Laboratory Manual (小鼠胚胎操作:实验室手册)，Cold SpringHarbor Laboratory (冷泉港实验室)，1986 ；Simons 等人，B1/Technology 6:179183(1988) ;Wall 等人，B1l.Reprod.32:645 651(1985) ;Buhler 等人，B1/Technology8:140143 (1990) ；Ebert 等人，B1/Technology 9:835 838(1991) ；Krimpenfort 等人，B1/Technology 9:844 847(1991) ;Wall 等人，J.Cell.B1chem.49:113120 (1992)；U.S.4, 873, 191 ；U.S.4, 873, 316 ；W0 88/00239, WO 90/05188, WO 92/11757 ；以及 GB87/00458)。最初在小鼠中发展了用于将外部DNA序列引入至哺乳动物及其生殖细胞中的技术(参见，例如，Gordon 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 77:7380 7384(1980)；Gordon 和 Ruddle, Science214:1244 1246(1981) ；Palmiter 和 Brinster,Cell (细胞)41:343345(1985) ;Brinster 等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 82:4438 4442(1985)；以及Hogan等人(ibid.))。这些技术随后适用于较大的动物，包括家畜物种(参见，例如，WO 88/00239, WO 90/05188，和 WO 92/11757 ；和 Simons 等人,B1/Technology6:179183(1988))。综上所述，在至今用于产生转基因小鼠或家畜的最有效的途径中，根据已建立的技术，将数百个目标DNA的直链分子注射至受精卵的原核(pro nuclei)之一中。还可以采用将DNA注射至受精卵的细胞质中。
[0179]还可以采用在转基因植物中制备。表达可以推广至或针对特定的器官，如块莖(参见，Hiatt, Nature (自然)344:469 479 (1990) ；Edelbaum 等人，J.1nterferonRes.12:449 453(1992) ；Sijmons 等人，B1/Technology 8:217221(1990);以及 EP0255378)。
[0180]VAR2CSA 纯化
[0181]可以从细胞培养基或乳汁中回收本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽。可以通过本领域中已知的多种操作来纯化本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽，所述操作包括，但不限于，层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦、和尺寸排阻)、电泳操作(例如，制备型等电点聚焦(IEF)、差异溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、或萃取(参见，例如，ProteinPurificat1n (蛋白质纯化)，J.-C.Janson 和 Lars Ryden 编，VCH Publishers, NewYork, 1989)。优选地，可以通过在抗VAR2CSA抗体柱上亲和层析将其纯化。可以通过常规化学纯化工具，如高效液相色谱，完成额外的纯化。包括柠檬酸钡沉淀在内的其他纯化方法在本领域中是已知的，并且可以应用于在本文中所描述的新型VAR2CSA多肽和其他多肽的纯化(参见，例如，Scopes, R., Protein Purificat1n(蛋白质纯化)，Springer-Verlag, N.Y.，1982)。
[0182]出于治疗目的，优选的是，本发明的VAR2CSA多肽和其他多肽是基本上纯的。因此，在本发明的优选实施方案中，本发明的多肽和其他多肽被纯化为至少约90至95 %的同质性，优选为至少约98%的同质性。可以通过例如凝胶电泳和氨基末端氨基酸测序来评估纯度。
[0183]术语“分离的多肽”是指本发明的多肽，其⑴已经与至少约50%的与其自然相关的多核苷酸、脂质、碳水化合物或其他物质(即，污染物)分离。优选地，分离的多肽基本不含任何其他在自然环境中发现的污染多肽或其他污染物，它们会干扰分离多肽的治疗、诊断、预防或研究用途。
[0184]如在本文中所使用的术语“微生物”是指细菌、真菌、古生菌、原生生物；显微植物和动物(如绿藻或浮游生物)、三肠虫(planarian)和变形虫(amoeba)。包括在此定义内的是致病微生物。
[0185]施用与药物组合物
[0186]组合治疗
[0187]如在本说明书中定义的VAR2CSA多肽、衍生物、或缀合物可以与一种或多种其他癌症药物同时或顺序施用，和/或用于与其他已知的疗法的组合治疗中。因子可以以单一剂型提供，其中单一剂型含有两种化合物，或者以多部件试剂盒的形式提供，所述试剂盒包括作为第一单位剂型的VAR2CSA多肽制剂以及作为第二单位剂型的一种或多种其他化合物的制剂。无论是第一或第二或第三等，在整个说明书中所提及的单位剂量不表示施用的优先顺序，而仅是为了方便的目的。
[0188]可以与VAR2CSA多肽组合使用的适合的其他癌症药物或疗法包括已经上市面上存在的或在开发中的抗体，包括威罗菲尼(Vemurafenib) (Hoffmann - La Roche)、针对MCSP的人单克隆抗体、使用BiTE抗体平台技术的治疗性抗MCSP(Micromet Inc)、以及具有对MCSP的特异性的细胞毒性T细胞的过继转移(Adoptive transfer)。
[0189]VAR2CSA多肽的制剂和一种或多种其他化合物的制剂的“同时”给药，意指以单一剂型施用化合物，或者施用第一药剂，接着以不多于15分钟、优选10、更优选的5、更优选的2分钟的时间间隔施用第二药剂。可以首先施用任一因子。
[0190]“顺序”给药，意指施用第一药剂，接着以多于15分钟的时间间隔施用第二药剂。可以首先施用两种单位剂型中的任意一个。优选地，经由相同的静脉内途径注射两种产品。
[0191]本发明的另一个目标是提供包含VAR2CSA多肽的药物制剂，VAR2CSA多肽以Omg/ml至lmg/ml的血清/血浆浓度存在，并且其中制剂具有2.0至10.0的pH。制剂还可以包含缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张度剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一些实施方案中，药物制剂是水性制剂，即包含水的制剂。这种制剂通常是溶液剂或混悬剂。在本发明的另一个实施方案中，药物制剂是水溶液。术语“水性制剂”被定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样地，术语“水溶液”被定义为包含至少50% w/w水的溶液，并且术语“水性混悬剂”被定义为包含至少50% w/w水的混悬剂。
[0192]在其它实施方案中，药物制剂是冻干剂，医师或患者在使用前向其中加入溶剂和/或稀释剂。
[0193]在其它实施方案中，药物制剂是随时使用而不需要事先溶解的干剂(例如冷冻干燥的或喷雾干燥的)。
[0194]在另一个方面中，本发明涉及包含VAR2CSA多肽的水溶液和缓冲液的药物制剂，其中VAR2CSA多肽以Ο-lmg/ml以上的血清/血浆浓度存在，并且其中制剂具有约2.0至约10.0 的 pH。
[0195]在本发明的其他实施方案中，制剂的pH选自由以下组成的列表:2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、
4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、
6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、
8.0 λ 8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、
9.9、和 10.00
[0196]在本发明的另一个实施方案中，缓冲液选自由以下组成的组:乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、双甘氨肽、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、和三(羟甲基)_氨基甲烷、二羟乙基甘氨酸(bicine)、三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲液中的每一个构成了本发明的备选实施方案。
[0197]在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含药用防腐剂。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂选自由以下组成的组:苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苄醇、氯丁醇、和硫柳萊(th1merosal)、溴硝醇(bronopol)、苯甲酸、伊咪脲(imidurea)、氯己唆(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酹、对轻基苯甲酸乙酯、节索氯铵(benzethoniumchloride)、氯苯甘醚(chlorphenesine) (3对氯苯氧基丙烧_1，2_ 二醇)或其混合物。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以0.lmg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以0.lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂以10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些特定防腐剂中的每一个构成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中使用防腐剂对技术人员来说是公知的。为了方便,参考Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy(雷明顿:药物科学与实践)，第19版，1995。
[0198]在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含等渗剂。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂选自由以下组成的组:盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、多元醇(alditol)(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(I, 2-propaned1l、propyleneglycol)、I, 3-丙二醇、I, 3- 丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物。可以使用任何糖，如单糖、二糖、或多糖、或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、右旋糖苷、普鲁兰、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素钠。在一些实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇被定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括，例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、甜醇(dulcitol)、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一些实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上述糖或糖醇可以独立或组合使用。对于所使用的量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中可溶并且不对使用本发明的方法获得的稳定效果造成负面影响即可。在一些实施方案中，糖或糖醇浓度在约lmg/ml至约150mg/ml之间。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以lmg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以lmg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂以25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些特定等渗剂中的每一个构成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中使用等渗剂对技术人员来说是公知的。为了方便,参考Remington:TheScience and Practice of Pharmacy (雷明顿:药物科学与实践)，第 19 版，1995。
[0199]在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)盐、柠檬酸盐和天冬氨酸盐、和它们的混合物。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以0.lmg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以0.lmg/ml至2mg/ml的浓度存在。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂以2mg/ml至5mg/ml的浓度存在。这些特定螯合剂中的每一个构成了本发明的备选实施方案。在药物组合物中使用螯合剂对技术人员来说是公知的。为了方便,参考Remington:TheScience and Practice of Pharmacy (雷明顿:药物科学与实践)，第 19 版，1995。
[0200]在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含稳定剂。在药物组合物中使用稳定剂对技术人员来说是公知的。为了方便，参考Remington:The Science and Practice ofPharmacy (雷明顿:药物科学与实践)，第19版，1995。
[0201]更具体地，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性组分包含多肽，该多肽可以在液体药物制剂中储存期间展现出聚集体形成。通过“聚集体形成”，意指多肽分子之间的物理相互作用，其引起可以保持可溶的低聚物的或者从溶液中沉淀的大的可见聚集体的形成。通过“储存期间”，意指当制备液体药物组合物或制剂时，不立刻施用于受试者。相反，在制备后，将其包装用于以液体形式、或以冷冻状态、或以干燥形式储存，以用于稍后重构为适用于施用于受试者的液体形式或其他形式。通过“干燥形式”，意指液体药物组合物或制剂通过下列方式干燥:冷冻干燥(即，冻干(Iyophilizat1n)；参见，例如，Williams 和 Polli (1984) J.Parenteral Sc1.Technol.38:48-59)、喷雾干燥(参见 Masters (1991)在 Spray-Drying Handbook (喷雾干燥手册)中(5th ed ；LongmanScientific&Technical, Essez, U.Κ.), pp.491-676 ；Broadhead 等人(1992) Drug Devel.1nd.Pharm.18:1169-1206 ;以及 Mumenthaler 等人(1994) Pharm.Res.11:12-20)、或空气干燥(Carpenter 和 Crowe (1988) Cryob1logy (低温生物学)25:459-470 ；以及 Roser (1991)B1pharm.4:47-53)。归因于液体药物组合物储存期间的多肽的聚集体形成可能会对所述多肽的生物活性造成负面影响，导致药物组合物的治疗功效的损失。此外，聚集体形成可能会引起其他问题，如当使用输注系统施用含多肽的药物组合物时管道、膜、或泵的堵塞。
[0202]本发明的药物组合物还可以包含足以降低归因于组合物储存期间的多肽的聚集体形成的量的氨基酸碱(amino acid base)。通过“氨基酸碱”，意指氨基酸或氨基酸的组合，其中任何给定的氨基酸以其游离碱的形式或以其盐的形式存在。在使用氨基酸的组合的情况下，全部氨基酸都可以以其游离碱的形式存在，全部都可以以其盐的形式存在，或者一些可以以其游离碱的形式存在而其他以其盐的形式存在。在一些实施方案中，用于制备本发明的组合物的氨基酸是携带带电侧链的那些，如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。特定氨基酸(例如甘氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸及其混合物)的任何立体异构体(即，L、D、或DL异构体)或者这些立体异构体的组合，可以存在于本发明的药物组合物中，只要特定氨基酸以其游离碱的形式或其盐的形式存在即可。在一些实施方案中，使用L-立体异构体。还可以用这些氨基酸的类似物配制本发明的组合物。通过“氨基酸类似物”，意指产生减少归因于本发明的液体药物组合物储存期间的多肽的聚集体形成的所需效果的天然存在的氨基酸的衍生物。适合的精氨酸类似物包括，例如，氨基胍、鸟氨酸和N-单乙基L-精氨酸，适合的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸，并且适合的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L半胱氨酸。对于其他氨基酸来说，将氨基酸类似物以其游离碱的形式或其盐的形式结合至组合物中。在本发明的另一个实施方案中，以足以防止或延缓蛋白质的聚集的浓度使用氨基酸或氨基酸类似物。
[0203]在本发明的另一个实施方案中，当充当治疗剂的多肽是包含至少一个对氧化敏感的甲硫氨酸残基的多肽时，可以加入甲硫氨酸(或其他含硫氨基酸或氨基酸类似物)以抑制甲硫氨酸残基氧化为甲硫氨酸亚砜。通过“抑制”，意指甲硫氨酸氧化物种随时间的最小累积。抑制甲硫氨酸氧化的结果是更多地保留在其适当的分子形式下的多肽。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L、D、或DL异构体)或它们的组合。所要加入的量应该是足以抑制甲硫氨酸残基的氧化从而使甲硫氨酸亚砜的量是管理机构可接受的量。通常，这意味着，组合物含有不多于约10%至约30%的甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过加入使得加入至甲硫氨酸残基的甲硫氨酸范围为约1:1至约1000:1如10:1至约100:1的甲硫氨酸实现。
[0204]在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含选自高分子量聚合物或低分子化合物的组的稳定剂。在本发明的另一个实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG 3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L和HPMC)、环糊精、含硫物质如单硫代甘油、硫代乙醇酸和2-甲基硫代乙醇、以及不同的盐(例如氯化钠)。这些特定稳定剂中的每一个构成了本发明的备选实施方案。
[0205]药物组合物还可以包含额外的稳定剂，其进一步增强在其中的治疗活性多肽的稳定性。本发明特别感兴趣的稳定剂包括，但不限于，甲硫氨酸和EDTA，其保护多肽不受甲硫氨酸氧化影响，以及非离子表面活性剂，其保护多肽不受与冻融或机械剪切相关的聚集的影响。
[0206]在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方案中，表面活性剂选自洗涤剂、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化甘油酯、乙酰化单甘油酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧亚乙基嵌段聚合物(例如泊洛沙姆(poloxamer)如
Pluronicu F68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、
聚氧乙烯和聚乙烯衍生物如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温，例如吐温-20、吐温-40、吐温-80和Brij-35)、单甘油酯或其乙氧基化衍生物、二甘油酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素和磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕榈酰基磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕榈酰基溶血磷脂酰-L-丝氨酸以及乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)以及溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)衍生物，例如溶血磷脂酰胆碱的月桂酰基和肉豆蘧酰基衍生物、二棕榈酰磷脂酰胆碱、和极性头基团(即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇)的修饰物，和带正电的DODAC、DOTMA, DCP、BISHOP、溶血磷脂酰丝氨酸和溶血磷脂酰苏氨酸、和甘油磷脂(例如脑磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃型半乳糖苷)、鞘糖脂(例如神经酰胺、神经节苷脂)、十二烷基磷酸胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂、夫西地酸衍生物(例如牛磺二氢夫西地酸钠等)、长链脂肪酸及其C6-C12(例如油酸和辛酸)盐、酰基肉碱及衍生物、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的N°-酰化衍生物、赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸和中性或酸性氨基酸的任何组合的二肽的N°-酰化衍生物、包含中性氨基酸和两个带电氨基酸的任何组合的三肽的N°-酰化衍生物、DSS(多库酯钠，CAS登记号[577-11-7])、多库酯钙，CAS登记号[128-49-4])、多库酯钾，CAS登记号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊脱氧胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、N-十六烷基-N，N- 二甲基-3-氨溶基(amm0ni0)-l-丙磺酸盐、阴离子(烷基-芳基-磺酸盐类)一价表面活性剂、两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N- 二甲基氨溶基-1-丙磺酸盐、3-氯酰氨基-1-丙基二甲基氨溶基-1-丙磺酸盐、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如溴化十六烷基三甲铵、氯化十六烷基吡啶)、非离子型表面活性剂(例如十二烷基β -D-吡喃葡萄糖苷)、poloxamine (例如Tetronic's)，其为衍生自依次将环氧丙烷和环氧乙烷加成至乙二胺的四官能嵌段共聚物，或者所述表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物或其混合物。这些特定表面活性剂中的每一个构成了本发明的备选实施方案。
[0207]在药物组合物中使用表面活性剂对技术人员来说是公知的。为了方便，参考Remington:The Science and Practice of Pharmacy (雷明顿:药物科学与实践)，第 19版，1995。
[0208]可能的是，在本发明的肽药物制剂中可以存在其他成分。这种额外成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张度改性剂、螯合剂、金属离子、油脂载体、蛋白(例如人血清白蛋白、明胶或蛋白类)和两性离子(例如，氨基酸，如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。所述另外的成分无疑不应对本发明药物制剂的整体稳定性造成负面影响。
[0209]含有根据本发明的VAR2CSA多肽的药物组合物可以在多种部位施用于需要这种治疗的患者，例如在局部部位，例如皮肤和粘膜部位，在旁路吸收部位，例如施用于动脉中、静脉中、心脏中，和在涉及吸收的部位，例如施用于皮内、皮下、肌内或腹内。
[0210]在与局部炎症有关的病症的治疗中，如在与烧伤有关的炎症或者与皮肤有关的其他病症的治疗中，局部施用可以是特别的优势。因此，在一些实施方案中，施用是通过局部施用。
[0211]在一些具体的实施方案中，在与眼睛有关的病症中，如角膜炎，如弥漫性板层角膜炎(diffuse lamellar keratitis, DLK),可以使用滴眼液。
[0212]根据本发明的药物组合物的向需要这种治疗的患者的施用可以经由多种施用途径，例如，舌部、舌下、含服、口腔内、口服、胃肠内、鼻部、肺部例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮、皮肤、经皮、阴道、直肠、眼部，例如经由结膜、输尿管和胃肠外。
[0213]可以以多种剂型施用本发明的组合物，例如作为溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合型乳齐?、泡沫齐?、药膏、糊齐?、硬膏、软膏、片齐?、包衣片齐?、冲洗齐?、胶囊例如硬胶囊和软胶囊、栓剂、直肠用胶囊、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气雾剂、吸人剂、滴眼剂、眼用软膏、眼用冲洗剂、阴道栓剂、阴道环、阴道软膏、注射液、原位转化溶液剂例如原位胶凝剂、原位沉降齐U、原位沉淀剂、原位结晶剂、输注液、和植入物。
[0214]本发明的组合物可以进一步例如通过共价、疏水和静电相互作用复合或连接至药物载体、药物递送系统和高级药物递送系统，以便进一步增强VAR2CSA多肽的稳定性、提高生物利用度、增大溶解度、减少不良作用、实现本领域技术人员所公知的时辰疗法和提高患者顺应性或其任何组合。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括，但不限于，聚合物例如纤维素及衍生物、多糖例如葡聚糖及衍生物、淀粉及衍生物、聚(乙烯醇)、丙烯酸酯聚合物和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白例如白蛋白、凝胶例如热胶凝体系，例如本领域技术人员公知的嵌段共聚物体系、胶束、脂质体、微球、纳米颗粒、病毒状颗粒、细菌状颗粒、液晶及其分散体、脂质-水体系中相特性领域的技术人员公知的L2相及其分散体、聚合胶束、复合型乳剂、自乳化、自微乳化、环糊精及其衍生物，以及树枝状大分子(dendrimer)。
[0215]本发明的组合物可以用于配制用于肺部施用VAR2CSA多肽的固体制剂、半固体制齐?、散剂和溶液剂，肺部施用使用例如定量吸入器、干粉吸入器和喷雾器，所有这些装置都为本领域技术人员所公知。
[0216]本发明的组合物尤其可用于配制受控释放、持续释放、延释、阻释和缓释的药物递送系统。更具体地，但不限于，组合物可用于配制本领域技术人员所公知的肠胃外受控释放系统和缓释系统(两种系统均导致施用次数减少许多倍)。甚至更优选的是，受控释放系统和缓释系统经皮下施用。在不限制本发明范围下，可用的受控释放系统和组合物的实例为水凝胶、油凝胶、液晶、聚合胶束、微球和纳米颗粒。
[0217]制备可用于本发明组合物的受控释放系统的方法包括但不限于:结晶、冷凝、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀浆化、包囊化、喷雾干燥、微胶囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以制备微球、挤压和超临界流体法。一般参考Handbook of PharmaceuticalControlled Release (药物受受控释放放手册)(Wise, D.L., ed.Marcel Dekker, NewYork, 2000)和 Drug and the Pharmaceutical Sciences (药物与药物科学)vol.99:Protein Formulat1n and Delivery (蛋白制剂与递送)(MacNally, E.J.，ed.Marcel Dekker, New York, 2000)。
[0218]肠胃外施用可以通过注射器、任选笔形注射器经皮下注射、肌内注射、腹膜内注射或静脉内注射来进行。备选地，肠胃外施用可以借助输液泵进行。另一个可选方案为以下组合物:其可以是鼻用喷雾或肺部喷雾形式施用VAR2CSA多肽的溶液剂或混悬剂。作为又一个可选方案，含有本发明VAR2CSA多肽的药物组合物还可以适用于经皮施用，例如通过无针注射或贴剂(任选离子电渗贴剂)来进行，或经粘膜例如含服施用。
[0219]术语“稳定制剂”是指物理稳定性增力口、化学稳定性增加或物理和化学稳定性增加的制剂。
[0220]如在本文中所使用的术语蛋白制剂的“物理稳定性”是指由于蛋白暴露至热-机械应力和/或与失稳的界面和表面(例如疏水表面和界面)的相互作用，所述蛋白形成蛋白的生物失活和/或不溶性聚集体的趋势。在将装于合适的容器(例如药筒或小瓶)中的制剂于不同温度下暴露于机械/物理应力(例如搅拌)中达各种时期后，通过目视检查和/或浊度测定评估水性蛋白制剂的物理稳定性。制剂的目视检查在黑暗背景下于聚焦强光中进行。制剂的浊度通过将浊度分级为例如O至3等级的目视评分来表征(未呈现混浊的制剂对应于目视评分O，而在日光中呈现可视混浊的制剂对应于目视评分3)。当其在日光中呈现可视混浊时，将制剂分级为相对于蛋白聚集的物理不稳定。备选地，可通过技术人员公知的简易浊度测量来评估制剂的浊度。水性蛋白制剂的物理稳定性还可通过使用蛋白构象状态的光谱剂或光谱探针来评估。探针优选为优先结合至蛋白的非天然构象异构体的小分子。蛋白结构的小分子光谱探针的一个实例为硫磺素(th1flavin)T。硫磺素T为已广泛用于检测淀粉状原纤维的荧光染料。在存在原纤维以及也可能的其它蛋白构型下，当结合至原纤维蛋白形式时硫磺素T在约450nm下产生新的激发极值并在约482nm下发射增强。未结合的硫磺素T在所述波长下基本无荧光。
[0221]其它小分子可用作蛋白结构从天然状态向非天然状态变化的探针。例如优先结合至蛋白的外露疏水片(hydrophobic patch)的“疏水片”探针。疏水片通常埋藏于处于其天然状态的蛋白三级结构之内，但随着蛋白开始解折叠或变性而暴露。这些小分子光谱探针的实例为芳族疏水染料，例如蒽、吖啶、菲咯啉等。其它光谱探针为金属-氨基酸络合物，例如疏水氨基酸(例如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸和缬氨酸)的钴金属络合物坐寸ο
[0222]如在本文中所使用的蛋白制剂的术语“化学稳定性”是指蛋白结构的化学共价变化，所述变化导致形成与天然蛋白结构相比具有潜在较小生物潜能和/或潜在增加的免疫原性的化学降解产物。根据天然蛋白的类型和性质以及所述蛋白所暴露的环境，可形成各种化学降解产物。如本领域技术人员所公知，几乎不可能完全避免化学降解的消除，并且在储存和使用蛋白制剂期间常常见到化学降解产物的量不断增加。多数蛋白容易发生脱酰胺作用，其中谷氨酰胺酰或天冬酰胺酰残基的侧链酰胺基被水解而形成游离羧酸的过程。其它降解途径涉及高分子量转化产物的形成，其中两个或更多个蛋白分子通过转酰胺基作用和/或二硫化物相互作用相互共价结合，导致形成共价结合的二聚体、寡聚体和多聚体降解产物(Stability of Protein Pharmaceuticals (蛋白质药物的稳定性)，Ahern.T.J.和Manning M.C., Plenum Press, New York 1992)。可以提及氧化(例如甲硫氨酸残基的氧化)作为化学降解的另一种变体。可通过在暴露至不同环境条件(可通常通过例如增加温度来加速降解产物的形成)下之后的各个时间点测量化学降解产物的量，来评估蛋白制剂的化学稳定性。通常通过利用各种色谱技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)根据分子大小和/或电荷，将降解产物分离来测量各种降解产物的量。
[0223]因此，如上文所概述，“稳定化制剂”是指物理稳定性增加、化学稳定性增加或物理和化学稳定性增加的制剂。通常，在使用和储存(依照推荐的使用和储存条件)期间制剂必须稳定直至达到失效期。
[0224]在本发明的一些实施方案中，包含VAR2CSA多肽的药物制剂对于超过6周的使用和超过3年的储存是稳定的。在本发明的其它实施方案中，包含VAR2CSA多肽的药物制剂对于超过4周的使用和超过3年的储存是稳定的。在本发明的另一个实施方案中，包含VAR2CSA多肽的药物制剂对于超过4周的使用和超过两年的储存是稳定的。在本发明的再另一个实施方案中，包含VAR2CSA多肽的药物制剂对于超过2周的使用和超过两年的储存是稳定的。
[0225]使用VAR2CSA多肽及其缀合物的适应证
[0226]VAR2CSA多肽或其缀合物可以用于大范围与CSA的表达、如不适当的表达有关的适应证，如在各种癌症中，如转移癌，包括黑素瘤(melanomas)，如C32黑素瘤、肉瘤(sarcomas)、肺癌(lung carcinomas)、寡树突细胞瘤(oligodendrocytomas)、人脑肿瘤，包括胶质瘤(gl1mas)、白血病(leukaemia),如成淋巴细胞性白血病(lymphoblasticleukemia)和急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia)、和癌(carcinoma),如鱗状细胞癌(squamous cell carcinomas)和乳腺癌(breast carcinomas)、肾细胞癌(renalcell carcinomas)、软骨肉瘤(chondrosarcomas)、和膜腺细胞癌(pancreatic cellcarcinomas) JAR2CSA多肽或其缀合物还可以用于癌干细胞并且因此在发展为癌症之前靶向细胞。与CSA的表达、如不适当表达相关的其他病症是软骨和/或疤痕组织发展的病症。
[0227]VAR2CSA多肽或其缀合物可以用于鉴别、示踪和靶向体内远距离的微转移(micro-metastasis)。基本上全部主要的肿瘤,包括造血系统的癌症,具有发展为转移性疾病的可能性，这与患者的差的治疗效果高度相关。
[0228]VAR2CSA多肽或其缀合物可以用于将防止细胞外CSPG降解或修复细胞外CSPG的化合物，如生长激素、抗炎化合物或蛋白质抑制剂，靶向至软骨组织、关节、和神经组织。
[0229]VAR2CSA多肽或其缀合物可以用于靶向提高细胞外CSPG的降解或防止其产生的化合物，如软骨素酶ABC，其切断CSPG分子的蛋白核心的糖链。木糖苷(xylocide)，其减少CSPG的产生，或者抑制对CSPG产生重要的酶的药物如软骨素合酶或软骨素聚合因子(如4-氟代-葡糖胺、对硝基苯基-β -D-木糖苷、4-甲基-伞形酮酰-β -D-吡喃木糖苷)，从而破坏神经组织。
[0230]与核酸缀合的VAR2CSA可以用于移除编码CSA呈递分子的RNA，核酸包括小干扰RNA(siRNA)、反义肽核酸(PNA)、小发夹RNA(shRNA)和锁核酸(LNA?)。
[0231]VAR2CSA多肽的缀合物
[0232]治疗或诊断效应部分，如细胞毒性和检测部分
[0233]在本发明的一些方面中，提供如在本公开内容中定义的VAR2CSA多肽、融合蛋白或缀合物，还包含治疗效应部分，如抗炎药、类固醇激素、细胞毒性或检测剂或部分，如有机分子、放射性核素、或细胞毒性酶。
[0234]在本发明的一些方面中，根据本发明的VAR2CSA多肽或VAR2CSA融合蛋白包含如由选自SEQ ID NO 57-59、和71的一个或多个序列或其功能变体或片段所定义的序列。
[0235]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA多肽或VAR2CSA融合蛋白可以在末端，如蛋白序列(如由SEQ ID Ν0:57所定义的序列)的N末端，包含蛋白酶抑制剂，如碱性胰蛋白酶抑制剂(BPTI)。
[0236]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA多肽或VAR2CSA融合蛋白可以包含毒素蛋白序列，如由选自SEQ ID NO 58、59和71的一个或多个序列所定义的序列，如被优化以使免疫原性变低的毒素蛋白序列，如由SEQ ID Ν0:59所定义的序列。在一些实施方案中，在根据本发明的VAR2CSA融合蛋白中存在SEQ ID NO 58或59的信号序列KDEL，并且在一些实施方案中，在根据本发明的VAR2CSA融合蛋白中不存在SEQ ID NO 58或59的信号序列KDEL。因此，对于根据本发明的构建体来说，信号序列KDEL可以是任选的。
[0237]可以与根据本发明的VAR2CSA多肽融合或缀合的细胞毒性部分的非限制性实例是选自以下的适用于癌症治疗的化疗药物:剌孢霉素(calicheamycin)、顺钼(cisplatin)、阿霉素(adriamycin)、耳他汀(auristatin)、多柔比星(doxorubicin)、美坦生类化合物(maytansinoid)、紫杉醇(taxol)、海鞘素(ecteinascidin)、格尔德霉素(geldanamycin)、甲氨蝶呤(methotrexate)及其衍生物、及其组合等。与VAR2CSA多肽融合的细胞毒性蛋白的实例是假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin) A、白喉毒素(diphtheria toxin)、菌麻毒蛋白毒素(ricin toxin)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweedantiviral protein)、肥阜草毒蛋白(saporin)、白树毒蛋白(gelonin)及其变体。
[0238]已经描述了用于癌症的白蛋白与多柔比星(doxorubicin)的缀合物(Kratz等人，J Med Chem 45: 5523-33，2002)以及用于类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)的甲氨蝶呤(metotrexate) (Wunder 等人，J Immunol 170:4793-4801，2003) ?也已经描述了增加反应性氧物种的化合物，即荜发酰胺(piperlongumine) (Raj等人，Nature(自然)475:231-234，2011)。而且，可以使用诱导细胞凋亡等从而提供靶向细胞毒性(即肿瘤细胞的杀伤)的治疗性酶、试剂。
[0239]通过诱导补体依赖性细胞毒性(CDC)介导的溶解(lysis)、抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)介导的溶解、细胞凋亡、同型粘附、和/或吞嗷作用(phagocytosis)，如通过诱导CDC介导的溶解和/或ADCC介导的溶解，在本文中所描述的VAR2CSA多肽可以介导细胞的杀伤。在本文中所描述的VAR2CSA多肽可以与免疫系统的组分相互作用，优选通过ADCC或CDC。然而，本发明的VAR2CSA多肽还可以简单地通过与细胞表面上的肿瘤抗原结合而发挥作用，因此，例如阻断细胞的增殖。
[0240]根据本发明，术语“治疗效应部分”意指可以发挥治疗效果的任何分子。根据本发明，优选地，治疗效应分子被选择性地引导至表达CSA的细胞，并且包括抗癌药、放射性同位素、毒素、细胞生长抑制或细胞溶解药物等。抗癌药包括，例如，蒽环类(多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone))，钼基和非钼基焼基化试剂(顺钼(cisplatin)、卡钼(carboplatin)、奥沙利钼(oxaliplatin)、氮芥(mechlorethamine)、环憐酸胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、异环磷酰胺(ifosfamide)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、洛莫司汀(1mustine)、丙卡巴餅(procarbazine))，长春花属生物碱类(Vinca alkaloid)(长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春地辛(vindesine))，紫杉焼类(taxane)(紫杉醇(taxol)和西紫杉醇(decetaxel))，拓扑异构酶I抑制剂(topoisomerase I inhibitor)(喜树减(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)、托泊替康(topotecan))，拓扑异构酶II抑制剂(topoisomerase II inhibitor)(安卩丫卩定(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、憐酸依托泊苷(etoposide phosphate)、替尼泊苷(teniposide)和美国鬼臼属植物(Mayapple)(盾叶鬼臼(Podophyllum peltatum))根中自然存在的其他生物碱衍生物，非蒽环细胞毒性抗生素(放线菌素D(dactinomycin)、博来霉素(bleomycin)、普卡霉素(plicamycin)和丝裂霉素(mitomycin)),抗类固醇类(ant1-steroid)(如氨鲁米特(aminoglutethimide)),核苷类似物(阿糖胞苷(cytarabidine)、氟尿喃唳(f Iuorouracil)和氟尿B密P定(mercaptopurine)),抗代谢药(antimetabolite)(甲氨蝶呤(methotrexate)和硫鸟嘌呤(th1guanine)), 二氯二苯基三氯乙烧类似物(如米托坦(mitotane)),以及诱导反应性氧物种(ROS)的化合物(包括但不限于荜发酰胺(piperlongumine)和异硫氰酸β-苯基乙酷)。其他抗癌药描述于，例如，Goodman和Gilman, “Pharmacological Basis ofTherapeutics (治疗的药理学基础)”，第8版，I99O1McGraw-Hill, Inc.，尤其是第52章(Antineoplastic Agents (抗肿瘤药)(Paul Calabresi 和 Bruce A.Chabner)。毒素可以是蛋白质，如美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、霍乱毒素(cholera toxin)、百日咳毒素(pertussis toxin)、蓖麻毒蛋白(ricin)、白树毒蛋白(gelonin)、相思豆毒蛋白(abrin)、白喉外毒素(diphtheria exotoxin)或假单胞菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)。毒素残基还可以是高能发射放射性核素如钴-60。VAR2CSA多肽可以与细胞穿透肽(CPP) —起使用，以促进VAR2CSA多肽和任何与其连接的分子横跨细胞质膜的运输。已经发现细胞穿透肽具有许多在药物中作为在不同疾病的治疗中的药物递送剂(包括癌抑制剂和病毒抑制剂)的用途。CPP的实例包括但不限于:来自人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus)的反式激活转录活化剂(Tat) ；pep-l (Char1tTM)；R8、偶氮-R8 ;SMoC。(Okuyama M 等人，Nat Methods.2007 Feb ；4(2): 153-9M ；Soane L 和Fiskum GJ Neurochem.20050ct ；95(1):230-43 ；Loudet A 等人，0rg B1mol Chem.2008Dec21 ；6(24):4516-22)。
[0241]放射性核素
[0242]与聚氨基聚羧酸酯螯合剂偶联的根据在本文中所描述的方面的VAR2CSA多肽、融合蛋白或缀合物可以用于提供由放射性螯合物组成的放射性标记的多肽，所述放射性螯合物具有与螯合剂偶联的VAR2CSA多肽、融合蛋白或缀合物以及适用于医学成像的放射性核素，所述放射性核素选自由下列各项组成的组:61CU、64CU、66Ga、67Ga、68Ga、n°In、mln、44SC、89Zr和86Y,或者具有适用于治疗的放射性核素，所述放射性核素选自由下列各项组成的组:225Ac、212B1、213B1、67CU、166H0、mLU、212Pb、149Pm、153Sm、227Th 和 9°Y，其中放射性核素与 VAR2CSA 多肽复合，如通过螯合剂。
[0243]因此，根据在本文中所描述的方面的VAR2CSA多肽、融合蛋白或缀合物可以用于包括实体瘤或转移在内的癌细胞的放射成像，如在黑素瘤患者中。
[0244]在其实施方案中，也可以使用通常所说的间接标记使多肽被非金属放射性同位素放射性标记。因此，对于用例如18F、76Br、不同的碘同位素和211At标记来说，中间“连接分子”用于标记。这种连接分子应该含有两个功能部分，一个提供快速且有效的放射性标记，而另一个实现快速且有效的与蛋白质的偶联，例如与胺基偶联，或者优选与独特半胱氨酸的硫醇基偶联。例如，一个马来酰亚胺基与硫基反应形成一个稳定的硫醚键。“连接分子”可以首先与放射性标记反应，并且随后与蛋白质的巯基或硒代巯基(selenoth1l group)反应。
[0245]其他备选的检测部分包括荧光团或荧光染料，如选自下列各项的任一个:羟基香豆素、氨基香豆素、甲氧基香豆素、级联蓝、太平洋蓝、太平洋橙、荧光黄(Lucifer yellow),NBD, R-藻红蛋白(PE)、PE-Cy5 缀合物、PE_Cy7 缀合物、红 613、PerCP, TruRed, FluorX、荧光素、B0DIPY-FL、TRITC、X-罗丹明、丽丝胺罗丹明(Lissamine Rhodamine)B、德克萨斯红、别藻蓝蛋白(allophycocyanin, APC)、和 APC_Cy7 缀合物。
[0246]此类具有包含荧光团或荧光染料的检测部分的缀合物可以用于癌细胞或肿瘤的成像。
[0247]类固醇激素或抗炎药
[0248]在根据本发明的一些实施方案中，VAR2CSA多肽与包括类固醇激素在内的抗炎药三双口 ο
[0249]已知软骨和疤痕组织含有大量的CSPG。因此，可能吸引人的是，向此类组织引导抗炎药如非类固醇抗炎化合物、疾病调节抗风湿药物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azath1prine)、柳氮磺胺卩比唳(sulfasalazine)、环孢素(ciclosporine)、青霉胺(penniciIIamine)、来氟米特(Ieflunomide)、或金)、生物抗风湿药物(如肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)抑制剂、白介素(interleukin)-1-受体拮抗剂、0)20-抗体、胰岛素生长因子I)以及类固醇激素或备选的化合物。
[0250]在根据本发明的一些实施方案中，VAR2CSA多肽与下列各项缀合:抗炎药如非类固醇抗炎化合物、疾病调节抗风湿药物(如甲氨蝶呤(methotrexate)、硫唑嘌呤(azath1prine)、柳氮横胺卩比唳(sulfasalazine)、环抱素(ciclosporine)、青霉胺(pennicillamine)、来氟米特(Ieflunomide)、或金)、生物抗风湿药物(如肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor)抑制剂、白介素(interleukin)-1-受体拮抗剂、0)20-抗体、胰岛素生长因子I)以及类固醇激素或备选的化合物。
[0251]与CSPG4的缀合物
[0252]在根据本发明的一些实施方案中，VAR2CSA多肽与CSPG4缀合。
[0253]据推测，可以使用VAR2CSA多肽与CSPG4的缀合物作为免疫剂(immunizat1nagent)。出于这种用途的目的,据推测，VAR2CSA多肽可以发挥作为伴侣蛋白(chaperone)的功能，伴侣蛋白能够促进CSPG4以将提供抗体的构象向T细胞展现。因此，据推测，与CSPG4缀合的VAR2CSA多肽可以用于疫苗中。
[0254]如在本文中所使用的术语“CSPG4”是指由Uniprot鉴别为Q6UVK1 (CSPG4_HUMAN)的2322个氨基酸的全长人硫酸软骨素蛋白聚糖4以及其变体、功能片段、和直向同源物(ortholog)。CSPG4也可以被称为黑素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)神经元-神经胶质抗原2 (NG2)。
[0255]⑶44或其他蛋白聚糖的靶向
[0256]出于VAR2CSA多肽的缀合物在癌症适应证治疗中用途的目的，据推测，根据本发明的缀合物可以用于不仅靶向表达CSPG4的肿瘤细胞而且还靶向表达CD44的细胞，如癌干细胞、和表达例示出的但不限于表I的那些的蛋白聚糖的细胞。这种靶向是通过在CD44抗原上结合CSA介导的。因此，根据本发明的缀合物可以用于靶向CSPG4阴性而CD44阳性的细胞。这可以用作对表达CSPG4的肿瘤细胞的靶向的备选方案，或者与表达CSPG4的肿瘤细胞的靶向同时使用。
[0257]在通过结合⑶44、和/或CSPG4、和/或其他蛋白聚糖(如表I中的那些)分离癌干细胞中的用途。
[0258]根据本发明的VAR2CSA多肽的特异性和高亲和力结合，如以VAR2CSA多肽的缀合物的形式，可以用于分离干细胞，如表达CD44和/或CSPG4的癌干细胞。
[0259]在通过结合含CSA蛋白聚糖分离或检测循环肿瘤细胞(CTC)中的用途
[0260]根据本发明的VAR2CSA多肽的特异性和高亲和力结合，如以VAR2CSA多肽的缀合物的形式，可以用于分离或检测上皮和非上皮来源的CTC，其表达一种或多种含CSA的蛋白聚糖，如表I中描述的那些。
[0261]抗独特型抗体(ant1-1d1typicantibody)
[0262]作为VAR2CSA多肽用途的备选或补充，还可以使用抗独特型抗体或者甚至模仿VAR2CSA的模拟表位。用于制备模仿抗原表位的抗独特型抗体的技术在本领域中是已知的，并且提供结合VAR2CSA多肽的第一单克隆抗体接着随后制备结合所述第一抗体的独特型的第二抗体。可以从针对特异性结合VAR2CSA多肽的抗体的噬菌体展示中筛选的随机肽文库中分离模拟表位。
[0263]还可以通过用抑制性宿主或患者衍生的针对VAR2CSA的抗体免疫来制备抗独特型抗体，从而获得并筛选多克隆和/或单克隆抗体，如针对并抑制宿主衍生的抗体的人抗体。尽管VAR2CSA通常是不大可能导致患者中自身免疫反应的进化的改进的疟疾蛋白，在一段时间治疗之后不能排除这种免疫反应。之后可以使用与VAR2CSA多肽组合使用的或者作为VAR2CSA多肽的备选方案的抗独特型抗体。
[0264]本发明的具体实施方案
[0265]如在本文中所描述的，本发明涉及一种VAR2CSA的分离蛋白片段，所述片段由以下的连续氨基酸序列组成:
[0266]a) IDl 和
[0267]b)DBL2Xb，以及任选的
[0268]c) ID2a。
[0269]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA的分离蛋白片段包含ID2a。
[0270]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA的分离蛋白片段不包含ID2a。
[0271]在一些实施方案中，根据本发明的分离的VAR2CSA蛋白片段还在VAR2CSA蛋白片段的序列的N或C端中或序列之内包含不多于100个氨基酸，如不多于90个氨基酸，如不多于80个氨基酸，如不多于70个氨基酸，如不多于60个氨基酸，如不多于50个氨基酸，如不多于40个氨基酸，如不多于30个氨基酸，如不多于20个氨基酸，如不多于18个氨基酸，如不多于16个氨基酸，如不多于14个氨基酸，如不多于12个氨基酸，如不多于10个氨基酸，如不多于8个氨基酸，如不多于6个氨基酸，如不多于4个氨基酸，如不多于2个氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列来源于如在本文中所定义的VAR2CSA多肽的任何部分，其不是IDl、DBL2Xb、或ID2a的一部分。
[0272]在一些实施方案中，根据本发明的分离的VAR2CSA蛋白片段还在VAR2CSA蛋白片段的序列的N或C端中或序列之内包含不多于100个氨基酸，如不多于90个氨基酸，如不多于80个氨基酸，如不多于70个氨基酸，如不多于60个氨基酸，如不多于50个氨基酸，如不多于40个氨基酸，如不多于30个氨基酸，如不多于20个氨基酸，如不多于18个氨基酸，如不多于16个氨基酸，如不多于14个氨基酸，如不多于12个氨基酸，如不多于10个氨基酸，如不多于8个氨基酸，如不多于6个氨基酸，如不多于4个氨基酸，如不多于2个氨基酸的氨基酸序列，所述氨基酸序列不来源于如在本文中所定义的VAR2CSA多肽的任何部分。
[0273]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段结合在蛋白聚糖(CSPG)上的硫酸软骨素A(CSA)，并且以Kd表示而测量的亲和力为低于ΙΟΟηΜ，如低于80nM，如低于70nM，如低于60nM，如低于50nM，如低于40nM，如低于30nM，如低于26nM，如低于24nM，如低于22nM，如低于20nM，如低于18nM，如低于16nM，如低于14nM，如低于12nM，如低于ΙΟηΜ，如低于9nM，如低于8nM,如低于7nM,如低于6nM、或低于4nM。
[0274]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段包含与下列各项中的任一个氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的1-577,SEQ ID NO:3的1-592、SEQ ID NO:4 的 1-579、SEQ ID NO:5 的 1-576、SEQ ID NO: 10 的 1-586、SEQ ID NO: 11 的1-579、SEQ ID NO:29 的 1-565、SEQ ID NO:34 的 1-584、SEQ ID NO:36 的 1-569、SEQ IDNO:37 的 1-575、SEQ ID NO:38 的 1-592、SEQ ID NO:41 的 1-603、SEQ ID NO:43 的 1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ ID NO:53 的1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
[0275]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段包含与下列各项中的一个氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的578-640、SEQ ID NO: 3的593-656、SEQ ID NO:4 的 580-643、SEQ ID NO:5 的 577-640、SEQ ID NO: 10 的 587-650、SEQ ID NO: 11 的 580-643、SEQ IDNO:29 的 566-628、SEQ ID NO:34 的 585-647、SEQ IDNO:36 的 570-632、SEQ ID NO:37 的 576-639、SEQ ID NO:38 的 593-655、SEQ ID NO:41 的604-667、SEQ ID NO:43 的 589-652、SEQ ID NO:44 的 566-628、SEQ IDNO:45 的 590-653、SEQ ID NO:48 的 574-637、SEQ ID NO: 53 的 584-646、或 SEQ ID NO: 54 的 570-632。
[0276]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段包含与下列各项中的一个氨基酸序列具有至少 70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、6、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、35、39、40、42、46、47、49、50、51、或 52。
[0277]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段由与下列各项中的任一个氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:1的1-577、SEQ ID N0:3的1-592、SEQ ID NO:4 的 1_579、SEQ ID NO: 5 的 1_576、SEQ ID NO: 10 的 1-586、SEQ ID NO: 11的 1-579,SEQ ID NO:29 的 1-565,SEQ ID NO:34 的 1-584,SEQ ID NO:36 的 1-569,SEQ IDNO:37 的 1-575、SEQ ID NO:38 的 1-592、SEQ ID NO:41 的 1-603、SEQ ID NO:43 的 1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ ID NO:53 的1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
[0278]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段由选自由下列各项组成的列表的氨基酸序列组成:SEQ ID N0:l、3-5、10、ll、29、34、36-38、41、43-45、48、53、和 54。
[0279]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列长度为小于700个氨基酸,如小于690个氨基酸,如小于680个氨基酸,如小于670个氨基酸，如小于660个氨基酸，如小于650个氨基酸，如小于640个氨基酸，如小于630个氨基酸，如小于620个氨基酸，如小于610个氨基酸，如小于600个氨基酸，如小于590个氨基酸，如小于580个氨基酸，如小于570个氨基酸。
[0280]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段是基本纯的。
[0281]在一些实施方案中，在SDS-PAGE上在非还原条件下，根据本发明的蛋白片段具有小于约10kDa的分子量。
[0282]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段是重组蛋白。
[0283]在一些实施方案中，根据本发明的蛋白片段是非糖基化的。
[0284]本发明进一步涉及如在本文中所定义的蛋白片段、根据本发明的VAR2CSA多肽、或缀合物，其用于治疗与涉及CSA的表达如不适当表达的病症相关的任何适应证，如在癌症、关节炎、多发性硬化、和神经损伤后的愈合、软骨修复、伤口愈合中，以及在银屑病中。
[0285]在一些实施方案中，VAR2CSA多肽、缀合物或融合蛋白是或包含根据本发明的VAR2CSA蛋白片段。
[0286]因此，根据本发明的VAR2CSA多肽、缀合物或融合蛋白可以包含与鉴别为SEQ IDNO: 1-75中的任一序列的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列。
[0287]在一些实施方案中，根据本发明的VAR2CSA多肽由选自SEQ ID NO:60-70.72-75的氨基酸序列组成。
[0288]在一些实施方案中，癌症选自皮肤、眼或结膜黑素瘤。癌(carcinoma)(三阴性乳腺癌(triple negative breast carcinoma)和化生性乳腺癌(metaplastic breastcarcinoma)、膜腺癌(pancreatic carcinoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、子宫内膜癌(endometrial carcinoma)、月干细胞癌(hepatocellular carcinoma)、月市癌(lungcarcinoma)、结肠癌(colon carcinoma)、前列腺癌(prostate carcinoma)、宫颈癌(cervix carcinoma)、睾丸癌(testis carcinoma)、基底细胞皮肤癌(basal cell skincarcinoma)、透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、角化头颈鱗状细胞癌(kreatinized head and neck squamous cell carcinoma)、皮肤鱗状细胞癌(skinsquamous cell carcinoma)、夕卜阴角化鱗状细胞癌(vulvar kreatinized squamous cellcarcinoma)和外阴基底细胞癌(vulvar basal cell carcinoma)),肉瘤(sarcoma)(乳腺脂肪肉瘤(breast liposarcoma)、纤维肉瘤(fibrosarcoma)、去分化软骨和脂肪肉瘤(dedifferentiated chondro-and liposarcoma)、平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、月旨肪肉瘤(liposarcoma)、粘液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)、子宫体平滑肌肉瘤(uterinecorpus le1myosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤因肉瘤(ewing sarcoma)、和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma))，造血系统癌(hematopoietic cancer)(慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphatic leukaemia，CLL)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphaticleukaemia, ALL)、急性髓细胞白血病(acute myeloid leukaemia AML)、B 细胞、T 细胞和大颗粒状淋巴瘤(large granular lymphoma))，神经上皮组织的肿瘤，如星形细胞瘤(astrocytoma)(多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、纤维型星形细胞瘤(fibrillary astrocytoma)、间变型星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、多形性胶质母细胞瘤(gl1blastoma multiforme))、少突神经胶质瘤(oligodrendrogl1ma)、室管膜瘤(ependymoma)、脉络丛肿瘤(choroid plexus turmor)、寡星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、神经胶质肉瘤(gl1sarcoma)、神经节神经胶质瘤(gangl1gl1ma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、神经细胞瘤(neurocytoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)(嗅神经母细胞瘤(esthes1neuroblastoma)和神经节母细胞瘤(gangl1neuroblastoma))、髓母细胞瘤(medul1blastoma)和非典型畸胎样横纹肌样肿瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor)，以及任何其他表达CSA的癌症亚型。
[0289]在一些实施方案中，所述癌症选自所有表达CSA的恶性疾病，包括癌(carcinoma)(包括但不限于乳腺癌(breast carcinoma)、胰腺癌(pancreatic carcinoma)、卵巢癌(ovarian carcinoma)、子宫内膜癌(endometrial carcinoma)、月干细胞癌(hepatocellularcarcinoma)、月市癌(lung carcinoma)、结肠癌(colon carcinoma)、前列腺癌(prostatecarcinoma)、宫颈癌(cervix carcinoma)、睾丸癌(testis carcinoma)、基底细胞皮肤癌(basal cell skin carcinoma)、透明细胞肾细胞癌(clear cell renal cell carcinoma)、头颈鱗状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)、皮肤鱗状细胞癌(skinsquamous cell carcinoma)、夕卜阴角化鱗状细胞癌(vulvar kreatinized squamous cellcarcinoma)和外阴基底细胞癌(vulvar basal cell carcinoma)),肉瘤(包括但不限于纤维肉瘤(fibrosarcoma)、去分化软骨和脂肪肉瘤(dedifferentiated chondro-andliposarcoma)、平滑肌肉瘤(le1myosarcoma)、脂肪肉瘤(liposarcoma)、粘液性脂肪肉瘤(myxoid liposarcoma)、子宫体平滑肌肉瘤(uterine corpus le1myosarcoma)、骨肉瘤(osteosarcoma)、尤因肉瘤(ewing sarcoma)和横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)、孤立性纤维瘤(solitary fibrous tumor))，造血系统癌(包括但不限于慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、B细胞、T细胞和大颗粒状淋巴瘤)，神经上皮组织的肿瘤，如但不限于星形细胞瘤(astrocytoma)(多形性黄色星形细胞瘤(pleomorphic xanthoastrocytoma)、纤维型星形细胞瘤(fibrillary astrocytoma)、间变型星形细胞瘤(anaplasticastrocytoma)、多形性胶质母细胞瘤(gl1blastoma multiforme))、少突神经胶质瘤(oligodrendrogl1ma)、室管膜瘤(ependymoma)、脉络丛肿瘤(choroid plexus turmor)、寡星形细胞瘤(oligoastrocytoma)、神经胶质肉瘤(gl1sarcoma)、神经节神经胶质瘤(gangl1gl1ma)、视网膜母细胞瘤(retinoblastoma)、神经细胞瘤(neurocytoma)、神经母细胞瘤(neuroblastoma)(嗅神经母细胞瘤(esthes1neuroblastoma)和神经节母细胞瘤(gangl1neuroblastoma))、髓母细胞瘤(medul1blastoma)、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤(atypical teratoid rhabdoid tumor)和所有类型的神经内分泌癌(neuroendocrinecancer)0
[0290]序列，包括VAR2CSA多肽的序列:
[0291]> fcr3 745个氨基酸| 640aa ;下划线的序列对应于FCR3的IDl结构域，粗体的序列对应于FCR3的DBL2Xb结构域。其余的序列是ID2a(SEQ ID NO:1)
[0292]NYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHS
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[0293]> gi |254952610|gb|ACT97135.1 |VAR2CSA[恶性疟原虫]|341aa(SEQ ID NO:2)
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[0295]> M24 745 个氨基酸 |656aa(SEQ ID NO:3)
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[0297]> KMWII 745 个氨基酸 |643aa(SEQ ID NO:4)
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[0299]> 1248 74δ 个氨基酸 |640aa(SEQ ID NO:5)
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[0381]> gi |31323048|gb|AAP37940.1 |var2csa[恶性疟原虫]|490aa(SEQ ID NO:46)
[0382]KCDKCKSEQSKKNNNKWIWKKYSGNGEGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEffIIAAFHEGKNLKKRYPQNKNDDNNSKLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKAFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNGTTCSSGS⑶NGDSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVEHFCKQRQAKVKDVINSCNSCKNTSGERKIGGTCNSDCEKKCKVACDAYKTFIEECRTAVGGTAGSSWVKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGPSSTTNAAENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDENSCGADKAPWTTYTTYTTYTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQQSNTSVVVNVPSPLGNTPHEYKYACECKIPTTEETCDDRKEYMNQWIIDNTKNPKGSGSTDNDYELYTYNGVQIKQAAGRSSSTKLD
[0383]> gi|254952620|gb|ACT97140.l|VAR2CSA[恶性疟原虫]|335aa(SEQ ID NO:47)
[0384]KCEKCKSGTSTVNNKWIWRKSSGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCKGVTDIIYDTKEKFLSGCLIAAFHEGKNLKTTYLEKKNDDNGKKLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKIFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWIAMKHGAGMNGTTCSSGS⑶SSNDIPTTDFIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKPVIENCNSCKESGGTCNGECKTKCKVACDAYKKFIDGTGSGGGSRPTGIAGSSWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGPSSITNVSVSTDENKCVQS
[0385]> T2C6 745 个氨基酸 |637aa(SEQ ID NO:48)
[0386]
NYIKDDPYSKEYVTKLSFIPNSSDANTSSEKIQKNNDEVCNPNESGISSVEQAQTSDPSSNKT
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[0387]> gi|254952632|gb|ACT97146.l|VAR2CSA[恶性疟原虫]|330aa(SEQ ID NO:49)
[0388]KCDKCKSEQSKKNNNKWIWRKFPGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEffIIAAFHEGKNLKTTYLEKKNAENKKKLCKALKYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKIFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAGMNGTMCNADGSVTGSGSSCDDMPTTDFIPQYLRFLQEWVEHFCKQRQAKVKDVIENCKSCKESGNKCKTECKNKCDAYKTFIEECGTAVGGTAGSSWVKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTAENKCVQS
[0389]> gi I 90193487 | gb | ABD92339.1 红细胞膜蛋白 I [恶性疟原虫]I 269aa(SEQ IDNO:50)
[0390]NYIKDDPYSKEYVTKLSFILNSSDAENASETPSKYYDEACNCNESGISSVEQASISDRSSQKACNTHSFIGANKKKVCKHVKLGVRENDKDLKICVIEDDSLRGVENCCFKDFLRMLQEPRIDKNQRGSSSNDSCNNNNEEACEKNLDEALASLHNGYKNQKCKSEQSKKNNNKWIWKKSSGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEffIIDAFHEGKNLKTTYLEKKKGDNGKKLCKALKYSFADY
[0391]> gi|254952646|gb|ACT97153.l|VAR2CSA[恶性疟原虫]|347aa(SEQ ID NO:51)
[0392]KCDKCKSEQSKKNNKNWTWKKSSGKEGGLQKEYANTIALPPRTQSLCLVVCLHEKEGKTQHKTISTNSELLKEWIIDAFHEGKNLKTTYLEKQNADNGKKNADNNSKLCKDLKYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQQIFGKLFRKYIKKNIASDENTLYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNGTTCSSGS⑶SSSGENQTNSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVEHFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGGTCNSDCKTKCKGECEKYKKFIEKCKGGGTEGTSGSSWVKRWYQIYMRYSKYIEDAKRNRKAGTKSCGTSSGANSGVTTTESKCVQS
[0393]> gi I 90193485 | gb | ABD92338.1 红细胞膜蛋白 I [恶性疟原虫]I 269aa(SEQ IDNO:52)
[0394]DYIKDDPYSKEYTTKLSFILNSSDANTSSEKIQKNNDEVCNPNESEISSVEQAQTSRPSSNKTCITHSSIKANKKKVCKDVKLGVRENDKVLRVCVIEHTSLSGVENCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNGSCDKNSEEACEKNLDEALASLTNCYKNQKCKSEQSKKNNNKWIWKKSSGNEKGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVCLHEKEGKTQELKNISTNSELLKEffIIAAFHEGKNLKTTYPQNKNDDNGKKLFKDLKYSFADY
[0395]> MTSl 745 个氨基酸 |646aa(SEQ ID NO:53)
[0396]
DYXKDDPYSKEYTTKLSFILNSSDANTSSEKIQKNNDEVCNPNESEISSVEQAQTSRPSSNKTC
miSSIKANKKKVCKDVKLGVRENDKVLRVCVIEHTSLSGVENCCCQDLLGILQENCSDNKRG
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LKNSKLD
[0397]> Q8I639 (Q8I639_PLAF7)恶性疟原虫(分离株 3D7)，632aa 细胞外部分(SEQ IDNO:54)
[0398]
NYIKGDPYFAEYATKLSFaNSSDANNPSEKIQKNNDEVCNCNESGIASVEQiQISDPSSNKTC
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YKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLD
[0399]> Q8I639(Q8I639_PLAF7)恶性疟原虫(分离株3D7)，全部2730aa细胞外部分(SEQ ID NO:55)
[0400]MDKSSIANKIEAYLGAKSDDSKIDQSLKADPSEVQYYGSGGDGYYLRKNICKITVNHSDSGTNDPCDRIVb
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[0403]>BPTI，蛋白酶抑制剂(SEQ ID NO:57)
[0404]RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGA
[0405]> PE38，假单胞菌外毒素A(SEQ ID NO:58)，(KDEL的下划线表示信号序列，其对于根据本发明的构建体来说可以是任选的)
[0406]RHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADS⑶ALLERNYPTGAEFLGDG⑶ISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA⑶PALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGffPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
[0407]> PE38LR，PE38的变体(SEQ ID NO:59) (KDEL的下划线表示信号序列，其对于根据本发明的构建体来说可以是任选的)
[0408]RHRQPRGWEQLYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA⑶PALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
[0409]与假单胞菌外毒素A (PE38)的截短片段融合的VAR2CSA多肽的序列
[0410]融合VAR2CSA-PE38蛋白质可以具有修饰，如在N端中的蛋白酶抑制剂(BPTI)和/或免疫原性较低的优化的PE38序列(PE38LR)
[0411]> BPT1-1Dl-1D2aFCR3-PE38LR, (SEQ ID NO:60)下划线的序列对应于FCR3 的 IDl结构域，粗体的序列对应于FCR3的DBL2Xb结构域，下划线和粗体的序列是ID2a
[0412]RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGANYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSYGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFAS
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[0413]> BPT1-1Dl-1D2aFCR3-PE38(SEQ ID NO:61)
[0414]RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGANYIK⑶PYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFASLTNGYKCDKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADY⑶LIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLVVVNVPSPLGNTPYRYKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLDPEGGSLAALTAHQACHLPLETFTRHRQPRGWEQLEQCGYPVQRLVALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDALLERNYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIAGDPALAYGYAQDALYLAARLSWNQVDQVIRNALASPGSGGDLGEAIREQPEQARLALTLAAAESERFVRQGTGNDEAGAANGPADSGDA
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TGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
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〔0419〕 V BPT1-DBLl-1D2aFCR3-PE38LR(SEQ ID NO:64)
〔042s RPDFCLEPPYTGPCKARIIRYFYNAKAGLCQTFVYGGCRAKRNNFKSAEDCMRTCGGANHSDSGKYDPCEKKLPPYDDNDQWKCQQNSSDGSGKPENICVPPRRERLCTYNLENLKFDKIRDNNAFLADVLLTARNEGEKIVQNHPDTNSSNVCNALERSFADLADIIRGTDQWKGTNSNLEKNLKQMFAKIRENDKVLQDKYPKDQKYTKLREAWWNANRQKVWEVITCGARSNDLLIKRGWRTSGKSDRKKNFELCRKCGHYEKEVPTKLDYVPQFLRWLTEWIEDFYREKQNLIDDM
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578b
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〔Os〕 V IDl-1D2a3D7-PE38(SEQ ID NO:68)
1--10428I——IrgpHHsggoANNPSEKIQKNNDEVCNCNESGIASVEQEQISDPSSNKTCITHSSIKANKKKVCKHVKLG
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1--10429I——IV Jol-1D2a3D7-PE38LR(SEQ ID NO:6s




59
[0430]LSFILNSSDANNPSEKIQKNNDEVCNCNESGIASVEQEQISDPSSNKTCITHSSIKANKKKVCKHVKLGVRENDKDLRVCVIEHTSLSGVENCCCQDFLRILQENCSDNKSGSSSNGSCNNKNQEACEKNLEKVLASLTNCYKCDKCKSEQSKKNNKNWIWKKSSGKEGGLQKEYANTIGLPPRTQSLCLVVCLDEKGKKTQELKNIRTNSELLKEWIIAAFHEGKNLKPSHEKKNDDNGKKLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQKIFGKLFRKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWLAMKHGAGMNSTTCCGDGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVEHFCKQRQEKVKPVIENCKSCKESGGTCNGECKTECKNKCEVYKKFIEDCKGGDGTAGSSWVKRWDQIYKRYSKYIEDAKRNRKAGTKNCGPSSTTNAAENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSIVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKETDKSKLQQCNTAVWNVPSPLGNTPHGYKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLDRHRQPRGWEQLYPTGAEFLGDG⑶ISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA⑶PALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
[0431]> ID l-DBL2bFCR3-PE38LR(SEQ ID NO:70)
[0432]NYIK⑶PYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFASLTNGYKCDKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADY⑶LIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLVVVNVPSPLGNTPYRYKYRHRQPRGWEQLYPTGAEFLGDGGDISFSTRGTQNWTVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQSIVFGGVRARSQDLDAIWRGFYIA⑶PALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLAAPEAAGEVERLIGHPLPLRLDAITGPEEEGGRLETILGWPLAERTVVIPSAIPTDPRNVGGDLDPSSIPDKEQAISALPDYASQPGKPPRKDEL
[0433]> DT388，白喉毒素序列(SEQ ID NQ:71)
[0434]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPMHEF
[0435]与白喉毒素的截短片段融合的VAR2CSA多肽的序列
[0436]> DT388-DBLl-1D2a 3D7(SEQ ID NO:72)
[0437]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPMHEFHSDSGTNDPCDRIPPPYGDNDQWKCAIILSKVSEKPENVFVPPRRQRMCINNLEKLNVDKICN 104136041 A i^sdts/82 矧
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1--10439I——Iso>aayyoSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEK
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UKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTC
NADGSVTGSGSSCDOIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYK
KFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDSYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSOIDSFFKH
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CKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLDSS
〔044SV DT388-1DllID2a 3D7 (SEQ ID NO:74)
1--10441I——IsoaayyassKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKE
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Etdksklqqcntavwnvpsplgntphgykyacqckiptneetcddrkeymnqwscgsartmkrgykndnyelckyn
GVDVKPTTVRSNSSKLDSGR
[0442]> DT388-1Dl-1D2a FCR3(SEQ ID NO:75)
[0443]MGADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKGFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRF⑶GASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRSVGSSLSCINLDWDVIRDKTKTKIESLKEHGPIKNKMSESPNKTVSEEKAKQYLEEFHQTALEHPELSELKTVTGTNPVFAGANYAAWAVNVAQVIDSETADNLEKTTAALSILPGIGSVMGIADGAVHHNTEEIVAQSIALSSLMVAQAIPLVGELVDIGFAAYNFVESIINLFQVVHNSYNRPAYSPGHKTQPMHEFNYIKGDPYFAEYATKLSFILNPSDANNPSGETANHNDEACNCNESGISSVGQAQTSGPSSNKTCITHSSIKTNKKKECKDVKLGVRENDKDLKICVIEDTSLSGVDNCCCQDLLGILQENCSDNKRGSSSNDSCDNKNQDECQKKLEKVFASLTNGYKCDKCKSGTSRSKKKWIWKKSSGNEEGLQEEYANTIGLPPRTQSLYLGNLPKLENVCEDVKDINFDTKEKFLAGCLIVSFHEGKNLKKRYPQNKNSGNKENLCKALEYSFADYGDLIKGTSIWDNEYTKDLELNLQNNFGKLFGKYIKKNNTAEQDTSYSSLDELRESWWNTNKKYIWTAMKHGAEMNITTCNADGSVTGSGSSCDDIPTIDLIPQYLRFLQEWVENFCEQRQAKVKDVITNCKSCKESGNKCKTECKTKCKDECEKYKKFIEACGTAGGGIGTAGSPWSKRWDQIYKRYSKHIEDAKRNRKAGTKNCGTSSTTNAAASTDENKCVQSDIDSFFKHLIDIGLTTPSSYLSNVLDDNICGADKAPWTTYTTYTTTEKCNKERDKSKSQSSDTLVVVNVPSPLGNTPYRYKYACQCKIPTNEETCDDRKEYMNQWSCGSARTMKRGYKNDNYELCKYNGVDVKPTTVRSNSSKLDSGR
实施例
[0444]实施例1截短的重组VAR2CSA蛋白的制备
[0445]根据先前定义的结构域边界制备所有蛋白截短物(Dahlback M, JorgensenLM, Nielsen MA, Clausen TM, Ditlev SB 等人 J B1l Chem 286:15908-15917)。出于简化的目的，我们已经将CIDRpam结构域分为两个结构域ID2a和ID2b，其中ID2a是CIDRpam的不含CIDR样序列的N端部分，而ID2b对应于CIDR样序列。我们还使用了结合了 ID2a的93个氨基酸的新的DBL2X边界。为了简化，我们将此称为DBL2Xb，同时旧的边界将被称为DBL2Xa。表2中列出了克隆中使用的引物。如在方法I中描述的，片段作为可溶性蛋白在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达。大多数蛋白基于FCR3基因型制备。一些FCR3片段不表达并且这些改为基于3D7基因型制备。在分析中蛋白可互换地使用，因为我们表明，来自两种基因型的重组VAR2CSA均等地结合CSA。当通过SDS-PAGE (方法2)比较还原的和非还原的样品时，所有蛋白表现出凝胶迁移率的变动。这与分子内二硫键的形成一致。一些蛋白形成了由非还原SDS-PAGE检测出的高分子量复合物。这很可能归因于未配对的半胱氨酸之间的分子内二硫键的形成。这通过使用DTT将复合物还原为单体蛋白来确认。
[0446]
1-1
0
4^.1_I
表2:克隆引物


FCR3引物
Si^ 止向引物
IDl-1D2bAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ IDNO;76) CTTGTTGA'
DBLlX-1D2aCACAGCGATAGCGGCAAG (SEQ ID NO:78) GTCCAGC
IDl-1D2aAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ ID NO:80) GTCCAGC
IDl-DBL2XaAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ EDNO:82) AGCGGCC
IDl-DBL2XbAACTACATCAAGGGCGAC (SEQ ID NO:84) GTACTTG
DBLlX-DBL2XbCACAGCGATAGCGGCAAG (SEQ ID NO;86) GTACTTG



3d7引物
S I so^ 正向引物
DBL2X-DBL4sCTGACCAACTGCTACAAG (SEQ ID NO:88) GGTCCAG,
iDl-l>BL3sC'rG'rCCT'rCA'i'CXn'GAAC (SEQ ID NO:9G) TTCAGCGT
ID1-DBL4hCTGTCCTTCATCCTGAAC (SEQ ID NO:92) GTCCAG/
DBLlX-1D2bCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ ID NO:94) AGAGGACTTi
Il)1-1l)2bC’l’G’rCC’nrATCC’mAAC (SKQII) N():%) Α(?Α(](?ΑΟ--(
DBLlX-1D2aCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ ID NO:98) GTCCAGC
IDl-1D2aCTGTCCTTCATCCTGAAC (SEQ ID NO: 100) GTCCAGC'
DRT/IX-DBT,2XaCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ TD NO:1 ()2) GGCGCtCG
IDl-DBL2XaCTGTCCTTCATCCTGAAC (SEQ ID NO: 104) GGCGGCG
DBLlX-DBUXbCACTCTGACTCTGGCACC (SEQ ID N0:106) GTACTTG'
TDl -DHT,2XbCTGTCCTTCATCCTr丁AAC (SEQ Π) NO: 108) GTACTTG'O
C
至



-漏
---合?'
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1_I I_I如果该差异与表达的VAR2CSA的序列差异有关，则可以使用该信息限定参与粘附过程的残基。为了对此进行测试，我们制备了一系列的重叠3D7 VAR2CSA片段，其与我们前面已经针对FCR3所测试的片段相同。
[0450]首先针对固相结合测定(ELISA)中的特异性CSPG结合筛选蛋白(方法3中描述的)。之后通过尺寸排阻层析进一步纯化特异性结合CSPG的蛋白，以获得纯净的单体蛋白，并且在石英晶体微量天平(Attana A100)上进行动力学分析(分别为方法2和方法4)。3D7VAR2CSA片段在固态结合测定中表现出与其FCR3对应物非常相似的结合特性。在动力学分析中同样如此(表3)。传感图示出了在不同蛋白浓度下收集的缔合和解离数据。这使得能够测定缔合速率常数(km)、解离速率常数U、和平衡常数(Kd)。这些参数同峰值响应水平一起提供了对CSPG结合亲和力的估算。3D7与FCR3片段之间不存在明显的差异。一些片段显示出较低的亲和力，但是在片段对应物中也保持了这种特性。这表明3D7和FCR3VAR2CSA蛋白以相同的方式折叠和发挥作用。
[0451]表3:制备的VAR2CSA蛋白的CSA结合亲和力。亲和力作为在动力学实验中使用石英晶体微量天平生物传感器(Attana A100)测定的KD(nM)值给出。N/A:归因于缺乏与CSA的结合，不能确定Kd值的蛋白。
[0452]

FCR33D7
~杆状病毒~~ 杆状病毒
VAR2CSA片段大肠杆菌

(Baculo)(Baculo)
FV252^8^
ID1-DBL4S9Λ
IDl-DBL3s03^O
DBL2X-DBL4sIA^L2

DBL1-1mb
DBLl-1D2a8--5
IDl-1D2a76183 ' 5J
^DBLlX-DBL2XbΚβ
^DBLlX-DBL2XaNZA
IDl-DBL2Xb2L8
IDl-DBL2XaWA
[0453]* 蛋白公布于(Dahlback 等人，JBC, 2011)
[0454]实施例3-核心CSA结合位点位于DBL2X结构域内
[0455]已经提出VAR2CSA中的最小CSA结合区域位于DBL2X_ID2b内，并且需要侧翼结构域用于完全亲和力结合(DahIbSck M, Jorgensen LM, Nielsen MA, Clausen TM, Ditlev SB等人J B1l Chem 286:15908-15917)。在这里，我们已经分析了较短的VAR2CSA片段以进一步描绘CSA结合所需的区域。
[0456]首先在ELISA中针对与CSA蛋白聚糖(CSPG)的结合来筛选截短的蛋白质，并且之后纯化以获得用于在石英晶体微量天平上检验的单体(分别为方法3、2和4)。最小结合区域是IDl-DBL2Xb (表3)。此区域表现出21.8nM的结合亲和力，这可与全长VAR2CSA的结合亲和力相比。
[0457]胎盘IE对低硫酸化胎盘CSPG是高度选择性的。它们不粘附至任何其他糖胺聚糖(GAG)，如硫酸乙酰肝素(HS)。对于全长重组VAR2CSA蛋白来说同样如此。固态结合测定显示含有最小CSA结合区域的VAR2CSA片段特异性结合CSA。为了对此进行确认，针对与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)的结合，进一步在石英晶体微量天平上测试最小结合片段(方法4)。所有片段都不结合HSPG。
[0458]实施例4-针对新的最小结合区域诱导的抗体诱导强效的寄生物抗粘附免疫应答
[0459]针对PM的基于VAR2CSA的疫苗必须能够诱导强力的保护性免疫应答。在此，最重要的方面是形成能够抑制胎盘隔离(sequestrat1n)的抗VAR2CSA IgG抗体。出于设计最佳的疫苗抗原目的，我们已经检验了 VAR2CSA-CSA相互作用潜在的分子机制。为了测试我们制备的VAR2CSA重组片段是否表现出诱导粘附阻断免疫应答的能力，将它们用于大鼠免疫(方法6)。
[0460]针对抑制IE粘附至CSPG的能力，测试VAR2CSA片段特异性血清(方法11)。针对所有结合CSA的片段产生的抗体是非常强效的结合抑制剂。事实上，在所有情况中，几乎100%地抑制结合。DBLlX-DBL2Xa和IDl_DBL2Xa不是良好的抑制剂，与这些片段缺乏CSA结合一致(表3)。该数据意味着，结合CSA的蛋白质适当地折叠并且支持以上定义的最小结合区域的定位。
[0461]实施例5-引起抗粘附抗体的诱导的表位位于最小结合区域内
[0462]为了检验抑制性抗FV2应答是否是针对最小结合区域，我们亲和纯化了关于在前面描述的VAR2CSA片段中的四个的FV2抗体(方法7)。然后针对抑制表达VAR2CSA的寄生物与CSPG结合的能力，测试片段特异性抗体(方法11)。在固定化的ID1-DBL4 ε、DBLlX_ID2a和IDl-1D2a上纯化的抗体完全抑制了寄生物粘附。此外，消耗的FV2样品损失了其抑制能力的很大部分。这表明诱导抗粘附抗体的表位存在于这些片段内。在DBLlX-DBL2Xa上纯化的抗体显示出降低的抑制能力，这与这种片段缺乏CSA结合一致(表3)。该数据提示，弓丨起抑制性抗体的诱导的表位位于最小结合区域内(在这里通过IDl-1D2a阐明)。
[0463]实施例6-最小结合区域中突变推定的GAG结合位点对CSPG结合没有影响
[0464]对于多价PM疫苗的设计来说，表征VAR2CSA与CSA之间的相互作用的性质是重要的。在这方面，主要部分是特异性CSA结合位点的鉴别和潜在化学相互作用的表征。最小CSA结合区域的序列分析揭示了两个保守的推定的GAG结合位点。一个位于IDl区域中并且具有典型的 Cardin-Weintraub XBBBXXBX 基序(Cardin, A.D.和 Weintraub, H.J.(1989) Arter1sclerosis 9，21-32) (458-NKKKECKD-465)。另一个，在 DBL2X 中，具有反向的相同的基序(625-GKNLKKRY-632)。也已经假设的是，在DBL2X的N端部分中发现的二态(dimorphic)序列基序(DSM)参与结合 CSA(Sander, A.F.，Salanti, A.，Lavstsen, T.,Nielsen, M.A., Magistrado, P., Lusingu, J., Ndam, N.T.,和 Arnot, D.E.(2009) PLoS One4，e6667)。为了测试这些推定的位点是否对CSA结合有作用，我们用丙氨酸置换了典型的GAG结合位点中的碱性(basic)氨基酸并且在DSM区域内的暴露表面的环的中间做出了十个氨基酸(590-KLENVCEDVK-603)的缺失。所有突变在DBLlX_ID2a片段中进行。
[0465]用丙氨酸置换在推定的IDl和DBL2X GAG结合位点中的碱性氨基酸对CSPG结合没有影响。在ELISA中与野生型蛋白相比，没有见到CSPG结合的降低(方法3)。具有四个丙氨酸置换的构建体，丙氨酸Sub.K(459，460，461，464)，显示出相当高的HSPG结合，其可以由针对突变的蛋白质结构改变而引起。两种突变体，丙氨酸Sub.K (626，629，630)，R(631)和丙氨酸Sub.K(459，460, 461，464)，显示出与阳性对照相似的CSPG结合动力学(方法4)。这明显是由于相似的Kd值和峰值响应造成的。
[0466]DSM区域的缺失并未降低与CSPG的结合(方法3和4)。DSM敲除的突变体在ELISA中显示出与HSPG相当高的结合。这可能是由在其中缺失DBLlX的100氨基酸的错误的克隆引起的。重要的是，CSPG结合不受影响。
[0467]实施例7
[0468]与CSPG结合的VAR2CSA不依赖于离子相互作用
[0469]典型的Cardin-Weintraub GAG结合基序的突变对CSPG结合没有影响。这表明VAR2CSA-CSA结合机制与典型的GAG结合模型中的硫酸盐结合的一般方式不同。存在GAG结合蛋白的实例，显示出对与硫酸化GAG结构的离子相互作用几乎没有依赖。为了测试是否是这种情况，我们根据聚电解质理论检验了离子依赖性(Record, Μ.Τ.，Jr.，Lohman, M.L.，和 De Haseth, P.(1976) J Mol B1l 107,145-158)。
[0470]类似于DNA，糖胺聚糖是被称为聚电解质的高度带电的聚合物。带负电的基团导致在每种聚合物内的高程度的推斥能。单价阳离子，如Na+，与带负电的基团相互作用以使推斥能最小化。碱性氨基酸与硫酸根基团的结合取代了结合的阳离子并且引起自由能的释放。结合的Na+离子的有利的释放被称为聚电解质效应。
[0471]该理论宣称，蛋白质与GAG的结合可以描述为:
[0472]
蛋白质+GAG(m个位点)η蛋H质-GAG+m(l -f)Na+
[0473]其中m是在结合单个蛋白质时所释放的Na+离子的数量并且f是未被钠离子掩蔽的阴离子的分数。根据该理论，所观察到的Kd值与以下离子和非离子的贡献有关:
[0474]LogKD，观察值=LogKD，非离子+m (l_f) Log [Na+]
[0475]其中是在不存在离子相互作用的情况下的解离常数。
Log[Na+]的曲线图是线性的，斜率为m(l-f)。因此，如果未被掩蔽的阴离子(f)是已知的，则可以确定参与结合的离子相互作用的数量。对于肝素来说，(Ι-f)是0.8(01son，S.T., Halvorson, H.R.,和 Bjork, 1.(1991) J B1l Chem 266,6342-6352)。对于 CSA 来说，值是未知的，但是(ι-f)不能超过I。因此我们可以估算参与的离子相互作用的最大数量。此夕卜，当[Na+] = IM时，Log[Na+] = O,这意味着在此Na+浓度下，LogKD，观察值=LogKD，非离子。
[0476]我们在固态结合测定中在不同的NaCl浓度(150mM、200mM、250mM、300mM)下，通过在1:2稀释系列中进行结合400nM-1.65nM蛋白质的滴定，测试了 FV2、DBLlX_ID2a和IDl-1D2a与CSPG的结合(方法5)。观察到的Kd值确定为提供半最大(B最大)响应的蛋白质浓度。这在Graphpad Prism中使用非线性回归(最小平方与Hill斜率拟合)完成。在分析中不包括更高的盐浓度，因为结合几乎完全被抑制。这很可能归因于蛋白质结构的改变。此想法被LogKD，_§6<]对Log[Na+]仅在150mM和300mM之间是线性的事实所支持,提示在更高的NaCl浓度下其他因素发挥作用。
[0477]LogK11,观察的对Log[Na+]显示出线性关系。斜率m(l_f)的范围在IDl_ID2a的2.7至全长(FV2)的3.4之间。我们不知道f的值，但是参与结合的离子相互作用的最大数量必须在2至3之间。有趣的是，全长蛋白质的值高于短片段的值，表明该蛋白质与CSPG进行额外的离子相互作用。将在150mM NaCl的Kd值作为我们的参照点，因为这是生理NaCl浓度。通过外推线性关系并且寻找I截距，我们发现FV2的KD，嫌=5.9 μ m，DBLlX_ID2a的KD，非离子=3.4 μ m，并且IDl-1D2a的KD，非离子=0.7 μ m。比较这些和参照点(150mM NaCl)的对数值，我们估算在25-35%之间的VAR2CSA结合可能是由离子相互作用引起的。这提示VAR2CSA的高CSA亲和力不能单单由与硫酸化GAG结构的离子相互作用解释。高亲和力可以通过与CSA碳水化合物骨架进行多价相互作用的复合物结合位点获得。
[0478]实施例8
[0479]VAR2CSA最小CSA结合区域特异性结合大范围的癌细胞
[0480]许多不同的癌细胞与蛋白聚糖CSPG4的高度表达有关。这种分子最初被描述为黑素瘤的标记，但是近来已经许多癌形式中发现了它，包括癌干细胞。附着至CSPG4的CS链已知是主要的CSA。针对与一大组各种癌细胞系的结合，通过流式细胞仪分析最小的VAR2CSA片段之一(IDl-1D2a)(方法12a和12b)。使用非CSA结合蛋白质IDl_DBL2Xa作为阴性对照。VAR2CSA重组蛋白(IDl-1D2a)在75nM下强烈结合所有转录CSPG4的癌细胞系(微阵列数据)，包括皮肤黑素瘤(C32、MeWo)、肺癌(lung carcinoma) (A549)、乳腺癌(breastcarcinoma) (HCC1395)、骨肉瘤(U20S、MNNG/HOS)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma) (RH30)(表4和5)。这种蛋白还强烈结合不表达CSPG4的皮肤T细胞淋巴瘤(表4)。阴性对照蛋白IDl-DBL2Xa不结合任何所测试的细胞系(表4)。此外，IDl_ID2a不与用作对照细胞的人红细胞相互作用。针对IDl-1D2a相互作用，还分析了野生型和GAG缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。当分析CH0-745细胞系(其中GAG合成被中断)时，所看到的IDl_ID2a与野生型CHO细胞的强相互作用完全被消除。通过借助将VAR2CSA与CSA、CSC或HS预混合来抑制结合细胞的VAR2CSA，也证实了相互作用的CSA特异性。CSC和HS对结合没有任何影响，然而CSA有效地消除了 VAR2CSA与癌细胞的结合。
[0481]根据这些结果，通过流式细胞仪使用VAR2CSA的DBLl_ID2a或IDl_ID2a片段筛选更大组的癌细胞(表6和7)。这种筛选的主要目的是鉴别适用于体内异种移植模型(xenograft modelling)的细胞系。
[0482]表4.使用VAR2CSA的最小结合结构域(IDl_ID2a)的癌细胞系和阴性对照细胞的染色。
[0483]仅用培养基(空白)或用重组蛋白(ID1-DBL2或IDl_ID2a)以75nM温育细胞30分钟，接着用抗V5-FITC (Invitrogen)以1:800温育，在每次温育之间将细胞洗涤三次。示出的是使用FC500流式细胞记录仪(Becton Dickinson)从最少5000个细胞记录的平均FITC荧光值。
[0484] 细胞炎咐ΨΓ\IDl-DBL2XaID1-1D2a
C325J76^9463.81
MyLa 2059?615^61145.35
MvLa 18505^875^6137.86
ChoWT3^094^3534J9
Cho 7454M4^29^38
PBMC?ΜUe?β?
红细胞UiU7?β?
[0485]表5.使用重组VAR2CSA的癌细胞系的染色
[0486]仅用培养基(空白)或用重组蛋白(DBLl-1D2a或IDl-1D2a)以75nM温育细胞30分钟，接着用抗V5-FITC (Invit1gen)以1:800温育，在每次温育之间将细胞洗涤三次。示出的是使用HALlOOZeiss显微镜从最少4个高功率场图像记录的FITC荧光强度的中位数评分(medium score)。NS:无染色;+:弱;++:中等;+++:强;++++:非常强。
[0487]
细胞类型SiDBLl-m2a
U20SNS+++
MG63NS++++
MDA-MB-231NS+++
TC32NS+
TC71NS++
MNNGNS+++
CHLA9NS++
CHLAlONS++
RH30NS+++
RH18NS++
PC3NS+++
[0488]表6针对重组VAR2CSA结合的多种人癌细胞系的筛选(使用DBLl_ID2a或IDl-1D2a)。
[0489]按照方法12中所描述的通过流式细胞仪测量结合。
[0490]NS:无染色；+:弱；++:中等；+++:强；++++:非常强。
[0491]细胞系对照 75 nM150 nM 备注

YAR2CSA YAR2CSA
MeWoNS+++++++黑素瘤(MekmomaX成纤维细胞形态，来源于淋巴


结)
A549NS++++++ 肺腺癌(lung adenocarcinomaXK-RasG12S)
HCC1395NS+++++++ 浸润性导管乳腺癌(invasive ductal breast


carcinoma)TNM阶段I等级3;无淋巴结转移:


Her2明性、ER阴性、PR阴性(三明性)
RH30NS+++++++ 横纹肌肉瘤(rhaMomyosarcoma)(TPp53 阴性；


PAX7-F0X01A融合阳性；高度基因组不稳定(>50

染色体重排))
MNNGNS++++++骨肉瘤(osteosarcoma),来自13岁女性高加索人种


(TPR-Met 阳性)
U20SNS++++++骨肉瘤(osterosarcoma)，来自15岁女性高加索人种


(IGF-R1和IGFR-1I阳性；TPp53野生型、pRb野生型、P16阴性；高度非整倍性(aneuploid))
H1792NS++++ 肺腺癌(lung aderK>carcinoimXK-RasG12S:



TPp53het)
[0492]
MDA-MD-435 NS+++++ 黑色素细胞来源的乳腺癌(breast carcinoma)(ER 阴


性、Her2阳性、PR阳性)
MG63NS+++++++ 骨肉瘤(osteosarcoma)
TC3 2NS++++ 尤因肉瘤(E\\ ing’ s sarcoma)
CHLA9NS++++ 尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)
CHLAlONS++++ 尤因肉瘤(Ewing.s sarcoma)
TC71NS++++ 尤因肉瘤(Ewing's sarcoma)
HOSNS+++++++ 骨肉瘤(osteosarcoma)
PC3NS++++ 前列腺癌(prostate carcinoma)
SKNMCNS+++++ 尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)
MCF-7NS+++ 乳腺癌(breast carcinoma)
[0493]表7针对重组VAR2CSA结合的更多种人细胞癌细胞系的筛选(使用DBLl_ID2a或IDl-1D2a)。
[0494]按照方法12中所描述的通过流式细胞仪测量结合。
[0495]所示出的值是利用200nM的蛋白质浓度的平均荧光强度。
[0496] 细胞类型^ 阴性对照IDl-1D2a |备注
GP20221.63111.37胃癌(gastric carcinoma)
NC1-N877.18207.72胃癌(gastric carcinoma)
MKN454.2255.4胃癌(gastric carcinoma)
MKN286.9103.84胃癌(gastric carcinoma)
AGS7.2518.21胃癌(gastric carcinoma)
KatoIII7.3318.76胃癌(gastric carcinoma)
SNlJ-14.33155.79胃癌(gastric carcinoma)
SNIJ-6388.478.49胃癌(gastric carcinoma)
IPA2207.7213.67胃癌(gastric carcinoma)
MDA-2313.3963.43三阴性(triple negative)乳腺癌
T47D3.6348.13管腔型(Iiiminal)乳腺癌
LNCap6.5824.86前列腺癌
PC35.229.82前列腺癌
Ovc3161.897.24卵巢癌干细胞
细胞类型空白DBLl-1D2a


急性淋巴细胞白血病(acute lymphatic
NALM-66，198 Ileukaemia, ALL)
[0497]
~697^ 3^23 ^ 30,36ALL
AMO-12,6835,22骨髓瘤(myelomatosis)
KMM-12.8216,1骨髓瘤(myelomatosis)
MOLP-82,4419,24骨髓瘤(myelomatosis)
KMS-12-PE3.027,14骨髓瘤(myelomatosis)
KMS-12-BM2,23,25骨髓瘤(myelomatosis)


弥散性大B细胞淋巴瘤(diJTuse large B-cell
U2932416,83lvmphoma)(DLBCL)
SU-DHL8ND3J5DLBCL
SU-DHL52j§10,28DLBCL
Oci_Lyl933818,96DLBCL
HBLl6^339^3DLBCL
Farage2^83^28DLBCL
RIVA226332DLBCL


低级滤泡性小裂细胞淋巴瘤(low-grade follicular
WSU-FSCCL4,8922.32small cleaved cell lymphoma)


成淋巴细胞性淋巴瘤(lymphoblastic lymphoma)
U-698-M7 ,4) 8)del(6)(ql5q22)
[0498]实施例9
[0499]重组VAR2CSA以高亲和力结合癌细胞
[0500]使用石英晶体微量天平生物传感器(Attana Cell200)分析重组VAR2CSA片段DBLl-1D2a与癌细胞系、C32黑素瘤和两种Cho细胞系(实施例8中描述的)的结合亲和力。针对与细胞表面的结合，在每次新的蛋白质注射之间结合表面再生的情况下，分析2倍稀释系列(25-400nM)的蛋白质。估算结合亲和力，处于与对纯受体的结合亲和力(表3)相似的纳摩尔范围(表8)内。
[0501]表8.重组DBLl_ID2a (大肠杆菌)与表达CSA的癌细胞(C32和Cho WT)的估算的结合亲和力(Kd)以及缺乏与CSA阴性细胞系(Cho 745)的结合
[0502]N/A:归因于缺乏与细胞的结合，不能确定Kd。
[0503]
细胞类咁K? (nM)
C32黑色素细胞13
Cho WT1.4
Cho 745N/A
[0504]实施例10
[0505]重组VAR2CSA蛋白质以高特异性结合癌组织
[0506]使用免疫组织化学(IHC)研究重组VAR2CSA与从人类患者获得的原发癌组织的结合。使用人胎盘组织作为阳性对照以及扁桃体和肝脏组织作为阴性对照进行该方法。在无表位修复的情况下，在Ventana Discovery XT平台上优化染色方案。将点在载玻片上的石蜡包埋组织用0.l-500nM V5-VAR2CSA(IDl-1D2a)或V5-对照蛋白质(DBL4)在室温下温育Ih,洗涤8分钟，用1:700小鼠抗V5抗体温育30分钟，洗涤8分钟。随后使用UltraMap抗小鼠HRP检测结合的抗V5。V5-VAR2CSA将人胎盘以0.5nM浓度染色，而在扁桃体或正常肝脏中无染色。可以通过将200 μ g/μ I CSA加入至反应缓冲液中来完全阻止染色。V5对照蛋白在任何所测试的浓度下都未将人胎盘组织染色。代表24个正常器官的多器官组织微阵列(TMA)当用InM V5-VAR2CSA染色时显示出低染色或不存在染色，而乳腺、结肠、直肠、前列腺、肾脏、肝脏、膀胱、胰腺、鳞状细胞、肺、胆囊、胃、睾丸、卵巢、子宫、肾上腺、甲状腺和胸腺、造血系统、和结缔组织的癌症样本(肉瘤)以等于或高于人胎盘阳性对照组织的强度被阳性染色(表9)。
[0507]表9.使用重组VAR2CSA的原发人肿瘤样本上CSA的检测。表示出了如在实施例10中描述的针对主要癌症组的阳性的数量/染色的情况的总数量。阳性染色被定义为等于或高于胎盘组织中观察到的强度的强度。
[0508]
癌症组I阳性比
膀月光癌(bladder carcinoma)44/56
前列腺癌(prostate carcinoma)71/76
乳腺癌(breast carcinoma)64/75
黑素瘤(melanoma)5/6
肉瘤(sarcoma)23/25
食道鱗状细胞癌(esophagus squamous cell carcinoma)2/3
胃腺癌(stomach adenocarcinoma)3/3
结肠癌(colon carcinoma)2/3
直肠腺癌(rectal adenocarcinoma)3/3
肝癌(liver carcinoma)3/3
肾癌(renal carcinoma)3/3
月市癌(lung carcinoma)2/3
宫颈癌(cervix carcinoma)3/3
卵巢癌(prostate carcinoma)2/3
弥散性 B 细胞淋巴瘤(diffuse B-cell lymphoma)T/3
星形细胞瘤(astrocytoma)3/3
姨腺癌(pancreatic carcinoma)3/3
[0509]实施例11
[0510]借助重组VAR2CSA蛋白的体外转化参数的抑制
[0511]通过三个不同的测定来研究未偶联的VAR2CSA对体外肿瘤细胞形态的抑制作用:
[0512]i)软琼脂菌落形成测定解决了 VAR2CSA是否可以抑制癌细胞在三维基质中增殖的能力。
[0513]ii)迁移测定解决了 VAR2CSA是否可以抑制癌细胞在博伊登室(boyden chamber)
中向化学引诱物垂直迁移的能力。
[0514]iii)侵入测定解决了 VAR2CSA是否可以抑制癌细胞通过人造基底膜侵入的能力。
[0515]软琼脂菌落形成测定:在接种在软琼脂基质中之前用25-100nM VAR2CSA处理细胞24小时，并且在37°C静置10-12天。图像通过相差显微镜捕获并通过ImageJ软件量化。
在75和150nM之间的浓度中，重组VAR2CSA抑制MG63骨肉瘤(osteosarcoma)和RH30横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)细胞的软琼脂菌落形成。
[0516]基底膜提取物(BME)包被的细胞侵入测定:为了模拟侵入过程，我们根据厂商规程使用 CultreCoat?24 孔 BME 包被的细胞侵入(24Well BME-Coated Cell Invas1nplatform)平台(Cedarlane),具有下列改变。细胞在测定前一天在25-lOOnM VAR2CSA存在或不存在的情况下进行血清饥饿。在第二天，将维持在以上条件下的细胞接种在平板的顶部室(IxlO5细胞/孔)中，而下室含有耗尽血清的培养基作为阴性对照或者补充有10%FBS的培养基。之后将细胞温育额外18小时。使用含有在活细胞中转化为高荧光化合物的钙黄绿素(Calcein)AM的解离缓冲液，收集通过BME侵入的细胞。使用荧光板计数器测量发出的荧光，通过FLUOStar软件分析，拟合标准曲线，并且转换为相应的数量的细胞。
[0517]迁移测定。迁移测定是与基底膜提取物(BME)包被的细胞侵入测定基本上相同的过程，但是不用BME。
[0518]MG63 骨肉瘤(osteosarcoma)、RH30 横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、和MDA-MB-231三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer)的迁移和侵入能力受75-150nM 重组 VAR2CSA 抑制。
[0519]实施例12
[0520]分析控制癌症细胞转化的细胞内信号传导事件-通过含CSA蛋白聚糖调节的参数。
[0521]CSPG4通过Ras、Racl和PI3激酶依赖性机制促进增殖、迁移和侵入。基于实施例10中得到的结果，我们将研究引起增殖、迁移和侵入的潜在的VAR2CSA介导的抑制的细胞内信号传导事件。这利用现有技术水平的生物化学和分子生物学方法完成，包括但不限于，Racl活化测定、通路组分的免疫印迹以及反应性氧物种(ROS)生成的细胞内测量。这一系列的实验将会阐明受VAR2CSA结合含CSA蛋白聚糖影响的信号传导通路。
[0522]Racl活性测定:根据厂商规程(Thermo Scientific)对未处理的或用重组VAR2CSA处理的适合的人癌细胞系进行Racl活性测定。
[0523]反应性氧物种(ROS)测定:根据厂商指导通过CM_H2DCFDA(Invitrogen)测量粗ROS水平。将使用二氢乙锭(DHE)测量超氧化物水平。在超氧化物阴离子02_存在下，二氢乙锭被迅速氧化为氧乙锭(oxyethidium),其结合DNA并且当在488nm激发时发出在570-580nm范围内的光。对于细胞培养来说，在适当处理之后，将细胞在Hank平衡盐溶液(Hank’s Balanced Salt Solut1n, HBSS)中洗涤，在含有 10μΜ DHE 的 HBSS 中温育 30-60分钟，在HBSS中洗涤并且用落射荧光HAL100显微镜(Zeiss)直接分析氧乙锭荧光。对于肿瘤切片来说，使用低温恒温器将快速冷冻的肿瘤切为20 μ m切片，按照针对细胞系所描述的洗涤并且DHE处理，固定在盖玻片上并且与细胞系一样进行分析。分析氧乙锭生成并且使用ImageJ软件量化。对于所有肿瘤样本来说，使用标准方法一边进行苏木精和曙红(H&E)染色一边确认组织完整性和病理性。初步数据表明，重组VAR2CSA抑制MG63和U20S细胞中的ROS生成。
[0524]免疫检测。对于免疫印迹来说，利用相关的一级抗体和适当的二级抗体、ECL蛋白质印迹(Western blotting)试剂(Thermo Scientific)、和膜(Kodak 和 Covance (HA)),检测通过SDS-PAGE分离的并且转移至硝基纤维素膜的蛋白质。对于显微镜来说，将细胞固定在4%甲醛中，用适当的一级抗体温育，用适当的二级FITC缀合抗体温育并且如实施例9中描述的通过显微镜分析。人癌细胞系(]\0从-]\^-231、]\^63、似03、1^32、1^71和冊30)与重组VAR2CSA(IDl-1D2a)或对照蛋白(DBL4)进行血清饥饿24h和在将血清加回至细胞之后在0、1、2、3、4、5、6和12h制备裂解物。使用这种方法，10nM VAR2CSA有效地抑制原癌基因酪氨酸蛋白激酶Src在T416的磷酸化、黏着斑激酶(FAK)在T397的磷酸化、细胞外信号调节激酶(ERK)在Thr202/Tyr204 (对于人ERKl来说)和Thrl85/Tyrl87 (对于人ERK2来说)的1-磷酸化和2-磷酸化。这提示重组VAR2CSA抑制癌细胞中典型的ERK信号传导。
[0525]实施例13
[0526]通过重组VAR2CSA调节的细胞内信号传导事件的无偏倚分析。
[0527]可以使用表达微阵列技术分析VAR2CSA对细胞内信号传导事件的广泛影响。MG63骨肉瘤(osteosarcoma)细胞被血清饥饿24h而未经处理，在血清加入Ih后收获VAR2CSA
或对照(DBL4)和RNA。对总RNA进行质量测试(RIN〈8)，将其用作用于Affymetrix?探针构造的模板并且与Affymetrix U133Aplus 2.0?芯片系统杂交。这种读数提供了在将血清加回Ih后活化或失活的信号传导通路的快照(snapshot)。初步数据确认了对ERK信号传导的抑制作用。
[0528]实施例14
[0529]借助重组VAR2CSA蛋白的癌细胞生长的体内抑制
[0530]基于来自体外分析的结果，将选择适当的细胞系用于免疫受损的小鼠中的体内皮下和转移异种移植模型。体内研究解决五个主要问题:
[0531]i)静脉内(1.V.)或腹膜内(1.p.)施用的重组VAR2CSA能否在体内示踪并结合人癌细胞？
[0532]ii)静脉内或腹膜内施用重组VAR2CSA能否在体内抑制肿瘤形成？
[0533]iii)静脉内或腹膜内施用重组VAR2CSA能否在体内抑制已形成的肿瘤的生长？
[0534]iv)静脉内或腹膜内施用重组VAR2CSA能否在体内抑制人癌细胞的转移性扩散？
[0535]V)静脉内或腹膜内施用重组VAR2CSA是否在体内改变人癌细胞中含CSA蛋白聚糖控制的信号传导事件(尸检病理学和生物化学)？
[0536]体内模型:将所选择的代表显示出与VAR2CSA的强结合的癌症类型的人癌细胞系以近似5xl06个细胞/动物皮下接种至Rag2m或SCID免疫受损的小鼠中。当肿瘤形成时，小鼠接受赋形剂(盐水)和重组VAR2CSA(lmg/kg)的第一注射。在近似30天的整个实验阶段中，每周一次重复处理。每隔二或三天测量动物体重和肿瘤体积，并且在终止时，将肿瘤摘除并分为两半，一半在液氮中快速冷冻，而另一半固定在石蜡中。处理快速冷冻的肿瘤用于如在实施例11中描述的(DHE)超氧化物检测(连同相同肿瘤样本的相应的苏木精和曙红[H&E]染色)。
[0537]实施例15
[0538]通过示踪物偶联的重组VAR2CSA肽在体内示踪微转移。
[0539]重组VAR2CSA将与不同的适用的示踪物分子偶联，所述示踪物分子是与外部合作伙伴合作的或者通过基于合同的协议外包的。针对其示踪和报告异种移植和转基因小鼠模型二者中的微转移的能力，分析可示踪重组VAR2CSA分子。按照在实施例12中描述的，建立体内模型。为了体内测试示踪物偶联的VAR2CSA，针对VAR2CSA示踪和结合微转移的能力，通过体内成像分析患有转移癌的小鼠。
[0540]实施例16
[0541 ] 重组VAR2CSA蛋白的内在化
[0542]通过癌细胞将重组VAR2CSA内在化。通过首先将VAR2CSA片段(DBLl_ID2a)与荧光团缀合，并且之后通过活体成像和基于固定的细胞二者分析VAR2CSA吸收，将其示出。将癌细胞系(C32黑素瘤和MDA-MB-231)接种并过夜生长至60-80%汇合。用荧光团缀合的VAR2CSA将细胞在4°C温育10-15分钟，以允许VAR2CSA的表面结合。之后洗涤细胞以移除未结合的VAR2CSA，并且随后在37°C温育以开始内在化10分钟、lh、2h、4h、并且至多22h。
[0543]荧光团缀合的运铁蛋白用于跟踪终结于溶酶体中的运铁蛋白典型的网格蛋白依赖性吸收。此外，对于一些实验来说，荧光团缀合的右旋糖苷用于检测溶酶体。活体成像分析显示，在大约4h后VAR2CSA开始达到溶酶体，并且在22h后，所有VAR2CSA都能位于溶酶体隔室。然而，VAR2CSA和运铁蛋白的共定位(colocalizat1n)是少有的，并且VAR2CSA的吸收比运铁蛋白慢得多。重组VAR2CSA被癌细胞吸收的事实使我们能够将VAR2CSA与在癌细胞内变成活性的细胞毒性化合物融合或缀合。表10总结了来自针对重组VAR2CSA内在化测试的指定癌细胞系的结果。
[0544]表10.仅用培养基(空白)或用重组蛋白(DBLl_ID2a或IDl_ID2a)以75nM温育细胞lh，接着用抗V5-FITC (Invitrogen)以1:800温育，在每次温育之间将细胞洗涤三次。示出的是使用HALlOOZeiss显微镜从最少4个高功率场图像记录的在细胞质膜或细胞内结构的FITC突光强度的中位数评分(medium score)。
[0545]评分系统为:
[0546]+:弱；++:中等；+++:强；++++:非常强。
[0547]
细胞系I细胞质膜定位(Ih后)I细胞内定位(Ih后)
U20S+++++
RH30++++
MG63+++++
MeWo+++++
HOS++++
MDA-MB-231+++++
SKNMC++++T+)
RH18++++
TC71+++
TC3+++
[0548]实施例17
[0549]融合VAR2CSA毒素蛋白杀伤癌细胞
[0550]已经将DBLl_ID2a和IDl_ID2a VAR2CSA基因片段与假单胞菌外毒素A和白喉毒素融合为各种构建体(SEQ ID N0:60-70、72)。在大肠杆菌中表达这些融合的VAR2CSA毒素蛋白。已经成功制备了基于来自VAR2CSA的IDl_ID2a和PE38的、被称为BPT1-1Dl-1D2aFCR3-PE38LR的蛋白构建体(SEQ ID NO:60)，并且按照方法13中描述的针对结合癌细胞(表11)以及细胞毒活性进行分析。
[0551]初步数据显示，这种融合VAR2CSA毒素蛋白结合表达CSA的癌细胞，并且能够诱导细胞死亡(U20S细胞系的IC50为低于InM)。
[0552]表11.通过流式细胞仪分析的VAR2CSA-PE38与癌细胞的结合
[0553]用抗PENTA HIS抗体和抗小鼠FITC抗体检测并通过流式细胞仪分析DBLl-1D2a(裸蛋白)和IDl_ID2a_PE38在200nM与Myla2059细胞(T细胞淋巴瘤)的结合。结合作为平均荧光强度(MFI)给出。a)用软骨素酶ABC处理细胞以从细胞表面移除CS链，b)在加入至细胞之前，将蛋白与可溶性CSA(400ug/m)混合，c)对照与仅用第一和第二层抗体染色的细胞相同。
[0554]

DBLl-1D2aID1-1D2a-PE38对照c
结合细胞24.712.42.3
结合处理过的细胞a4.42.52.5
结合的抑制b-
[0555]实施例18
[0556]分析与重组VAR2CSA偶联的细胞毒性化合物的抗肿瘤效果
[0557]基于实施例14中的结果，将要求重组VAR2CSA与相关的细胞毒性化合物偶联并且在体内测试性能。相关化合物与VAR2CSA的偶联将会与外部合作伙伴合作或者通过基于合同的协议外包进行。尤其是，我们分析这些VAR2CSA:化合物融合体能否:
[0558]i)在体内被特异性地递送至肿瘤环境。
[0559]?)在体内肿瘤环境中集中并且特异性地保留。
[0560]iii)在体内以对正常组织最小的伤害杀伤肿瘤细胞。
[0561]按照在实施例12中描述的，建立体内模型。用细胞毒性VAR2CSA缀合物处理小鼠，并且按照对于实施例12中未缀合蛋白所描述，测定效果。
[0562]实施例19
[0563]来自异质细胞种群的表达CSA的干细胞的纯化。
[0564]已经报道多能干细胞表达高水平的CSPG4。干细胞还表达VAR2CSA可以结合的其他含CSA蛋白聚糖，如⑶44。因此，重组VAR2CSA将与适当的树脂(珠)缀合，与除含干细胞或癌干细胞外的异质细胞种群混合并且需要通过常规离心方案纯化。针对多种干细胞标记的表达，包括CD44、CD31、CD4、0CT4、S0X2、巢蛋白(Nestin)和Nanog，将通过免疫印迹(与在实施例11中相同)、显微镜和FACS (如在实施例中9中)分析纯化的细胞。癌干细胞的常见性状是醛脱氢酶IA的高度表达(ALDH1高)。可以使用AldeFluor?试剂盒(StemCell Technologies)方便地对其进行测量。结合MDA-MB-231的重组VAR2CSA检测ALDHl高细胞的亚群，提示VAR2CSA可以结合人癌干细胞。
[0565]实施例20
[0566]表达⑶44的癌干细胞的鉴别和靶向。
[0567]⑶44目前是用于癌干细胞的最普及的标记并且它是可以结合重组VAR2CSA的含CSA蛋白聚糖。通过使用与在实施例12-15中相同的方法，将研究未修饰的和修饰的重组VAR2CSA肽是否可以定位、结合、纯化并且潜在地杀死高抗性⑶44阳性癌干细胞。
[0568]实施例21
[0569]循环肿瘤细胞的检测
[0570]我们将检验重组VAR2CSA是否可以被用作针对癌症复发的预后标记。癌细胞在从原发肿瘤脱离后通过血液系统扩散。循环肿瘤细胞(CTC)的发生的后续风险是溢出和转移。目前用于检测CTC的测定灵敏度差并且不能直接找出与转移的风险的相关性。使用VAR2CSA偶联的磁珠和流式细胞仪，我们将研究检测血流中表达CS的癌细胞的预后值。可以使用这种方法作为患者的快速且无痛的检查。
[0571]实施例22
[0572]潜在的由VAR2CSA靶向的CSPG分子的鉴别
[0573]针对与表达>3000个人膜受体的一组转染的HEK293细胞的结合，筛选具有V5标签的重组VAR2CSA蛋白(DBLl-1D2a)。已经鉴别了一组25种受体作为VAR2CSA的潜在靶点(表12)。在HEK293系统和ELISA 二者中，借助结合特异性的分析通过用CSA和HS抑制，将进一步确认VAR2CSA与这些受体之间的相互作用。
[0574]表12.实验鉴别为VAR2CSA的潜在靶点的受体。
[0575]基因 Π)名称UniProt/Swis sProt
BCAN短蛋白聚糖(brman)PGCB HUMAN.096GW7
BDKRB2缓激肽(bradykimn)受体 B2BKRB2 HUMAN.P3Q411
CA9碳酸酐酶 IXCAH9 HUMAN.016790
CCRlO趋化性细胞因子(chemokme)(C-C 基序)受CCRlO HUMAN.P46Q92
体10
CD44CD44 分子C印度血型)CD44=HUMAN.P16070
CDH8I丐粘着蛋白(cadhenn)8，2 型CADH8 HUMAN.P55286
CFB补体因子 BCFAB HUMAN.VOOl51
GABBR2γ-氨基丁酸(GABA)B 受体，2GABR2 HUMAN.075899
GPC3磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypiCaii)3GPC3 HUMAN:P51654
GPC5鱗脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)5GPC5 HUMAN；P78333
GPR65G 蛋白偶联受体 65PSYR HUMAN.Q8IYL9
GPRC5BG蛋白偶联受体，C家族，5群，成员BGPC5B HUMAN, Q9NZH0
KCNA2钾电压门控通道，shaker相关亚家族，成KCNA2 HUMAN.P16389
PkD2多囊性肾病(polycystic kidney disease)2(常PKD2—HUMAN, 013563
染色体显性)
PODXL2足糖萼蛋白类似物(podoCalyxm-like)2PDXL2 HUMAN.Q9NZ53
PTPRG蛋白酪氨酸磷酸酶，受体类型，GPTPRG HUMAN.P2347Q
S100A9SlOO 钙结合蛋白 A9S1QA9 HUMAN.P06702
SDCl多配体蛋白聚糖(synckcan)ISDCl HUMAN.P18827
[0576]SDC4多配体蛋白聚糖(syndecanHSDC4 HUMAN.P31431
~^TX2突触融合蛋白(syntaxra)2STX2 HUMAN.P32856
STXBP5突触融合蛋白(syntaxm)结合蛋白STXB5 HUMAN, Q5T5CQ

5(tomosyn)
TGFBR3转化生长因子，β 受体 IIITGBR3 HUMAN, Q03167
TMEFFl具有 EGF 样和两个卵泡抑制素(follistatm)TEFFl HUMAN.08IYR6
样结构域I的跨膜蛋白
TMEFF2/TENB2 具有 EGF 样和两个卵泡抑制素(follistatm)TEFF2 HUMAN.Q9UIK5
样结构域2的跨膜蛋白
TMEM154跨膜蛋白154(?
[0577]?λ? ID?\-ftiUniProt/SwissProt
BCAN短蛋白聚糖(bmvican)PGCB HUMAN.096GW7
BDKRB2缓激肽(bradykmm；)受体 B2BKRB2 HUMAN.P3Q411
CA9碳酸酐酶 IXCAH9 HUMAN.016790—
CCRlO趋化性细胞因子(chemokme)(C-C 基序:)受体 10CCRI O—HUMAN.P46092—
CD44CD44 分子(印度血型)CD44 HUMAN.P16Q7Q~
CDH8钙粘着蛋白(Cadhenn)S，2 型CADH8 HUMAN, P55286
CFB补体因子 BCFAB HUMAN.PQQ751~
GABBR2γ-氨基丁酸(GABA)B 受体，2OABR2 HUMAN.Q75899~
GPC3磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glyp1Cmi)3GPC3 HUMAN.P51654~
GPC5磷脂酰肌醇蛋白聚糖(g〗yp1Can)5GPC5 HUMAN, P78333
GPR65G 蛋白偶联受体 65PSYR HUMAN.Q8IYL9~
GPRC5BG蛋白偶联受体，C家族，5群，成员BGPC5B HUMm





?.)9Ν/1 !O
KCNA2钾电压门控通道，shaker相关亚家族，成员2KCNA2 HUMAN, P16389
PKD2多囊性肾病(polycystic kidney disease)2(常染色体显性) PKD2_HUMAN, Q13563
[0578] 15ODX1.2 足糖萼蛋白类似物(podocalyxm-hkePPDXL2 HUlMAM



OVNZ53
PTPRG蛋白酪氨酸磷酸酶.受体类型，GPTPRG HUMAN, P23470
S100A9SlOO 钙结合蛋白 A9S10A9 HUMAN, P06702—
SDCl多配体蛋白聚糖(s:oideCan)lSDCl HUMAN, P18827
SDC4多配体蛋白聚糖(syndecan)4SDC4 HUMAN.P31431
STX2突触融合蛋白(syntaxm)2STX2 HUMAN.P32856~
STXBP5突触融合蛋白(syntaxm)结合蛋白 5(tomoSyn)STXB5 HUMAN, Q5T5C0
TGFBR3转化生长因子，β 受体 IIITGBR3 HUMAN, 003167
TMEFFl具有ECiF样和两个卵洵抑制素(Tollistatm'i样结构域]的跨TEFFl HUMAN, Q8IYR6
膜蛋白
TMEFF2/TEN具有EClF样和两个卵泡抑制素(follistatm)样结构域2的路TEFF2 HUMAN, Q9U1K5
B2膜蛋白
TMEM154跨膜蛋白 154"(?)
THBD血栓调节蛋白(thrombomodulin)TRBM HUMAN.P07204
CSPG5硫酸软骨素蛋白聚糖5(神经聚糖(neuroglycan)C)CSPG5 HUMAN, 095196
STXBP5突触融合蛋白(syntaxm)结合蛋白 5(tomosyn；)STXB5 HUMAN.Q5T5C0
[0579]讨论
[0580]疟疾是最常见的感染性疾病之一和最严重的全球健康问题之一。孕妇尤其容易受到感染，即使之前获得了免疫力。在本研究中，我们已经解决了 PM中与VAR2CSA-CSA相互作用后的分子机制相关的关键问题。
[0581]前面的工作已经提出，VAR2CSA中的最小CSA结合区域是DBL2X-1D2b，并且需要 DBLlX 或 DBL3X 用于完全亲和力结合(Dahlback, M., Jorgensen, L.M., Nielsen, Μ.A., Clausen, T.M., Ditlev, S.B., Resende, M., Pinto, V.V., Arnot, D.E., Theander, T.G.,和Salanti, A.J B1l Chem 286,15908-15917)。在本工作的后续中，我们关注于DBL2X区域，对VAR2CSA做出了进一步截短。我们表明，核心CSA结合位点位于DBL2X结构域内，其包括侧翼结构域间区域的小部分。如前面所提出的，结合并不依赖于ID2b区域或依赖于DBLlX或DBL3X侧翼结构域。根据IDl-1D2a与IDl-DBL2Xb的特异性CSPG结合(表3)，这是显而易见的。最小结合区域是IDl-DBL2Xb，其以可与全长VAR2CSA相比的特性结合CSPG。
[0582]有趣的是，这些新数据将核心CSA结合位点描绘在单一结构域上。前面已经示出，DBL2X(和任何其他单一 DBL结构域)与CSA的结合是非特异性的并且具有弱亲和力(Resende, M., Ditlev, S.B., Nielsen, M.A., Bodevin, S., Bruun, S., Pinto, V.V., Clausen, H., Turner, L., Theander, T.G., Salanti, A.,和 Dahlback, M.(2009) Int J Parasitol39，1195-1204)。显然，IDl和部分ID2a结构域间对CSA结合来说是必需的。DBLlX_DBL2Xa和IDl-DBL2Xa不结合CSPG。两个C端DBL2X边界(DBL2Xa和DBL2Xb)相差93个氨基酸。因为这些氨基酸的缺失消除了结合，所以它们对CSA结合一定是重要的。
[0583]IDl_DBL2Xb最小结合区域比全长VAR2CSA小得多，其仅具有62kDa的分子量。VAR2CSA的进一步的大量截短不大可能会在结合CSA中起作用。我们的数据将DBL2X重新定义为较大的功能结构域，其结合了侧翼IDl和ID2a结构域间的部分。
[0584]针对PM的基于VAR2CSA的疫苗必须能够诱导强力的保护性免疫应答。在此，最重要的方面是能够抑制胎盘特异性寄生物粘附的IgG抗体的生成。为了测试我们制备的片段的免疫原性特征，我们将其用于大鼠的免疫中。针对所有含有CSA结合位点的片段产生的血清抑制了对CSA的寄生物粘附。重要的是，针对IDl-1D2a产生的血清导致几乎完全抑制。这提示，最小CSA结合片段保持诱导强抗粘附免疫应答的能力。这种论断由以下事实进一步支持:从IDl-1D2a上的抗FV2血清纯化的抗体保留了大部分粘附阻断活性，以及抗IDl-1D2a抗体消耗的抗FV2样品丧失了其活性的大部分。这表明，用于诱导粘附阻断抗体所需的表位位于该区域内。
[0585]在本研究中，我们已经在FCR3寄生物的同源抑制中测试了抗VAR2CSA血清与CSA的结合。重要的是，疫苗能够抑制胎盘粘附而无论寄生物株系来源。因此对疫苗开发的主要担忧是寄生物变体中的高的克隆间多样性。尽管重组全长VAR2CSA免疫原性非常强，但是所制备的抗体不具有交叉抑制性(Avril, M., Hathaway, M.J., Srivastava, A., Dechavanne, S., Homme I, M., Beeson, J.G., Smith, J.D.,和 Gama in, B.PLoS One 6, el6622)。最近的研究表明，利用来自FCR3的ID1-DBL2X的DNA疫苗接种诱导具有交叉抑制性的抗体，抑制其他实验室株系以及本领域中分离的寄生物的CSA粘附(Bordbar, B., Tuikue-Ndam, N., Bigey, P., Doritchamou, J., Scherman, D.,和 Deloron, P.Vaccine (疫苗))。这支持了这种小型片段在PM疫苗中的用途。
[0586]Cardin和Weintraub预测，GAG结合位点将会采取两种形式之一(Cardin, A.D.,和 Weintraub, H.J.(1989)Arter1sclerosis 9,21-32)。它们是 X-B-B-X-B-X 和Χ-Β-Β-Β-Χ-Χ-Β-Χ，其中X是任何亲水性残基，并且B是任何碱性残基，优选精氨酸。二者都描述了针对硫酸化二糖的结合位点。尽管可以发生许多相互作用，带负电的硫酸盐与碱性氨基酸之间的离子相互作用被认为是最重要的。我们使在最小结合区域内的这两个位点突变；在 DBL2X 中的 625-GKNLKKRY-632 和在 IDl 中的 458-NKKKECKD-465。我们还删除了位于DBL2X的N端部分中的二态序列基序(DSM)内的一个大区域，因为已经提示其具有结合功能。DSM区域的缺失对CSA结合没有影响。推定的GAG结合位点中的任何置换也没有影响。这清楚地表明，这些位点在CSA结合中具有很少作用或没有作用。
[0587]已经表明，对人CSA受体的最小结合要求是含有2-4C4硫酸化GalNAc单糖的十二糖(AlkhaliI, A., Achur, R.N., Valiyaveettil, M., Ockenhouse, C.F.,和 Gowda, D.C.(2000) J B1l Chem 275,40357-40364)。很明显，表达VAR2CSA的寄生物在体内对仅携带2-8% C4硫酸化二糖单元的CSA具有高特异性。为了检验VAR2CSA-CSA复合物形成是否取决于离子相互作用，我们在不同的盐浓度下测试了结合。当用Log对Log[Na+]作图时，IDl-1D2a、DBLlX_ID2a 和 FV2 在 150mM-300mM NaCl 中的结合显示出线性关系。我们发现结合取决于最大2-3个离子相互作用。有趣的是，全长蛋白质的值高于较短片段的值，表明该蛋白质与CSA进行额外的离子相互作用。在本研究中，我们已经筛选了含有CSA特异性的高亲和力结合区域的片段。可以在蛋白的下游区域发生更多的相互作用，但是核心位点位于DBL2X内。外推并寻找Y截距([Na+] = 1M> Log[Na+]=O)告诉我们，FV2的Kd,非离子=5.9μπι, DBLlX-1D2a的KD,非离子=3.4 μ m，并且IDl_ID2a的Kd,嫌=0.7 urn.这表明，仅25-30 %的VAR2CSA-CSA结合可能是由离子相互作用引起的。这与其他GAG结合蛋白不同，其他GAG结合蛋白在相似测定中已经显示出对离子相互作用的高达 80-90% 的依赖性(FalIer, B., Mely, Y., Gerard, D.,和 Bieth, J.G.(1992)B1chemistry 31, 8285-8290 ；Hileman, R.Ε., Fromm, J.R., ffeiler, J.M.,和 Linhardt, R.J.(1998) B1essays 20,156-167)。
[0588]我们的数据提示，VAR2CSA-CSA相互作用与常规的GAG蛋白相互作用不一致。我们假设，高CSA亲和力是通过多价相互作用获得的，其可以包括与CSA碳水化合物骨架发生非离子相互作用的多个结合位点。一些相互作用是离子相互作用并且一些程度的硫酸化对VAR2CSA结合来说是必需的。因此可能存在碱性氨基酸与硫酸盐之间的相互作用，但是这种并非亲和力的决定因素。
[0589]在本研究中，我们已经定义了一种小型单一结构域VAR2CSA片段，其可以在真核细胞中制备为功能性CSA结合蛋白，并且具有诱导高度粘附阻断抗体的能力。这种片段具有成为针对PM的疫苗的有力候选物的潜力。
[0590]数据确定了特异性结合CSA从而介导感染的红细胞的胎盘结合的VAR2CSA的小型重组部分。我们表明，通过与在CSPG4或在本研究中鉴别的其他蛋白骨架上存在的CSA的相互作用，这种VAR2CSA片段还特异性结合癌细胞。此外，我们发现基于这种小型片段的VAR2CSA多肽与癌细胞的结合抑制了细胞的迁移和侵入。这些VAR2CSA多肽还抑制了典型的ERK信号传导，并且我们发现与毒素融合的VAR2CSA多肽有效杀死癌细胞。
[0591]方法
[0592]方法1-昆虫细胞中的克隆和蛋白表达
[0593]由密码子优化的FCR3 (GenBank 编号⑶249598)或 3D7 (GenBank 编号 JQ247428)VAR2CSA基因，使用特异性引物(表2)，扩增VAR2CSA序列片段。在单步PCR中扩增简单片段。在两步PCR中制备氨基酸置换构建体。第一 PCR由密码子优化的FCR3模板扩增两个片段，含有重叠的互补端。第二 PCR利用两个重叠片段作为模板，利用对外部边界特异性的引物扩增总构建体。对所有片段进行测序验证。将片段克隆至杆状病毒载体pAcGP67-A(BDB1sciences)，并修饰为在C端含有V5和His标签。将在杆状病毒感染的昆虫细胞中表达的蛋白作为可溶性蛋白分泌至细胞培养物上清液中。简而言之，线性化的Bakpak6杆状病毒DNA (BD B1sciences)与pAcGP67_A质粒共转染至Sf9昆虫细胞中，以产生重组病毒颗粒。使用1ml的第二扩增物，在400ml无血清培养基(10486、GIBC0)中以IxlO6个细胞/ml的密度感染High-Five细胞。在初始感染3天后，从上清液中收获分泌的重组蛋白。在蛋白纯化前，将上清液过滤(0.2 μ m)、透析并浓缩。
[0594]方法2-蛋白纯化与SDS-PAGE
[0595]使用ΑΧΤΑ横向流(cross-flow) (GE Healthcare)将含有分泌的重组蛋白的过滤的上清液透析。透析在 1mM NaH2PO4(pH 7.4, Sigma-Aldrich)和 500mM NaCl 中进行。将得到的溶液过滤(0.2μπι)并且加入咪唑至最终浓度为15mM。之后在l_ml HisSelect柱(H8286, Sigma-Aldrich)上纯化蛋白。用 1mM NaH2PO4(pH 7.4)、500mM NaCl、和 500mM咪唑将结合的蛋白洗脱。通过使用HiLoad 16/60Superdex 200柱(GE Healthcare)的在20mM Tris (pH 8)和200mM NaCl中的尺寸排阻层析，进一步纯化石英晶体微量天平测量和SAXS所需的蛋白，以得到单体。通过SDS-PAGE确认蛋白的纯度和结构完整性。
[0596]方法3-ELISA
[0597]对于CSPG (牛)(D8428，Sigma)或 HSPG (H4777，Sigma)在 3 μ g/ml 的浓度下，并且对于 CSA (C9819，Sigma)、CSC (400675，Seikagaku)、和 CSB(C3788, Sigma)在 100 μ g/ml 的浓度下，将Falcon微量滴定板(351172，BD B1sciences)在4°C下温育过夜。之后用TSM结合缓冲液(25°C下的 20mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2、0.05% 吐温-20、I % BSA、PH7.4)将平板在摇床上在37°C下封闭2小时。在TSM结合缓冲液中制备2倍稀释系列(1.56mM-100mM)的蛋白，并且将其加入至平板，其在摇床上在37°C下温育I小时。所有测量均以一式三份进行。将平板在TSM洗涤缓冲液中洗涤三次(25°C下的20mM Tris、150mM NaCl、2mM CaCl2,0.05% 吐温-20、ΡΗ7.4)。之后用 1:3000 抗 V5-HRP 抗体(R96125，Invitrogen)将平板在TSM结合缓冲液中在摇床上在37°C下温育I小时。将平板在TSM洗涤缓冲液中洗涤三次。最终用邻苯二胺底物(DAKO)使平板显色15分钟。用2.5M H2SO4使反应猝灭。在490nm测量吸光度。
[0598]方法4-石英晶体微量天平(Attana A100)
[0599]使用镀金的1MHz AT切割的石英晶体、聚苯乙烯芯片(3611_3103Attana AB)，在Attana AlOO (Attana AB)上进行实验。将所有缓冲剂和试剂过滤至0.2 μ m。配体为CSPG (牛)(D8428，Sigma)或 HSPG(H4777，Sigma)，以 100 μ g/ml 的浓度包被。通过在室温下加入配体溶液并温育30分钟以稳定状态完成包被。接着用含有0.1%无Ig BSA(BSA-50,Rockland)的PBS将平板在室温下封闭30分钟。在每次实验前，使用制造商预定的每日洗涤程序，用1% SDS洗涤Attana AlOO0洗涤之后，将运行缓冲液切换为在25°C下的流量为25 μ I/分钟的PBS，并且使机器稳定在0.5Hz/分钟的最大频率变化。一旦稳定，即多次注射PBS,以显示注射过程最低限度地影响基线。在样品注射前，注射PBS作为空白。以1:3稀释系列(0.25 μ g/ml-60 μ g/ml)注射分析物，以最低浓度开始。将结合时间设定为84秒并且解离时间为5分钟。归因于高结合亲和力，在注射之后不可能再生结合表面。在AttesterEvaluat1n软件(Attana AB)中处理收集的数据。以简单1:1模型拟合曲线。通过曲线拟合确定km和Iitxff,并且根据Kd = koff/kon计算Kd。
[0600]方法5-盐滴定测定
[0601]在ELISA中基于结合测定对VAR2CSA-CSA结合的离子依赖性进行测试。以3 μ g/ml包被CSPG。以几个不同的NaCl浓度(150mM、200mM、250mUP 300mM)加入1:2稀释系列(400-1.56nM)的蛋白。所有实验均以一式三份进行。在Graphpad Prism中使用非线性回归(最小平方与hill斜率拟合)，针对每个滴定系列计算Kd值。
[0602]方法6-动物免疫与血清提取
[0603]所有动物免疫均符合国家和欧洲规定。用在弗氏完全佐剂(Freunds completeadjuvant) (F5881, Sigma-Aldrich)中的30 μ g重组蛋白对Wistar大鼠进行皮下注射。用在弗氏不完全佐剂(F5506，Sigma-Aldrich)中的15 μ g蛋白以3周的间隔加强免疫三次。在每次加强之后一周采集血液样品，通过离心提取血清。
[0604]方法7-1gG亲和纯化
[0605]在Iml NHS 活化的 HP 柱(HiTrap NHS 活化的 HP，17-0716-01，GE Healthcare)上，亲和纯化来自用全长FCR3VAR2CSA (FV2)免疫的大鼠的血清储备品，所述柱含有固定化多结构域 FCR3 蛋白(DBLlX-DBL2Xa、DBLlX_ID2a、IDl_ID2a、或 ID1-DBL4 ε )和全长 FV2。根据制造商规程完成纯化。简而言之，通过将Iml偶联缓冲液(0.2M NaHCO3,0.5M NaCl,pH 8.3)与配体(浓度0.5-10mg/ml)的1:1溶液加入至柱中，完成配体与柱的偶联。将柱密封并在室温下温育30分钟，接着在4°C下温育过夜。用6ml缓冲液A (0.5M乙醇胺，0.5MNaCl，pH 8.3)、6ml缓冲液B (0.1M乙酸酯，0.5M NaCl，pH 4)以及最终6ml缓冲液A洗涤柱。在室温下30分钟的温育阶段之后，以相反的顺序(缓冲液B、A、B)重复洗涤。在纯化血清前，注射8-10ml PBS以调节pH。使样品通过柱3_5次。在用1ml洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸，pH 2.7)洗脱抗体前，用1ml PBS洗涤柱。
[0606]方法8-恶性疟原虫寄生物培养物
[0607]使用5%血细胞比容(人血型O Rh+)，在补充有25mM NaHC03、0.125 μ g/ml硫酸庆大霉素(gentamycin sulfate) (BE02012E，Lonza)、0.125 μ g/ml AlbuMAX 11(11021029，Invitrogen)和2%正常人血清的寄生物培养基RPM1- 1640 (BE12115F, Lonza)中，维持恶性疟原虫FCR3型寄生物的培养物。在BeWo细胞(CCL98，ATCC)上对IE反复淘选以维持CSA粘附表型。此外，分离株测试为支原体阴性并且通过使用嵌套GLURP (富含谷氨酸的蛋白)和MSP-2(裂殖子表面蛋白2)引物的PCR常规确定基因型。
[0608]方法9-晚期营养体的纯化
[0609]针对晚期营养体和裂殖体阶段，使用MACS CS柱(130-041-305，Miltenyi B1tec)和Var1-MACS磁体(Miltenyi B1tec)使寄生物培养物在强磁场中富集化。简而言之，向柱施加寄生物培养物悬浮液。之后用在PBS中的2%胎牛血清(F6178，Sigma-Aldrich)洗涤柱。在从磁体中分离后，将晚期感染的红细胞从柱中洗脱，旋转沉淀并且在PBS中的2%胎牛血清中重悬并稀释为2xl06IEs/ml的浓度。
[0610]方法10-流式细胞仪(FCM)
[0611]通过流式细胞仪(FCM)，测量与纯化的晚期营养体感染的红细胞上的天然VAR2CSA结合的抗体。用血清(针对非特异性结合，通过与未感染的红细胞预温育消耗的)标记在含有2% FCS的PBS中的浓度为2xl05IEs/ml的100 μ I纯化的晚期寄生物，最终浓度为1:10。在含有2% FCS的PBS中洗涤细胞三次。之后用最终浓度为2 μ g/ml的溴化乙锭(15585011, Invitrogen)和 FITC 标记的二级抗大鼠 IgG 抗体(62-9511, Invitrogen)的1:100稀释物进一步标记细胞。作为阴性对照，还利用来自用除VAR2CSA外的抗原并且仅用二级抗体免疫的大鼠的血清，温育晚期寄生物。使用FC500流式细胞仪(BeckmannCoulter)收集来自5000个溴化乙锭阳性IE的数据。最终，使用WinList 5.0软件(VerifySoftware House)确定中位数突光强度。
[0612]方法11-结合CSPG的寄生物的抑制
[0613]针对其抑制IE结合CSPG的能力，分析血清抗体。这利用机器人标准化洗涤方法，以96孔板形式完成。用2 μ g/ml CSPG(D8428，Sigma-Aldrich)包被孔。将在100 μ I中总计2χ105氚标记的(次黄嘌呤单盐酸盐，PerkinElmer, NET177005MC)晚期IE以一式三份加入至孔中。之后在37°C用血清将标记的IE温育90分钟。通过移液机器人(BeckmanCoulter)洗去未结合的IE。通过在Topcount NXT (Perkin -Elmer)上的液体闪烁计数,确定粘附IE的比例。
[0614]方法12a_癌细胞结合测定
[0615]使用流式细胞仪(FCM)测试VAR2CSA最小结合多肽与在各种细胞系表面上表达的CSPG的反应性。在补充有10%胎牛血清(CH0细胞，C32)的RPM1、维持在37°C下5%二氧化碳中或由(PD缓冲液中人血液样品(人红细胞)纯化的Hams F12 (Beffo)中，培养细胞。在黑暗中、+4C、平静搅拌的情况下，细胞的等分试样(1X105)先后暴露于VAR2CSA最小结合多肽(150、75 或 37nM)和在 FACS2 (PBS+2 % FCS)中稀释的 a -V5-FITC(1:800)(Invitrogen) 30分钟。作为阴性对照，使用最小结合多肽的截短形式和FACS2缓冲液。基于前向和侧散射信号，门控(gated)完整的细胞。使用FC500流式细胞记录仪(BeckmanCoulter)从最少5000个细胞获得数据。在单一测定中处理并分析特定细胞系有关的所有样品。
[0616]方法12b_癌细胞结合测定
[0617]作为以上流式细胞仪测定的备选方案，用VAR2CSA最小结合多肽和在HBSS中稀释的a-V5-FITC (1:500) (Invitrogen)温育细胞。以与上面所写的相同的浓度使用VAR2CSA多肽。在a-V5-FITC染色之后，将细胞在HBSS中洗涤3次，在无酶细胞脱落缓冲液(Invitrogen)中收集并且在 FACS Calibur (BD B1sciences)上分析 FL-1 信号强度。
[0618]缩写:CIDR，富含半胱氨酸的结构域间区域；CSA，硫酸软骨素A;CSPG，硫酸软骨素蛋白聚糖，DBL, Duffy结合样结构域；FCM，流式细胞仪；FV2，VAR2CSA蛋白的不含N端区段的全长胞外结构域；HSPG，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖；ID，结构域间；IE，恶性疟原虫感染的红细胞；NTS，N端区段；PM，胎盘疟疾；PfEMPl，恶性疟原虫红细胞膜蛋白I ;PM，胎盘疟疾。
[0619]方法13-融合VAR2CSA毒素蛋白的体外细胞毒性测试
[0620]实验前一天，将癌细胞系以500，O个细胞/孔接种在96孔板中。在实验当天，将融合VAR2CSA-毒素的10倍稀释系列(范围为10 μ g/ml至0.01ng/ml)和对照蛋白(不含毒素的VAR2CSA)加入至单独的孔中。对于两种蛋白，制备还含有400 μ g/ml的CSA的相似的稀释系列并且加入至单独的孔中。将具有蛋白的孔在37°C温育72小时。通过MTT细胞增殖测定分析细胞死亡，其中读数为在570nm的吸光度。
[0621 ] 方法14-石蜡包埋的人组织样品的染色
[0622] 使用免疫组织化学(IHC)研究重组VAR2CSA与从人患者获得的原发癌组织的结合。将点在未接受抗原修复(antigen retrieval)的载玻片上的石腊包埋的组织用
0.l-500nM V5-VAR2CSA变体或V5-对照蛋白质(DBL4)在室温下温育lh，洗涤8分钟，用I: 700小鼠抗V5抗体温育30分钟，洗涤8分钟。随后，使用UltraMap抗小鼠HRP，使用Ventana发现XT平台，检测结合的抗V5。
【权利要求】
1.一种VAR2CSA的分离的蛋白片段，所述片段由以下连续的氨基酸序列组成: a)IDl，和 b)DBL2Xb,以及任选地
c)ID2a。
2.根据权利要求1所述的分离的蛋白片段，所述片段以下述亲和力结合在蛋白聚糖(CSPG)上的硫酸软骨素A (CSA)，通过Kd测量的所述亲和力低于ΙΟΟηΜ，如低于80nM，如低于70nM,如低于60nM，如低于50nM，如低于40nM，如低于30nM，如低于26nM，如低于24nM，如低于22nM，如低于20nM，如低于18nM，如低于16nM，如低于14nM，如低于12nM，如低于ΙΟηΜ，如低于9nM,如低于8nM,如低于7nM,如低于6nM、或低于4nM。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的分离的蛋白片段，所述片段包含与以下中的任一个氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的1-577、SEQ ID NO:3的 1-592、SEQ ID NO:4 的 1-579、SEQ ID NO:5 的 1-576、SEQ ID NO: 10 的 1-586、SEQ IDNO:11 的 1-579、SEQ ID NO:29 的 1-565、SEQ ID NO:34 的 1-584、SEQ ID NO:36 的 1-569、SEQ ID NO:37 的 1-575,SEQ ID NO:38 的 1-592,SEQ ID NO:41 的 1-603,SEQ ID NO:43 的1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ IDNO:53 的 1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的蛋白片段，所述片段包含与以下中的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID NO:1的578-640、SEQ ID NO:3的593-656、SEQ ID NO:4 的 580-643、SEQ ID NO:5 的 577-640、SEQ ID NO: 10 的 587-650、SEQ ID NO: 11 的 580-643、SEQ ID NO:29 的 566-628、SEQ ID NO:34 的 585-647、SEQ IDNO:36 的 570-632、SEQ ID NO:37 的 576-639、SEQ ID NO:38 的 593-655、SEQ ID NO:41 的604-667、SEQ ID NO:43 的 589-652、SEQ ID NO:44 的 566-628、SEQ ID NO:45 的 590-653、SEQ ID NO:48 的 574-637、SEQ ID NO: 53 的 584-646、或 SEQ ID NO: 54 的 570-632。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白片段，所述片段包含与以下中的氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列:SEQ ID N0:2、6、8、9、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、35、39、40、42、46、47、49、50、51、或 52。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的蛋白片段，所述片段由与以下中的任一个氨基酸序列具有至少70%序列同一性的氨基酸序列组成:SEQ ID NO:1的1-577、SEQ IDNO:3 的 1-592、SEQ ID NO:4 的 1-579、SEQ ID NO:5 的 1-576、SEQ ID N0:10 的 1-586、SEQ ID NO:11 的 1-579,SEQ ID NO:29 的 1-565,SEQ ID NO:34 的 1-584,SEQ ID NO:36 的1-569、SEQ ID NO:37 的 1-575、SEQ ID NO:38 的 1-592、SEQ ID NO:41 的 1-603、SEQ IDNO:43 的 1-588、SEQ ID NO:44 的 1-565、SEQ ID NO:45 的 1-589、SEQ ID NO:48 的 1-573、SEQ ID NO:53 的 1-583、或 SEQ ID NO:54 的 1-569。
7.根据权利要求1所述的分离的蛋白片段，所述片段由选自由以下组成的列表的氨基酸序列组成:SEQ ID N0:l、3-5、10、ll、29、34、36-38、41、43-45、48、53、和 54。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的蛋白片段，所述片段由以下氨基酸序列组成，所述氨基酸序列长度小于700个氨基酸，如小于690个氨基酸，如小于680个氨基酸，如小于670个氨基酸，如小于660个氨基酸，如小于650个氨基酸，如小于640个氨基酸，如小于630个氨基酸，如小于620个氨基酸，如小于610个氨基酸，如小于600个氨基酸，如小于590个氨基酸，如小于580个氨基酸，如小于570个氨基酸。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的蛋白片段，所述片段是基本上纯的。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的分离的蛋白片段，其中在SDS-PAGE上在非还原条件下，所述蛋白片段具有小于约10kDa的分子量。
11.根据权利要求ι-?ο中任一项所述的分离的蛋白片段，其中所述蛋白片段是重组蛋白。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的分离的蛋白片段，其中所述蛋白片段是非糖基化的。
13.一种抗体，所述抗体特异性结合根据权利要求1-11中任一项所述的蛋白片段。
14.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子编码根据权利要求1-11中任一项所述的蛋白片段。
15.一种载体，所述载体包含根据权利要求14所述的分离的核酸分子。
16.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求15所述的载体。
17.一种用于制备如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段的方法，所述方法包括在允许多核苷酸构建体表达的条件下在适当的生长培养基中培养如在权利要求16中所定义的细胞，以及从所述培养基中回收得到的蛋白片段。
18.一种缀合物或融合蛋白，所述缀合物或融合蛋白包含:VAR2CSA多肽；和治疗或诊断效应部分，如细胞毒性部分、萤光标记、和/或放射性标记。
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述VAR2CSA多肽是或包含如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的缀合物，其中所述细胞毒性部分选自刺孢霉素、耳他汀、多柔比星、美坦生类化合物、紫杉醇、海鞘素、格尔德霉素、甲氨蝶呤及其衍生物、细胞毒性蛋白如假单胞菌(Pseudomonas)外毒素A、白喉毒素、蓖麻毒蛋白毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、肥皂草毒蛋白、白树毒蛋白以及它们的功能变体、片段、和组合。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的缀合物，其中所述细胞毒性部分是并非衍生自天然存在的化合物的合成化学毒素。
22.根据权利要求18-21中任一项所述的缀合物，其中所述标记选自由以下组成的组:萤光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素和颗粒。
23.根据权利要求18-20中任一项所述的缀合物，其中所述治疗或诊断效应部分是抗炎药。
24.根据权利要求18-20中任一项所述的缀合物，其中所述治疗或诊断效应部分是CSPG4、CD44、或表I中例举的但不限于其的其他蛋白聚糖。
25.一种组合物，所述组合物包含如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、根据权利要求13所述的抗体、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物。
26.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、根据权利要求13所述的抗体、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物，其用作药物或诊断剂。
27.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、根据权利要求13所述的抗体、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物，其用于诊断。
28.—种药物组合物，所述药物组合物包含如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物。
29.一种用于在生物样品中检测如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物的方法，所述方法包括: a)获得生物样品； b)使所述生物样品与根据权利要求13所述的抗体接触；以及 c)检测所述抗体与所述蛋白片段或缀合物的复合物，如果存在的话； 作为所述样品中存在所述蛋白片段或缀合物的指示。
30.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物用于制备药物的用途。
31.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物，其用于治疗如在癌症、关节炎、关节病、多发性硬化和神经损伤后的愈合、软骨修复、伤口愈合中，以及在银屑病中与涉及CSA的表达、如不适当的表达的病症相关的任何适应证。
32.根据权利要求31所述的蛋白片段，其中所述癌症选自所有表达CSA的恶性疾病，包括癌(包括但不限于乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌、睾丸癌、基底细胞皮肤癌、透明细胞肾细胞癌、头颈鳞状细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、外阴角化鳞状细胞癌和外阴基底细胞癌)，肉瘤(包括但不限于纤维肉瘤、去分化软骨和脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、粘液性脂肪肉瘤、子宫体平滑肌肉瘤、骨肉瘤、尤因肉瘤和横纹肌肉瘤、滑膜肉瘤、孤立性纤维瘤)，造血系统癌(包括但不限于慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、B细胞、T细胞和大颗粒状淋巴瘤)，神经上皮组织的肿瘤，诸如但不限于星形细胞瘤(多形性黄色星形细胞瘤、纤维型星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤)、少突神经胶质瘤、室管膜瘤、脉络丛肿瘤、少星形细胞瘤、神经胶质肉瘤、神经节神经胶质瘤、视网膜母细胞瘤、神经细胞瘤、神经母细胞瘤(嗅神经母细胞瘤和神经节母细胞瘤)、髓母细胞瘤、非典型畸胎样横纹肌样肿瘤和所有类型的神经内分泌癌，和任何其他的表达CSA的癌症。
33.一种用于治疗如在癌症、关节炎、关节病、多发性硬化、由神经损伤导致的病理病症、软骨和疤痕组织的病症中，如在风湿病、软骨修复或伤口愈合中，或者在银屑病中，与CSA的表达、如不适当表达相关的任何适应证的方法；所述方法包括向需要其的受试者施用治疗上或预防上有效量的如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物。
34.一种用于预防如在癌症、多发性硬化、关节炎、关节病、由神经损伤导致的病理病症、软骨和疤痕组织的病症中，如在风湿病、软骨修复或伤口愈合中，或者在银屑病中，与CSA的表达、如不适当表达相关的适应证或病症的发生的方法；所述方法包括向需要其的受试者施用治疗上或预防上有效量的如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物。
35.一种核酸探针，所述核酸探针能够在严格条件下与根据权利要求14-15中任一项所述的核酸分子杂交。
36.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物在体液如血液、血浆、尿液、唾液、粪便、脑脊液、淋巴液、胃液、胸膜液、软骨液、精子、和/或组织中作为生物标记物用于适应证或病症的诊断和/或预后的用途，所述适应证或病症与CSA的表达、如不适当表达相关，如恶性疾病、关节炎、关节病、由神经损伤导致的病理病症、软骨和疤痕组织的病症，如在风湿病或伤口愈合中，或者癌症疾病，如脑肿瘤、肝肿瘤和生殖道中的肿瘤。
37.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求24所述的缀合物如在疫苗中用于免疫受试者的用途。
38.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求24所述的缀合物作为靶向部分用于分离细胞的用途，所述细胞表达CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖。
39.一种用于分离和/或检测生物样品中的细胞如癌症干细胞或循环癌细胞(CTC)的方法，所述细胞表达CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖，所述方法包括: a)获得包含表达⑶44和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的细胞的生物样品； b)使所述生物样品与任选地与固体支持物偶联的如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物接触；以及 c)纯化、分离和/或检测表达⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的所述细胞与所述蛋白片段或缀合物的复合物。
40.一种诊断方法，所述诊断方法用于检测对恶性疾病做出反应的体液如血液、血浆、尿液、脊髓液、胸腔积液、关节液、骨髓、精液、精子、前列腺液、粪便、胃液、唾液、眼液、肺吸出物、和淋巴液中升高的CSA水平，所述方法包括下列步骤:使所述体液与如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物接触，以及检测与所述体液中CSA形成的复合物。
41.一种用于纯化生物样品中⑶44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的方法，所述方法包括: a)获得包含CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖的生物样品； b)使所述生物样品与任选地与固体支持物偶联的如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物接触；以及 c)纯化或分离所述CD44、和/或CSPG4、和/或任何其他蛋白聚糖如表I中列出的蛋白聚糖与所述蛋白片段或缀合物的复合物。
42.如在权利要求1-11中任一项所定义的蛋白片段、VAR2CSA多肽、或根据权利要求18-24中任一项所述的缀合物、或根据权利要求28所述的药物组合物，其与任何其他适合的抗癌药组合。
【文档编号】C07K14/445GK104136041SQ201380008730
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月8日 优先权日:2012年2月9日
【发明者】阿里·萨兰蒂, 索尔·格伦特维·特安德, 马斯·道高, 莫滕·尼尔森, 马德琳·达尔贝克, 托马斯·曼德尔·克劳森 申请人:Var2制药有限公司