简易快速检测糖胺多糖的试剂盒及其检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种检测糖胺多糖的试剂盒，尤其涉及一 种简易快速检测组织细胞和体液中的糖胺多糖的试剂盒。此外，本发明还涉及该试剂盒的 检测方法。
【背景技术】
[0002] 糖胺多糖（glycosaminoglycan，GAGs)主要分硫酸化和非硫酸化两种类型。前 一类有硫酸软骨素 （chondroitin sulfate)、硫酸角质素 （keratan sulfate)和硫酸肝素 (heparan sulfate)等，分子较小；后一类为透明质酸（hyaluronic acid)，为曲折盘绕的长 链大分子，可长达2. 5 μ m。小分子的糖胺多糖犹如试管刷上的鬃毛，与核心蛋白结合，并以 核心蛋白为中心向外呈辐射状排列，形成蛋白多糖亚单位。后者再通过结合蛋白结合于透 明质酸主干，形成蛋白多糖聚合体。
[0003] 大量蛋白多糖聚合体形成有许多微孔的分子筛，允许水和营养物、代谢产物、激 素、气体分子等通过；而大于孔隙的大分子物质、细菌等则被阻挡，使基质成为限制细菌等 有害物扩散的防御屏障。溶血性链球菌和癌细胞等因能产生透明质酸酶，破坏基质结构，故 得已扩散。
[0004] 在医疗和科研等领域涉及对心脏、皮肤、肺及各种富含细胞外基质成分的组织和 各种实体肿瘤的外基质成份如糖胺聚糖（或称为糖胺多糖）和硫酸多糖等成份的检测，在 某些疾病特定情况下，当细胞分泌量过高时，在滑膜液、血液或尿液中也可检测到这些基质 成份的表达。目前国内无相关检测糖胺多糖的试剂盒，亟需研发一种检测糖胺多糖的试剂 盒。
[0005] 目前的市场上测定糖胺多糖大多采用Elisa方法，此方法大大增加实验成本，同 时增加了试验时间，同时Elisa试剂盒有种属选择性，检测步骤较为繁琐。
【发明内容】
[0006] 本发明要解决的技术问题之一是提供一种简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，本试 剂盒大大降低了实验成本、缩短检测时间，同时对组织细胞等样品的种属无选择性，操作简 单。可在各种人体或动物组织（皮肤、肌肉等）、软骨、结缔组织、肿瘤组织以及体液、细胞培 养上清等样品，检测糖胺多糖水平。
[0007] 本发明要解决的技术问题之二是提供上述试剂盒的检测方法。
[0008] 本发明的原理是试剂盒通过DMB染料（或称DMB试剂）直接和糖胺多糖（以下简 称GAG)结合，染料解离后，通过检测待测样本和标准品的解离染料的特定波长处的吸光度 值，直接定量检测糖胺多糖的含量。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提供一种简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，包括以 下组分：
[0010] DMB 试剂；
[0011] 硫酸软骨素标准品；
[0012] 裂解液；
[0013] 解离液。
[0014] 所述DMB试剂是指含有1，9-二甲基亚甲蓝的试剂；
[0015] 硫酸软骨素标准品（市售商品）；
[0016] 裂解液是指裂解需测定糖胺多糖的细胞和组织的一种缓冲液；
[0017] 解离液是指解离DMB染料和糖胺多糖结合体的缓冲液
[0018] 甲酸缓冲液是指用以配制DMB染料的缓冲液
[0019] 作为本发明优选的技术方案，所述DMB试剂按以下方法配制：将DMB粉末（市售商 品）80mg加入12ml乙醇，完全溶解后，加488ml甲酸缓冲液，避光室温保存。
[0020] 作为本发明优选的技术方案，所述甲酸缓冲液按以下方法配制：4g甲酸钠、4ml甲 酸，去离子水补足至1L，封闭储存。
[0021] 作为本发明优选的技术方案，所述硫酸软骨素标准品按以下方法配制：称取Ig硫 酸软骨素，溶于100mLPBS中，同时加入0. 005%的叠氮钠，得到10mg/ml储存液；制作标准 曲线时，将软骨素标准品稀释成lmg/ml。
[0022] 作为本发明优选的技术方案，所述裂解液按以下方法配制：PBS配置后调PH值至 6. 4后，加入400mg乙酸钠，200mgEDTA二钠盐和40mg半胱氨酸盐酸盐，4°C保存；使用裂解 液时加入木瓜蛋白酶，现用现配。
[0023] 木瓜蛋白酶（Papain)，又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。木瓜蛋白酶是番木瓜 (Carieapapaya)中含有的一种低特异性蛋白水解酶，广泛地存在于番木瓜的根、莖、叶和果 实内，其中在未成熟的乳汁中含量最丰富。木瓜蛋白酶的活性中心含半胱氨酸，属于巯基蛋 白酶，它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮 革及纺织等行业得到广泛应用。
[0024] 作为本发明优选的技术方案，所述解离液按以下方法配制：将0. 2gSDS粉末加入 到100mL去离子水中，室温稳定6个月。
[0025] 此外，本发明还提供了一种上述试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
[0026] 步骤1，对组织样品进行定量：细胞计数或组织称量，每组取相同量，细胞或组织 加入裂解液进行裂解；裂解后进行高速离心，充分沉淀细胞碎片等杂质，上清中含有待测的 糖胺多糖；
[0027] 步骤2,吸取上清100 μ 1，加入1mlDMB试剂，室温下摇动，使糖胺多糖和DMB充分 结合；高速离心，沉淀糖胺多糖和DMB的结合体，加入解离液，使DMB从糖胺多糖上解离出 来；
[0028] 步骤3,标准曲线制作：分别取5ug、4ug、3ug、2ug和Iug的硫酸软骨素标准品，稀 释于100 μ 1裂解液中，加入1mlDMB试剂，室温下摇动；离心留沉淀，加解离液后，解离液完 全解离DMB和糖胺多糖的结合体后，空白对照设置为解离液，于656nm波长处测定吸光度 值；
[0029] 步骤4,绘制标准曲线，计算实验组的糖胺多糖数值，统计分析。
[0030] 对于细胞培养上清和体液（关节液）等，操作步骤同组织细胞检测的步骤2-4。
[0031] 作为本发明优选的技术方案，步骤1中，所述裂解为在冰上进行超声裂解。
[0032] 作为本发明优选的技术方案，步骤1中，所述高速离心具体为高速12000g离心 l〇-15min ;步骤2中，所述高速离心具体为高速12000g离心30min。
[0033] 作为本发明优选的技术方案，步骤2中，所述加入解离液，室温放置lOmin，使DMB 从糖胺多糖上解离出来。
[0034] 和现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明试验盒从实验成本，实验时 间，操作过程和使用限制方面均优于目前市场上的各种Elisa试剂盒。Elisa试剂盒在样品 处理结束后，还需要经过复杂的操作过程才能得出结果，同时标准曲线范围比较窄，有时对 样品需进行稀释；而本发明试剂盒处理好样品后，直接可以检测样品中的GAG的含量，标准 曲线范围可以根据需要随时设置。Elisa试剂盒需要抗体，一般单克隆抗体符合特异性的要 求，价格也相对比较昂贵；而本发明试剂盒所含试剂配制简单，且成本更低。本试剂盒的试 剂配方和目前市场上存在的试剂盒有很大的差异，采用独特的试剂配方同时对测量GAG的 操作步骤进行改进，使操作步骤简单化。
【附图说明】
[0035] 图1是本发明实施例2中标准曲线图。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0037] 实施例1制备试剂盒
[0038] 所需试剂：
[0039] 甲酸缓冲液