用于生物合成肝素酶的培养基的制作方法

专利名称：用于生物合成肝素酶的培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种培养基，具体说，涉及一种以肝素黄杆菌F/avo6a"en'"m /2e; an'm^ ATCC 13125为菌种，生物合成肝素酶的培养基。 背录技术肝素酶能特异性地断裂肝素和类肝素链上具有特定修饰的不同序列， 产生不同的寡糖片段。肝素酶具有许多重要用途，包括体内循环中肝素的 消除，肝素精确结构的确定，肝素抗凝机理和肝素结构与功能的研究，制 备低分子量肝素及抗肿瘤药物等。国外报道采用肝素黄杆菌发酵生产肝素 酶能够达到的1，475U/L的效价，而国内的报道也很低。其中，"肝素黄杆 菌发酵产肝素酶的工艺优化" 一文披露，可由牛肉膏、蛋白胨、酵母粉和 玉米浆等作为培养基的有机氮源合成肝素酶但效果并不明显，其中采用如 下培养配方((g/L):葡萄糖8，氯化铵4，磷酸二氢盐6，组氨酸0.75,甲硫 氨酸0.75，氯化镁0.5;微量盐10"mol/L )可将产酶量比原来提高66% 。 但现有技术中，由于肝素黄杆菌发酵生物合成肝素酶的效价普遍不高，成 为了制约采用发酵法规模化生产肝素酶的主要障碍，是一个迫切需要解决 的问题。发明内容本发明需要解决的技术问题是提高肝素黄杆菌发酵生物合成肝素酶 的效价。为此，本发明提供一种以肝素黄杆菌尸7ara6acteri咖Aeparz'y^/z ATCC 13125为菌种，生物合成肝素酶的培养基，包括碳源、氮源、氨基 酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH4C1、大豆蛋白胨和胰蛋白胨组成。本发明的独特之处在于氮源的配方，即同时采用NH4C1、大豆蛋白胨 和胰蛋白胨。所述NH4C1、大豆蛋白胨和胰蛋白胨的重量百分比为4: 4 5: 2 3， 优选4: 4.6: 2.3。所述NH4Cl在培养基中浓度通常为2 5g/L，优选浓度为3-4 g/L。所述氨基酸为L-His和L-Met，当其浓度为0.25g/L到0.75g/L时，可以获 得较好的生长和产酶效果，优选浓度为0.4g/L到0.6g/L。所述肝素的浓度为lg/L到5g/L，优选2g/L到3g/L。本发明所使用产生肝素酶的菌种为肝素黄杆菌，菌种编号为ATCC 13125,实际用于生产的菌株可以为自主诱变获得的肝素酶髙产菌株。本发明的碳源可包括但不限于葡萄糖、半乳糖等，最优地使用葡萄糖， 在培养液中该碳源浓度为l%~7g/L，优选浓度为3 5g/L。本发明采用混合磷酸盐为磷酸钠盐或者磷酸钾盐，浓度为3 7g/L， 优选为4 6g/L;本发明在培养液中添加微量元素(NaMo03 ， CuCl2 ， FeCl2 , CoCl2，MnCl2，CaCl2)，浓度为10—3 10—5M ，最优为1(T4M。本发明生物合成过程中的空气通气量通常在0.2 1.5wm,优选在0.5 0.8 vvm;温度控制在23 28'C，优选在24'C 26'C;可测得最高酶活力 时间在30 36h，优选在32 34h。本发明在发酵过程中pH值控制在6.0 7.0，优选为6.2 6.8。发酵结束将细胞培养液离心(10,000r/min ， 8min)收集菌体，以一定 体积0.02mol/L、 pH7.0磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波 破碎。然后离心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶。釆用本发明培养基配方培养肝素黄杆菌，菌体生长和产酶都优于文献 所报道的培养基，菌体产量可达到15g/L(湿重)，产酶效价可高达2,000U/L。
具体实施方式
实施例1肝素黄杆菌(F/avo6(3"en'Mw/lepan'""/w ， ATCC 13125) ， 750ml摇 瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖3; NH4C1 4;大豆蛋白胨4.6;胰蛋 白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液种龄48小时，10%接种，装液量90ml/750ml， 25'C培养32小时。将细胞 培养液离心(10，000r/min， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得15g/L (湿 重)的菌体和1，768U/L效价的肝素酶。实施例2肝素黄杆菌(尸/avo6ac&;^ww Zie; arz.w"加，ATCC 13125) ， 750ml摇 瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖3; NH4C1 4;大豆蛋白胨4;胰蛋白胨2; L-Met 0.25; L-His 0.25;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 l(T5M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0,种子液 种龄48小时，10%接种，装液量卯ml〃50ml， 25'C培养32小时。将细胞 培养液离心(10，000r/min ， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得14g/L (湿 重)的菌体和约1，550U/L效价的肝素酶。实施例3肝素黄杆菌(F/avo6a"eWw/w/z印a"'""OT ， ATCC 13125) ， 750ml摇 瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4;胰蛋 白胨3; L-Met 0.25; L-His 0.25;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 l(T5M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液 种龄48小时，10%接种，装液量90ml〃50ml， 25'C培养32小时。将细胞 培养液离心(10，000r/min ， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得15g/L (湿 重)的菌体和约1,550U/L效价的肝素酶。实施例4肝素黄杆菌(F/。vo6a"e"'w/w ZiepaW"w附，ATCC 13125) ， 750ml摇瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖5; NH4C1 4;大豆蛋白胨5;胰蛋白胨2; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 10_4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液 种龄48小时，10%接种，装液量90ml/750ml， 25'C培养32小时。将细胞 培养液离心(10,000r/min， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得13g/L (湿 重)的菌体和1,650U/L效价的肝素酶。实施例5肝素黄杆菌(F/avo6a"e".Mm/z印aW""/n ， ATCC 13125) ， 750ml摇 瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖5; NH4C14;大豆蛋白胨5;胰蛋白胨3; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液 种龄48小时，10%接种，装液量90ml/750ml, 25。C培养32小时。将细胞 培养液离心(10,000r/min，8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得14g/L (湿 重)的菌体和1，620U/L效价的肝素酶。实施例6肝素黄杆菌(F/avo6a"e".MW Zie; flW""w ， ATCC 13125) ， 750ml摇 瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖5; NH4C14;大豆蛋白胨4.5;胰蛋白胨2; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液 种龄48小时，10%接种，装液量90ml/750ml， 25。C培养32小时。将细胞 培养液离心(10，000r/min， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得13g/L (湿 重)的菌体和1，600U/L效价的肝素酶。实施例7肝素黄杆菌(F/avo6a"e"wm/z印ot/""加，ATCC 13125) ， 750ml摇瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖5; NH4C14;大豆蛋白胨4.5;胰蛋白胨3; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液 种龄48小时，10%接种，装液量90ml〃50ml， 25'C培养32小时。将细胞 培养液离心(10，000r/min，8min)收集菌体，以一定体积O.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得14.5g/L(湿 重)的菌体和1，610U/L效价的肝素酶。实施例8肝素黄杆菌(F/avo6a"eWw附/z印or/""加，ATCC 13125) ， 750ml摇瓶，培养液组成为(g/L)葡萄糖5; NH4Cl 4;大豆蛋白胨4.5;胰蛋白胨2.5; L-Met 0.75; L-His 0.75;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)， pH7.0，种子液 种龄48小时，10%接种，装液量90ml/750ml， 25。C培养32小时。将细胞 培养液离心(10，000r/min， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心 (14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得15g/L (湿 重)的菌体和1，720U/L效价的肝素酶。实施例9使用半乳糖替换实施例1中的葡萄糖进行试验，余同实施例1，可以 获得13g/L (湿重)的菌体和2，000U/L效价的肝素酶。实施例10使用半乳糖替换实施例2中的葡萄糖进行试验，余同实施例1，可以 获得10g/L (湿重)的菌体和1，500U/L效价的肝素酶。实施例11使用半乳糖替换实施例3中的葡萄糖进行试验，余同实施例1，可以 获得14g/L (湿重)的菌体和1,840U/L效价的肝素酶。实施例12肝素黄杆菌(i^vo6ac^7Mm/z印"W肌m ， ATCC 13125) ， 5L发酵罐，培养液组成为(g/L)葡萄糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，种子液种龄48 小时，10%接种，空气通气量0.5 vvm;温度控制在25'C;发酵过程pH 值控制在6.5到7.0，泡敌流加，发酵时间32h。发酵结束将细胞培养液离 心(10，000r/min ， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0磷酸缓 冲液洗漆后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得13 15g/L (湿重) 的菌体和约1700U/L效价的肝素酶。实施例13肝素黄杆菌(F/avo6fl"en"w/iep^7" w ， ATCC 13125) , 5L发酵罐， 培养液组成为(g/L)半乳糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，种子液种龄48 小时，10%接种，空气通气量0.5 vvm;温度控制在25'C;发酵过程pH 值控制在6.5到7.0，泡敌流加，发酵时间32h。发酵结束将细胞培养液离 心(10，000r/min, 8min)收集菌体，以一定体积0,02mol/L、 pH7.0磷酸缓 冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得ll 13g/L (湿重) 的菌体和约1，600U/L效价的肝素酶。实施例14肝素黄杆菌(F/avo6a"eWww/i印an'w"m ， ATCC 13125) ， 15L发酵 罐，培养液组成为(g/L)葡萄糖3; NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋 白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元素 10-4M(NaMoO3、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，种子液种龄48 小时，10%接种，空气通气量0.5 vvm;温度控制在25'C;发酵过程pH 值控制在6.5到7.0，泡敌流加，发酵时间32h。发酵结束将细胞培养液离 心(10,000r/min， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0磷酸缓 冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(14,000 r/min, 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得12 15g/L (湿重) 的菌体和1,600 1，700U/L效价的肝素酶。实施例15肝素黄杆菌(F/avo6a"eWwm A印an"";w ， ATCC 13125) ， 15L发酵 罐，培养液组成为(g/L)半乳糖3;NH4C14;大豆蛋白胨4.6;胰蛋白胨2.3; L-Met 0.5; L-His 0.5;混合磷酸盐5;肝素钠2;微量元 素l(T4M(NaMo03、 CuCl2、 FeCl2、 CoCl2、 MnCl2、 CaCl2)，种子液 种龄48小时，10%接种，空气通气量0.5vvm;温度控制在25'C;发酵过 程pH值控制在6.5到7.0，泡敌流加，发酵时间32h。发酵结束将细胞培 养液离心(10，000r/min， 8min)收集菌体，以一定体积0.02mol/L、 pH7.0 磷酸缓冲液洗涤后悬浮细胞，在冰浴中进行超声波破碎。破碎液离心(14,000 r/min， 30min)收集上清即得无细胞粗酶液。可以获得10 14g/L(湿重)的菌体和1，700 1,900U/L效价的肝素酶。
权利要求
1. 一种以肝素黄杆菌Flavobacterium heparinum ATCC 13125为菌种，生物合成肝素酶的培养基，包括碳源、氮源、氨基酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH4Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨组成。
2. 如权利要求l所述的培养基，其特征在于，所述NH4C1、大豆蛋白 胨和胰蛋白胨的重量百分比为4: 4 5: 2 3。
3. 如权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述NH4C1、大豆蛋白 胨和胰蛋白胨的重量百分比为4: 4.6: 2.3。
4. 如权利要求1到3任一所述的培养基，其特征在于，所述NH4C1在培 养基中的浓度为2 5g/L。
5. 如权利要求4所述的培养基，其特征在于，所述NH4Cl在培养基中 的浓度为3 4g/L。
6. 如权利要求l所述的培养基，其特征在于，所述氨基酸为L-His和 L-Met。
7. 如权利要求6所述的培养基，其特征在于，所述L-His和L-Met的浓 度均为0.25g/L到0.75g/L。
8. 如权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述L-His和L-Met的浓 度均为0.4g/L到0.6g/L。
9. 如权利要求l所述的培养基，其特征在于，所述肝素的浓度为lg/L 到5g/L。
10. 如权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述肝素的浓度为2g/L 到3g/L。
11. 如权利要求l所述的培养基，其特征在于，所述碳源为葡萄糖或 半乳糖，浓度为l 7g/L。
12. 如权利要求ll所述的培养基，其特征在于，所述碳源为葡萄糖， 浓度为3 5g/L。
全文摘要
本发明公开了一种以肝素黄杆菌Flavobacterium heparinum ATCC 13125为菌种，生物合成肝素酶的培养基，包括碳源、氮源、氨基酸和肝素，其特征在于，所述氮源由NH₄Cl、大豆蛋白胨和胰蛋白胨组成。本发明培养基中，肝素黄杆菌的菌体产量可达到15g/L(湿重)。采用本发明培养基合成肝素酶，产酶效价可达2,000U/L，且成本低，控制简单容易，易于实现规模化生产。
文档编号C12N9/24GK101235356SQ200710036928
公开日2008年8月6日 申请日期2007年1月29日 优先权日2007年1月29日
发明者军 冯, 朱裕辉, 纲 林, 田永辉, 程睛华, 薛春佳, 赵文杰, 雪 陈, 魏晓东, 齐艳艳 申请人:上海医药工业研究院