：4g甲酸钠，4ml甲酸，去离子水补足至1L，封闭储存，室温可储存1 年。10父〇]\?试剂（1，9-〇;[11161:117111161:11716116 131116，1，9-二甲基亚甲蓝）：称量8011^0]\?粉 末（市售商品，购自sigma aldrich)加入12ml乙醇，完全溶解后，加488ml甲酸缓冲液，避 光室温保存，至少1年。
[0040] 硫酸软骨素标准品chondroitin sulfate (CS):称取Ig硫酸软骨素，溶于 100mLPBS中，同时加入0. 005%的叠氮钠，得到10mg/ml储存液。制作标准曲线时，稀释成 lmg/ml〇
[0041] 裂解液：PBS配置后调PH值至6. 4后，加入400mg乙酸钠（S2889, Sigma Aldrich)， 200mgEDTA 二钠盐（E5134，Sigma Aldrich)和 40mg 半胱氨酸盐酸盐（C1276, Sigma Aldrich)，4度保存，可保存6个月。使用时加入木瓜蛋白酶（P3125, Sigma Aldrich),现 用现配。
[0042] 解离液：即0. 2gSDS (十二烷基硫酸钠）粉末加入到100mL去离子水中，室温稳定 6个月。
[0043] 实施例2检测方法
[0044] -、检测步骤
[0045] 1.首先对组织样品进行定量：细胞计数（以100, 〇〇〇个细胞为例）或组织称量 (IOmg)，每组取相同量，细胞加入100 μ 1 (组织加入500 μ 1)裂解液进行裂解，尽量在冰上 进行超声裂解。超声后进行高速12000g离心10_15min，充分沉淀细胞碎片等杂质，上清中 含有待测的GAG。
[0046] 2.吸取上清100 μ 1，加入1mlDMB染料，室温下摇动，使GAG和DMB充分结合。高 速离心12000g，30min，沉淀GAG和DMB的结合体，加入解离液，室温放置IOmin左右，使DMB 从GAG上解离出来。
[0047] 3.标准曲线制作：分别取5ug、4ug、3ug、2ug和Iug的硫酸软骨素标准品，加入 ImlDMB试剂，室温下摇动。离心留沉淀，加解离液后，解离液完全解离DMB和GAG的结合体 后，空白对照设置为解离液，于656nm波长处测定吸光度值。
[0048] 4.绘制标准曲线，计算实验组的GAG数值，统计分析。
[0049] 二、检测结果
[0050] 1、测定656nm处标准曲线吸光度值，测定结果具体见表1 :
[0051] 表 1
[0052]
[0053] 2、50ng/ml和100ng/ml的il-Ι β作用大鼠软骨细胞，取三份细胞，每份为 8. 8 X 100, 000个细胞，分别用200 μ 1裂解液裂解，取出100 μ 1检测24h和48h的吸光度值 分别如表2所示：
[0054] 表 2
[0055]
[0056] 3、标准曲线如图1所示，图1中，纵轴为吸光度值，横轴为GAG含量，单位为微克 (μ g)，根据标准品浓度和相应的吸光度值，绘出标准曲线。
[0057] 根据标准曲线公式y = 0. 1455x算出每组浓度（ug/ΙΟΟ μ 1)，见表3 :
[0058] 表 3
[0059]
[0060] 每组浓度分别乘以2为8. 8X 100, 000个细胞内的GAG的总量，见表4。
[0061] 表 4
[0062]
[0063] 已知IL-I β是公认引起软骨细胞退变的细胞因子，软骨细胞退变时引起GAG的降 解，本试剂盒测试IL-I β诱导的软骨细胞的GAG的表达，和文献报导的结果相一致，说明此 试剂盒的可靠性。
【主权项】
1. 一种简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括以下组分： DMB试剂； 硫酸软骨素标准品； 裂解液； 解离液。2. 根据权利要求1所述的简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，其特征在于，所述DMB试剂 按以下方法配制：将DMB粉末80mg加入12ml乙醇，完全溶解后，加488ml甲酸缓冲液，避光 室温保存。3. 根据权利要求2所述的简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，其特征在于，所述甲酸缓 冲液按以下方法配制：4g甲酸钠、4ml甲酸，去离子水补足至1L，封闭储存。4. 根据权利要求1所述的简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，其特征在于，所述硫酸软 骨素标准品按以下方法配制：称取Ig硫酸软骨素，溶于100mLPBS中，同时加入0. 005%的 叠氮钠，得到l〇mg/ml储存液；制作标准曲线时，将软骨素标准品稀释成lmg/ml。5. 根据权利要求1所述的简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，其特征在于，所述裂解液 按以下方法配制屮85配置后调？11值至6.4后，加入40011^乙酸钠，20011^￡0了4二钠盐和 4〇mg半胱氨酸盐酸盐，4°C保存；使用裂解液时加入木瓜蛋白酶，现用现配。6. 根据权利要求1所述的简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，其特征在于，所述解离液 按以下方法配制：将〇. 2gSDS粉末加入到100mL去离子水中，室温稳定6个月。7. -种如权利要求1所述试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1，对组织样品进行定量：细胞计数或组织称量，每组取相同量，细胞或组织加入 裂解液进行裂解；裂解后进行高速离心，充分沉淀细胞碎片等杂质，上清中含有待测的糖胺 多糖； 步骤2,吸取上清100y1，加入ImlDMB试剂，室温下摇动，使糖胺多糖和DMB充分结合； 高速离心，沉淀糖胺多糖和DMB的结合体，加入解离液，使DMB从糖胺多糖上解离出来； 步骤3,标准曲线制作：分别取5ug、4ug、3ug、2ug和Iug的硫酸软骨素标准品，加入ImlDMB试剂，室温下摇动；离心留沉淀，加解离液后，解离液完全解离DMB和糖胺多糖的结 合体后，空白对照设置为解离液，于656nm波长处测定吸光度值； 步骤4,绘制标准曲线，计算实验组的糖胺多糖数值，统计分析。8. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤1中，所述裂解为在冰上进行超声 裂解。9. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤1中，所述高速离心具体为高速 12000g离心10_15min;步骤2中，所述高速离心具体为高速12000g离心30min。10. 如权利要求7所述的检测方法，其特征在于，步骤2中，所述加入解离液，室温放置 lOmin，使DMB从糖胺多糖上解离出来。
【专利摘要】本发明公开了一种简易快速检测糖胺多糖的试剂盒，包括以下组分：DMB试剂；硫酸软骨素标准品；裂解液；解离液。此外，本发明还公开了上述试剂盒的检测方法。本发明试剂盒通过DMB染料(试剂)直接和糖胺多糖(GAG)结合，染料解离后，通过检测待测样本和标准品的解离染料的特定波长处的吸光度值，直接定量检测糖胺多糖的含量。本发明试剂盒大大降低了实验成本、缩短检测时间，同时对组织细胞等样品的种属无选择性，操作简单。可在各种人体或动物组织(皮肤、肌肉等)、软骨、结缔组织、肿瘤组织以及体液、细胞培养上清等样品，检测糖胺多糖水平。
【IPC分类】G01N21/31, G01N1/28
【公开号】CN104914057
【申请号】CN201510270479
【发明人】丁道芳, 杜国庆, 宋奕, 欧阳霄雯, 杨晓玲, 李玲慧, 曹月龙, 詹红生
【申请人】上海中医药大学附属曙光医院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年5月25日