抗血管发生组合物及其治疗应用的制作方法

专利名称：抗血管发生组合物及其治疗应用的制作方法
抗血管发生组合物及其治疗应用本发明涉及人疱疹病毒6型(HHV_6)U94基因及其产物蛋白质Rep在人类治疗中 的用途。根据本发明，将蛋白质R印或编码R印的人疱疹病毒6型(HHV-6)U94基因递送至 人血液(BEC)和淋巴(LEC)内皮细胞，藉此抑制血管发生和淋巴管发生(lymphangiogenic) 的过程。本发明还提供适合用于递送U94基因或从其编码的蛋白质至治疗部位的表达载体 和药物组合物。
背景技术：
血管发生描述了从预先存在的微脉管系统(microvasculature)形成新的血管。 在生理条件下，血管发生是高度调节的现象，由许多促血管发生(proangiogenic)和抗血 管发生(antiangiogenic)因子的受紧密控制和平衡的合成介导(Hanahan和FoIkman， 1996, Cell 86:353-364)。在生理条件中，血管发生发生在胚胎发生过程中和出生后早期， 以及在成年人中在创伤愈合和女性生殖周期期间。在生理条件下，细胞处于距离血管(它 们的氧气源)100-200 μ m内。多细胞生物体生长时，为了补充新的血液供应，细胞诱导血 管发生和脉管发生(vasculogenesis)。不受调节的血管发生见于病理病症中，如慢性炎 性疾病银屑病、婴儿期血管瘤、消化性溃疡、眼新血管形成、动脉粥样硬化和癌(Mauriz和 Gonzalez-Gallego, 2008, J Pharm ki，先于印刷版的电子出版)。癌作为快速增殖和扩大的异常细胞的小群而起始。此过程是血管发生依赖性的， 因为处于血管100 μ m之外的肿瘤细胞变得缺氧。在没有足够血液供应的情况下，肿瘤不 能生长超过l_2mm大小。在肿瘤细胞获得产生其自身或改变其环境以从头产生血管发生 刺激物的能力前，其细胞可以保持休眠或甚至由于其他宿主因子而消失。肿瘤从休眠至活 性状态的进程依赖于包含转换为血管发生表型的一系列事件(John等，2007，Br J Surg 95 =281-293)。这可以通过包含低氧、代谢性应激、机械性应激和免疫/炎症反应的多种信 号触发。此转换还可以通过抗血管发生因子的丧失引发。为了产生毛细管芽(capillary sprout)，内皮细胞增殖、迁移、降解基膜并形成新管腔组织(new lumen organisation)的 结构。为了刺激血管发生，肿瘤细胞和宿主细胞都分泌多种因子。迄今，已报道了超过12 种促血管发生分子，其中最有效力的是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮生长 因子(VEGF)。抗血管发生治疗抑制血管出芽并发挥作用以阻断血管发生转换通过针对干扰肿瘤血管发生的治疗来阻止肿瘤生长和转移的想法最先由R)lkman 发表(Folkman 1971,N Engl J Med 285 :1182-1186)。抗血管发生治疗的理论优势是基于 以下观察，避开药物抗性亚群的选择，内皮细胞是同质的、二倍体的、遗传上稳定的靶标。这 与肿瘤细胞的高遗传不稳定性、异质性和突变率相反。此外，由于单个血管网可以支持不同 肿瘤细胞群体生长的事实，血管生长的抑制可以影响许多肿瘤细胞的存活。目前，已描述 了不同的抗血管发生抑制剂干扰血管发生因子或其他受体、内皮细胞增殖的抑制、金属蛋 白酶(MMP)的抑制、内皮细胞黏附的抑制和概述于Mauriz和Gonzalez-Gallego (J Pharm Sci, 2008)中的其他抑制剂。通过靶向VEGF信号发放抑制肿瘤血管发生是理性和具有潜在价值的治疗策略，且它是目前抑制肿瘤生长和转移形成的最有前景的新策略之一。FDA 已于2004年和2006年批准了首批药物。如在Drevs和khneider(J Int Med 2006,260 517-529)中所概述，贝伐单抗(Bevacizumab, Avastin, Genentech)是抗-VEGF-As 的人 源化重组单克隆抗体，其与某些化疗方案组合已在结肠直肠癌、肺癌和乳腺癌中显示临床 上相关的存活率改善。已用小分子如Sorafenib (Nexavar，Bayer)和Sunitinib (Sutent， Pfizer)显示了抗肿瘤活性(当加至结肠直肠癌、肾细胞癌、黑素瘤和胃肠基质瘤(GIST)的 标准治疗时)，二者均具有针对VEGF受体酪氨酸激酶的活性。抗血管发生治疗的问题目前的抗血管发生治疗使用能够特异性阻断单个促血管发生分子活性的抑制剂。 随着肿瘤的发展，促血管发生因子的数目趋于增加(Fidler，2001，J Natl Cancer Inst 93:1040-1041)。这可限制具有窄作用谱的单个药剂的用途，并可导致抗药性或耐药性。实 际上，已描述了在几乎所有患者中，肿瘤最终对抗血管发生治疗产生抗药性，但尚未阐明潜 在的抗药性机制。肿瘤可激活替代途径来刺激血管发生过程；例如，在小鼠中，VEGF抑制 可以诱导bFGF途径的增加。因此，已开展组合策略来获得最大效应。已用实验模型，其显 示若组合使用长春花碱和抗血管发生剂DClOl (靶向VEGFR2的单克隆抗体)，则接种入免 疫缺陷小鼠的人成神经细胞瘤细胞系不形成肿瘤(Klement等，2000，J Clin Invest 105 R15-R24)。类似地，Kamat 和同事(Cancer Res 2007,67 :281-288)已显示紫杉烧(taxane) 与AEE788( 二元的表皮生长因子受体(EGFR)和VEGFR抑制剂)组合在卵巢癌鼠模型中的 功效。普遍的观点是，必须在血管发生过程的不同阶段同时阻断血管发生。因此，存在对基于通过干扰导致细胞获得抗血管发生表型和功能的胞内信号，通 过作用于内皮细胞水平来阻断血管发生的更有效的癌治疗的迫切需要。能够抑制血管发生的新药物的可用性可能为需要调节血管发生过程的所有疾病 开启了有益的应用。这对通过作用于内皮细胞内部，以明显的新机制显示有效的抗血管发生特性的药 物尤其正确。如Rui-Chen 在 Cancer Metastasis Rev (2006, 25 :677-694)中所概述，在过 去几年中已清楚，最终受生长因子、细胞因子和趋化因子的复杂网络调节的淋巴管发生 (lymphangiogenesis，新淋巴管的形成)有助于肿瘤转移。几篇研究已发现淋巴管发生因 子、淋巴管(lymphatic)侵入、远端转移和(在一些情况下)差的临床结果之间的正相关。 肿瘤衍生的淋巴管发生因子如VEGF-C的相关作用对肿瘤淋巴管发生很关键。实际上，最近 的研究已表明，响应快速的肿瘤生长，淋巴管经历引人注目的淋巴管发生改变，例如淋巴管 内皮细胞(LEC)出芽、肿瘤内和肿瘤周围(peritumoural)脉管形成和邻近肿瘤组织的集合 淋巴管膨大。人乳腺癌VEGF-C的过量表达与肿瘤内淋巴管发生、肿瘤内淋巴管的增加的数 目和局部淋巴结转移的高频率密切相关。这些实验已提供了淋巴管可以在肿瘤内增殖并作 为淋巴发生传播的管道这一原理的证据。因此，已提出将肿瘤内和外周LEC的靶向或阻断 淋巴管发生作为抗转移法的重要途径。目前不存在能够干扰淋巴管发生和预防癌转移的有效药物。代表用于转移癌的潜在治疗的抗淋巴管发生治疗是肿瘤学领域中未满足的需要。能够抑制淋巴管发生的新药物的可用性可能为需要调节淋巴管发生过程的所有疾病开启了有益的应用。最佳的药物应通过干扰导致细胞获得淋巴发生表型和功能的胞内信号来在LEC 水平发挥其抗淋巴管发生活性。HHV-6U94 基因HHV-6U94 基因首次由 Thomson 等(Thomson 等，nature 351 :78-80,1991)描述。序 列(从完整的HHV-6 DNA序列(Gompels等，Virology 209 =29-51,1995)获得)以基因识别 号1487994储存在RefSeq数据库中(国家生物技术信息中心，http //www. ncbi. nlm. nih. gov/)。U94是涉及HHV-6复制调节的潜在相关基因(Caseli等，Virology 346 =402-414, 2007)。现有技术Cancer Cell International Q005，5 19)描述了 U94 基因在命名为 PC3 的 人前列腺肿瘤细胞系中的稳定表达抑制其在培养物中的集落形成和在裸鼠中的肿 瘤发生。所观察到的抗肿瘤效应由PC3细胞中纤连蛋白(FNl)的上调和血管生成 素-样-4(Angiopoietin-like-4，ANGPTL4)表达的降低引起。之前的研究表明，在稳定表达U94的NIH3T3细胞系中，U94抑制癌基因H-ras的 转化(Arauji JC 等，J Virol 1995,69 :4933-4940 ；Araujio JC 等，Oncogene 1997,14 937-943)。这些文章中没有一篇提出U94基因和所编码的R印蛋白质以正常的人原代血管和 淋巴管内皮细胞为治疗靶点来发挥其抗(淋巴管)血管发生的效应。本发明的公开内容本发明基于这样的发现，当递送至人原代BEC或LEC时，HHV-6U94基因(U94)或 U94蛋白质产物Rep损伤细胞在体外形成毛细管样结构的生理学能力。在第一个实施方案中，本发明提供Rep蛋白质、其类似物或编码它们的核酸分子 在抑制内皮细胞功能，从而在有需要的哺乳动物受试者中，优选在有需要的人类受试者中 预防或治疗血管发生和/或淋巴管发生相关状态(state)、病症或疾病中的用途。由血管发生和/或淋巴管发生介导并可以从本发明的治疗受益的状态、病症 或疾病包含但不限于血管瘤、实体瘤、卡波希肉瘤、白血病、转移、毛细血管扩张症、银 屑病、硬皮病(scleroderma)、脓性肉芽肿、心肌血管发生、斑块新血管形成(plaque neovascularisation) > S ^ II/JC {RiJ (coronary collaterals)、|Sf { J (cerebral collaterals)、云力■ J0C _ (arteriovenous malformations) > ifilifil iW ^ ^ (ischemic limb angiogenesis)、角膜疾病、潮红、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、 晶状体后纤维组织形成、关节炎、类风湿性关节炎、糖尿病性新血管形成、黄斑变性、班氏吴 策线虫感染、巴尔通体感染(Bartonella infection)、创伤愈合、消化性溃疡、骨折、瘢痕疙 瘩、血管发生、血细胞发生、排卵、月经。该治疗在于以足以控制病症或疾病的临床方面的量 对个体施用Rep蛋白质、其类似物或编码它们的核酸分子。在本发明的另一实施方案中，提供Rep蛋白质、其类似物或编码它们的核酸分子 在控制生育中的用途，通过对女性施用有效量的Rep蛋白质、其类似物或编码它们的核酸 分子，使得子宫内膜血管形成被抑制和胚胎植入不能发生或持续。还在另一个实施方案中，本发明提供用于治疗上文所述疾病或病症的药物制剂。该药物制剂包含与可药用载体组合的Rep蛋白质、其类似物或编码它们的核酸分子。Rep蛋 白质、其类似物或编码它们的核酸分子在该剂型中的量必须足以基本减轻疾病的表现或缓 解状态或病症的症状。可以通过与疾病相关的临床症状和通过非侵入性和/或侵入性仪器 和实验室方法测定疾病的表现。还在另一个实施方案中，本发明提供R印蛋白质、其类似物或编码它们的核酸分 子对通过促进或阻断血管或淋巴管内皮细胞或其他细胞类型在胞外环境中释放生物活性 分子来抑制内皮细胞功能的用途。附图描述图 1 显示通过 AMAXA 核转染(nucleofection)pSR2ph_U94 后 U94 转录物在 BEC 中的存在。已将pSR2ph-U94质粒DNA用作阳性对照(C+)，而已进行了持家基因β -肌动 蛋白cDNA的扩增，以验证获自转染细胞的所有样品都已被正确处理。所获得的结果显示， pSR2ph-U94转染后，U94基因在BEC中转录至多5天。图2显示，与pSR2ph转染或未转染(NT)的细胞相比，pSR2ph_U94转染的BEC和 LEC在接种于Cultrex BME上后M小时未形成毛细管样结构。图3显示，与未处理的细胞或用热灭活的R印(5μ g/ml)处理的细胞相比，用重组 R印蛋白质(5yg/ml)处理M小时的BEC在接种于Cultrex BME上后M小时未形成毛
细管样结构。图4显示，与pSR2ph转染的BEC相比，pSR2ph_U94转染的BEC具有受损的迁移 能力。实际上，如靠下的图中所示，与pSR2ph转染的BEC超过60%的封闭(seal)相比， pSR2ph-U94转染的BEC在用200 μ 1吸头产生创伤划痕后8小时仅达到20%封闭。图5R印对血管发生的影响。与未处理的环(平板Α)相比，按5 μ g/ml的浓度用 重组R印处理主动脉环7天导致自发血管发生(平板B)的完全降低。用20mg/ml的VEGF 刺激主动脉环7天强烈增加微血管派生(平板C)，而在VEGF刺激开始时将R印(μ g/ml)加 至环显著减少了微血管的数目(平板D)。发明详述本发明提供用于在有需要的哺乳动物受试者中，尤其是在有需要的人类受试者中 抑制血管发生和/或淋巴管发生的治疗组合物，所述组合物以能够抑制内皮细胞功能的量 包含a)编码具有抗血管发生和抗淋巴管发生活性的蛋白质的HHV-6核酸分子，其中所 述核酸分子具有选自以下的序列i) SEQ ID NO 1 (U94 基因)；ii)由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO 1的序列；iii)在严格条件下，尤其是在50°C或更高温度和0. IxSSC (15mM氯化钠/1. 5mM柠 檬酸钠)下与SEQ ID NO 1杂交的序列；和/或b)包含上文所定义的核酸分子的表达载体；和/或c)由上文所定义的核酸分子编码的R印蛋白质，优选SEQ ID NO :2的蛋白质或其 携带保守取代的类似物。所提供的HHV U94基因和R印蛋白质令人惊奇地能够抑制人血管内皮细胞和淋巴 管内皮细胞的体外毛细管样结构形成和创伤愈合修复。
可以将抗血管发生/抗淋巴管发生的U94和/或R印、其类似物、同源物或衍生物 与治疗有效量的负调血管发生/淋巴管发生的其他分子，如血小板因子4、血小板反应蛋 白-1、金属蛋白酶组织抑制剂、促乳素、制管张素、内皮抑制素、bFGF可溶性受体、VEGF可溶 性受体、VEGF抗体、bFGF抗体、转化生长因子β、干扰素α和胎盘增殖蛋白相关蛋白质组合。本发明的抗血管发生/抗淋巴管发生分子还可以与化疗剂组合。本发明包含抗血管发生/抗淋巴管发生R印的类似物，其可以通过提供功能上等 同的分子的取代、添加或缺失来改变蛋白质序列而获得。这包括改变序列，其中用功能上等 同的氨基酸残基取代序列内的残基，产生沉默改变(保守取代)。例如，可以用起功能等同 物作用的具有相似极性的另一个氨基酸取代序列内的一个或多个氨基酸残基，产生沉默改 变。序列内氨基酸的取代物可以选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，非极性(疏水) 氨基酸包含丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性 中性氨基酸包含甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电 荷(碱性)氨基酸包含精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷(酸性)氨基酸包含天冬氨酸 和谷氨酸。抗血管发生/抗淋巴管发生R印及其类似物可以衍生自组织或通过本领域已知的 多种方法产生。导致它们的产生的操作可以发生在基因或蛋白质水平。例如，可以通过本 领域已知的众多策略(Sambrook 等，1990，Molecular Cloning,A Laboratory Manual，第 2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.)中的ft—禾中: !^7 )^3 隆的编码抗血管发生/抗淋巴管发生Rep及其类似物的基因序列。可以用一种或多种限制 性内切酶在适当的位点处切割序列，然后在需要时进行其他酶修饰、分离和在体外连接。在 编码衍生物或类似物的基因的产生中，应注意确保所修饰的基因保留在相同的翻译阅读框 之内，不被翻译终止信号间断。优选通过重组法产生抗血管发生/抗淋巴管发生R印及其类似物。术语“分离的”指从其最初的环境移出Rep。例如，存在于活个体中的天然存在的 Rep不是分离的，但从天然系统中的一些或所有共存物质分开的相同的Rep是分离的。Rep 可以是载体的部分和/或组合物的部分，且还可以是分离的，其中这种载体或组合物不是 其天然环境中的部分。希望表达Rep时，可以使用任意适合的系统。对本领域技术人员而言，适合的载 体、表达载体及其构建的一般性质是显而易见的。适合的表达载体可以基于噬菌体或质粒，二者一般都是宿主特异性的，虽然通常 可以改造它们用于其他宿主。其他适合的载体包含粘粒和反转录病毒和任意其他载体，其 可以是给定系统特异性或非特异性的。对本领域技术人员而言，表达调节中必需和/或有 用的控制序列，如识别、启动子、操纵子、诱导物、终止子和其他序列是显而易见的。可以容易地将编码R印或R印样蛋白质的DNA插入适合的载体。理想地，接收载体 具有便于插入的适合的限制位点，但也可以使用例如平端连接，虽然这可以导致阅读框和 插入方向的不确定性。本领域技术人员可以自然地按希望的表达系统来选择适合的载体。可以通过用所获得的质粒转化适合的生物或真核细胞系，用氨苄青霉素、卡那霉 素或需要时通过其他适合的方式选择转化体，并在必要时加入色氨酸或其他适合的启动子诱导物(如吲哚丙烯酸)来表达R印。可以通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳-SDS-PAGE和通 过Western印迹分析来分析表达的程度。用于培养和转化培养物等的适合的方法有用地阐述于例如Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 2 版，Sambrook, Fritsch 禾口 Maniatis, Cold Spring Harbor)； Current Protocols in Molecular Biology(Aufubel, Brent, Kingston, More, Feidman, Smith 禾口 Stuhl 编辑，Greene Publ. Assoc.，ffiley-Interscience, NY, N. Y. 1992)中。可 以从发酵或细胞培养物分离Rep并用多种常规方法中的任一种进行纯化，这些常规方法包 括使用HPLC和FPLC的液相层析，如正相或反相；亲和层析(如用无机配体或抗体)；大小 排阻层析；固定化金属螯合层析；凝胶电泳。本领域技术人员可以选择最适当的分离和纯 化技术而不背离本发明的范围。可以通过几种化学技术中的任一种产生R印。例如，可以用最初由 R.B.Merrifield, "Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis Of A TetrapeptideJ. Am. Chem. Soc.，83，2149-54 页(1963)描述的固相合成技术来制 备R印，或可以通过在溶液中合成来制备R印。肽合成技术的概述可见于E. Gross & H.J.Meinhofer, The Peptides :Analysis, Synthesis, Biology；Modern Techniques Of Peptide And Amino Acid Analysis, John Wiley & Sons, (1981)禾口 M. Bodanszky, Principles Of Peptide Synthesis, Springer-Verlag(1984)中。可以通过多种方法在体外测定Rep或其编码核酸的功能活性和/或治疗有效剂 量。例如，测定血管发生抑制性Rep在体外抑制或干扰内皮细胞在胞外基质上形成毛细管 样结构的性能的能力时，可以使用本领域已知的多种生物测定，其包含但不限于创伤愈合、 内皮细胞增殖的抑制、内皮细胞迁移的抑制和细胞计数。用于在体内抑制血管发生的能力的测定包括鸡尿囊绒膜测定和小鼠、大鼠或兔角 膜袋(corneal pocket)测定。还可以用多种已知的体内和体外测定来测定抗血管发生蛋白质影响血管发生的 能力。这类测定公开于 Jain 等，(Nature Med 1997,3 =1203-1208)中。可以从使用本发明的上述组合物或与其他血管发生抑制因子组合的体外抑制测 定推断抑制体内血管发生(定义为胞外基质毛细管样结构形成和内皮细胞增殖和迁移的 抑制)的治疗有效剂量。有效剂量还依赖于递送的方法和手段。例如，在一些应用中，如在 银屑病或糖尿病性视网膜病的治疗中，在局部眼科载体中递送抑制剂。在其他应用中，如在 实体瘤的治疗中，利用生物可降解的聚合植入物递送抑制剂。还可以例如通过聚乙二醇处 理来修饰蛋白质。可以用本发明的治疗组合物治疗的与异常血管发生或新血管形成相关的疾病、障 碍或病症包含但不限于视网膜新血管形成、肿瘤生长、血管瘤、实体瘤、白血病、转移、银屑 病、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、关节炎、类风湿性关节炎、子宫内膜异位症和早 产儿视网膜病(ROP)。本文所用的术语“有效剂量”指足以显示可检测的疗效的本发明的抗血管发生蛋 白质的量。疗效非限制性地包含，例如，抑制不希望的组织或恶性细胞的生长、抑制不适当 的血管发生(新血管形成)、限制慢性炎症引起的组织损伤、抑制肿瘤细胞生长。受试者的 精确有效量可以依赖于受试者的尺寸和健康、待治疗病症的性质和严重度。因此，不可能预先指定精确有效量。但是，可以通过基于本文所提供的信息的常规实验来测定给定情况的
有效量。本发明的抗血管发生蛋白质可口服施用、局部施用，或通过肠胃外途径施用，其包 括皮下和肌内注射、植入持续释放的长效制剂、静脉内注射或鼻内施用。因此，优选将本发 明的抗血管发生蛋白质作为药物组合物施用，该药物组合物包含与可药用载体组合的本发 明的抗血管发生蛋白质。术语“可药用”指可在无过度毒性的情况下对哺乳动物施用的化合 物和组合物。示例性可药用盐包含无机酸盐，如氢氯化物、氢溴化物、磷酸盐和硫酸盐；和有 机酸盐，如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐或苯甲酸盐。这类组合物可以是水溶液剂、乳剂、霜剂、 软膏剂、混悬剂、凝胶剂和脂质体混悬剂。适合的载体(赋形剂)包含水、盐水、林格氏液、葡 萄糖溶液和乙醇、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇(PEG)、磷酸盐、 醋酸盐、明胶、胶原、Carbopol 、植物油的溶液。此外，还可以包含适合的防腐剂、稳定剂、 抗氧化剂、抗微生物剂和缓冲剂，例如BHA、BHT、柠檬酸、抗坏血酸和四环素。用于制剂的霜 剂或软膏剂基质包含羊毛月旨、Silvadene (Marion)、Aquaphor (Duke Laboratories)。 其他局部制剂包含气溶胶、绷带和其他创伤敷料。备选地，可以将本发明的治疗化合物掺 入或封装入适合的聚合物基质、纳米泡(nanobubble)或膜中，从而提供适合用于局部植入 待治疗部位附近的持续释放递送装置。其他装置包含留置导管和如Alzet 微泵的装置。 可以用市售载体如 Sorbi-care (Allergan)、Neodecadron (Merck, Sharp & Dohme)、 Lacrilube 配制眼科制剂，或可以利用局部制剂，如描述于美国专利号5，124，155中的局 部制剂，该专利在此引用作为参考。此外，可以以固体形式，尤其是作为冻干粉末提供本发 明的治疗化合物。冻干制剂通常包含稳定剂和填充剂，例如人血清白蛋白、蔗糖和甘露醇。 可在Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)中获得可药用赋形剂的透彻 讨论。可以以基因治疗的形式使用本发明的编码抗血管发生蛋白质的DNA，并通过本领 域技术人员已知的任意方法递送至宿主，以治疗与血管发生相关的障碍或组织重塑相关的 病症。本发明的优选实施方案涉及抑制实体瘤的血管发生以预防进一步的肿瘤生长和 转移的方法。为此目的，基因转移可接近的任意实体瘤或肿瘤周围区域可以是进行所公开 的治疗应用的靶点。可以通过本领域已知的很多方法直接将包含于重组病毒的或非基于病 毒的基因转移系统内的编码血管发生多肽的DNA导向肿瘤周围的靶细胞，这些方法包括但 不限于(a)与对肿瘤内和肿瘤周围部位施用有效量的DNA相结合的外科方法(如果可能， 涉及最初除去部分或全部肿瘤)；(b)将基因转移载体直接注射入肿瘤内或邻近肿瘤的部 位；和(c)用本领域已知的技术局部或全身递送基因转移载体和/或基因产物。任意实体 瘤可以是治疗的可能靶点。尤其易受基因治疗应用的实体瘤的不以任意方式旨在作为限 制的实例是(a)中枢神经系统的瘤，例如，但同样不限于胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、成神 经细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤；(b)激素依赖性组织的癌，如前列腺癌、睾丸癌、子宫癌、宫颈 癌、卵巢癌、乳癌，其包含但不限于原位癌、髓样癌、导管癌、浸润性(渗透性)癌和粘液癌； (c)黑素瘤，其包含但不限于皮肤黑素瘤和眼黑素瘤；(d)肺癌，其至少包含鳞状细胞癌、梭 形细胞癌、小细胞癌、腺癌和大细胞癌；和(e)胃肠系统，如食管、胃、小肠、结肠、结肠直肠、 直肠和肛门区域的癌，其至少包含大肠腺癌。
在本发明尤其优选的实施方案中，将本发明的U94基因、所编码的Rep蛋白质或 其类似物用于肿瘤的预防性和治疗性处理，该肿瘤显示分化为内皮样细胞和在适合的基质 上形成自身毛细管样结构的能力。这些包含人乳腺癌Gerwe等，hvest New Drugs, 2008 年11月14日，先于印刷版的电子版)和人黑素瘤(Mourad-kidan等，Am. J. Pathol. 173 1839-52，2008)，其促进其癌要素(cancer element)转化进入能够进行血管发生和支持肿 瘤存活和发展以及转移性扩散的内皮样细胞。这是本发明的区别性特征，因为迄今针对U94 设想的治疗应用不允许预测其在表征为具有血管发生能力的要素的肿瘤治疗中的特定效
果 ο可以通过基于病毒或非病毒的方法，将编码抗血管发生蛋白质的DNA递送至哺乳 动物宿主的全身或递送至实体瘤周围的靶细胞。可以用于本发明的病毒载体系统包含但不 限于腺病毒载体、反转录病毒载体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、SV40载体、多瘤病 毒载体、乳头瘤病毒载体、小RNA病毒载体和痘苗病毒载体。优选通过直接注射入实体瘤和/或实体瘤周围的静息组织，如脂肪或肌肉组织， 来对宿主施用包含本发明的编码抗血管发生蛋白质的DNA的重组病毒或载体。转染靶脂肪 和肌肉组织区域内的肿瘤细胞当然可以是有用的。抗血管发生多肽在这些周围细胞中的瞬 时表达可导致这些蛋白质的局部胞内增加。可以用于本发明的非病毒载体包含但不限于DNA-脂质复合物，例如脂质体介导 的或配体/聚-L-赖氨酸的缀合物，如唾液酸糖蛋白介导的递送系统(见，例如!Signer等， 1994, J. Biol. Chem. 269 :2550-2561 ；Derossi 等，1995, Restor. Neurol. Neuros. 8 :7-10 ； 和 Abcallah 等，1995，Biol. Cell85 :1-7 ;Karmali 和 Chaudhuri，2006，Med Res Rev 27: 696-722)；生物可降解聚合物(见，例如Luten等，2008，J Control Release 126:97-110)； 或负载质粒 DNA 的微泡(microbubble，见，例如 Bekeredjian 等，2003，Circulation 108 1022-1026)。还可以使用“裸”DNA的直接注射(见，例如Lin等，Circulation 1990,82 2217-2221)。本发明还提供包含一个或多个填充了本发明药物组合物的一种或多种成分的包 装(container)的药包或药盒。可选地，这类包装可以按管理药品或生物制品的生产、使用 或销售的政府机构规定的形式与公告或传单结合，该公告或传单反映了由生产、使用或销 售用于人类施用的机构批准。本申请通篇引用的参考文献在此引入作为参考。通过以下实 施例进一步说明本发明。
实施例以下实施例进一步说明本发明。这些实施例并非旨在限制本发明的范围。依据本 公开内容，对本领域普通技术人员而言，权利要求范围内的大量实施方案是显而易见的。实施例1原代人内皮细胞转染按照之前所述(Rotola等，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95 :13911-13916)，通 过HHV-6变体B的ORF U94的PCR扩增获得全长U94基因。将来自HHV-6B Rl菌株的U94 基因(Dewhurst 等，2000，Virology 190:490-493)克隆入 pSR2ph 载体(pSR2ph_U94)。按 照厂家的说明用AMAXA装置(Koln，德国)核转染pSR2ph_U94 0 μ g)入IO6BEC或LEC。转染后在不同时间点(1、2、3和5天)收获细胞并提取总RNA。反转录后，按Rotola等，1998， Proc Natl Acad Sci USA 95 :13911-13916 所述，用 U94 特异性引物通过 PCR 扩增 cDNA。 如

图1中所示，如U94转录本在所评估的各时间点的存在所表明，U94基因在BEC中持续表 达。用LEC进行pSR2ph-U94转染获得了相似的结果。我们用pSR2ph_U94质粒作为反应的 阳性对照，而持家基因β-肌动蛋白的扩增验证了 cDNA样品的适合性。实施例2pSR2ph_U94转染的内皮细胞在培养物基膜提取物(BME)上的索带(cord)形成用已在使用前于-20°C冷却的无菌吸头将200 μ 1 4 V的BME (10mg/ml) (Cultrex ； Trevigen Inc.，Gaithersburg, MA)转移至预冷的48孔培养板。轻轻搅动以 确保包被后，将平板在37°C孵育1小时，使Cultrex BME固化。然后将原代BEC或LEC按 6 X IO4/孔的密度接种在EGM中。细胞接种后M小时观察索带形成。在包含VEGF的内皮生 长培养基(EGM)存在的情况下，两种内皮细胞类型都在接种后M小时在Cultrex BME上 自发形成毛细管样结构。如图2中代表性地所显示，pSR2ph-U94转染后1天收获并在EGM 存在的情况下培养在Cultrex 上的BEC和LEC未能在接种M小时后形成管。具体而言， 我们观察到，粘附至Cultrex BME的细胞形成几乎不形成空心管样结构的单层。相反，用 pSR2ph空质粒转染的BEC或LEC保持形成毛细管样结构的复杂网络的能力。实施例3Rep处理的内皮细胞在培养物基膜提取物(BME)上的索带形成通过Hindi 11消化从pSR2ph切下R印编码基因并亚克隆入细菌pQE30载体 (Qiagen)，获得重组质粒pQE-r印。将基因与氨基端的6个组氨酸残基(His)6延伸符合读 框地克隆在T5启动子/Iac操纵子的控制下。用重组质粒转化M15大肠杆菌(E. coli)菌 株，该菌株含有PREP4质粒，该质粒包含编码Iac阻抑物的IacI基因。加入异丙基硫代半 乳糖苷(IPTG)后，T5/lac启动子被激活，导致克隆入pQE30的融合蛋白质的高产率产生。 按已描述的方法(Caselli等，2006，Virology 346 :402-414)，在无内毒素污染的情况下产 生和纯化R印蛋白质。按从0. 1至5 μ g/ml的剂量范围用重组R印处理原代BEC或LEC 24小时并悬浮 在EGM中。然后按6 X IO6细胞/孔的浓度将细胞接种在BME包被的48孔板上。未处理的 细胞在细胞接种后M小时显示索带形成。Rep处理后1天收获并在EGM存在的情况下培养 在Cultrex 上的BEC或LEC未能在接种后M小时形成管。重组R印以剂量依赖的方式 抑制BEC或LEC的血管发生活性，在5 μ g/ml的蛋白质浓度观察到最佳抑制。为了确认特 异性，还用等量(5yg/ml)通过在100°C下煮沸蛋白质制剂10分钟获得的热变性Rep进行 了实验(图3)。结果显示，热变性消除了 Rep活性，表明该蛋白质的折叠对其作用很重要。实施例4pSR2ph-U94转染的MDA_MB_231细胞在培养物基膜提取物(BME)上的索带形成按照厂家的说明用AMAXA装置将pSR2ph_U94 (2 μ g)核转染入106MDA_MB_231细 胞(ATCC编号HTB-沈衍生自人乳腺癌)。然后按6 X IO4/孔的浓度将MDA-MB-231细胞接 种在RPMI-1640培养基中。在培养基中不存在任意促血管发生因子的情况下，细胞在接种 后M小时在Cultrex 上自发形成毛细管样结构。pSR2ph-U94转染后1天收获并培养在 Cultrex: 上的细胞未能在接种后M小时形成管。另一方面，用pSR2ph空质粒转染的细胞保持形成毛细管样结构的复杂网络的能力。实施例5内皮细胞迁移测定按照厂家的说明用AMAXA装置(KoIn，德国)将pSR2ph_U94 O μ g)核转染入 IO6BEC或LEC。转染后M小时收获细胞，接种(2. 5 X IO5细胞/孔)在胶原包被的12孔培 养板上并培养至汇合。同时，用重组R印(5yg/ml)处理原代BEC或LEC对小时，按上文接 种在胶原包被的12孔培养板上并培养至汇合。用200 μ 1或Iml吸头划开汇合的单层。通 过光学显微镜(Leica DM IRB，Wetzlar，德国)观察内皮细胞迁移，并用使用数字分析系统 (QffIN LITE版本2. 3 ;Leica)的 CCD光学器件(Hitachi Denshi Color Camera KP-D50E/K ； Rodgau，德国)拍照。在8小时的时程内观察创伤封闭的百分比。如图4中所示，对照BEC在 200 μ 1吸头引起创伤划痕后8小时达到60-80%封闭。与对照BEC同时划开的pSR2ph_U94 转染的BEC在创伤划开后8小时仅显示约20-30%封闭。用pSR2ph-U94转染的LEC获得了 相似的结果。这些结果表明，U94基因在细胞中表达减弱了 BEC和LEC在创伤愈合测定中 的迁移。用按5 μ g/ml的浓度用重组R印蛋白质处理M小时或未处理的BEC和LEC进行 了相同的测定。与它们的未处理的副本相比，在Rep处理的BEC或LEC中，细胞迁移受到强 烈的影响。实际上，Rep处理的细胞在创伤划开后8小时仅显示对照细胞创伤封闭活性的 10%。实施例6主动脉环测定按之前所述(NicosiaR. F.和 Ottinetti A. 2000. Lab. Invest. 63 :115-122)进行 大鼠主动脉环测定。简言之，通过(X)2饱和空气处死大鼠，在解剖显微镜下切下背主动脉并 剔除脂肪。制备约Imm厚的环并在使用前在4°C下在DMEM中保存少于2小时。将8体积从 大鼠尾制备的1型胶原溶液(1. 5mg/ml)与1体积10XDMEM和1体积NaHCO34mg/ml)混 合。将40 μ 1胶原溶液放入4孔板的各孔中并将一个主动脉环转移至各孔内。在37°C下在 潮湿空气中孵育平板30分钟以获得胶凝(jellification)。孵育后，往各孔中加入500 μ 1 EBM,其单独包含重组R印(0. 5-5 μ g)或包含与20ng/ml VEGF组合的重组R印。将平板孵 育10-12天。通过每三天进行拍照并计数从主动脉环起始的血管数目来获得血管发生的定 量。实施例7Rep阻断大鼠主动脉环的血管发生还用主动脉环测定研究了重组R印对血管发生的影响。此方法允许研究分子干扰 哺乳动物微血管体外生长的能力。用重组R印处理主动脉环导致自发微血管派生的急剧降 低。在5μ g/ml的蛋白质浓度下孵育7天后观察到由R印诱导的最大的血管发生抑制。此 时，与用R印处理的环中5士4的微血管数相比，对照培养物中微血管的数目为45士8(图 5)。如预期，用20mg/ml的血管内皮生长因子(VEGF)刺激主动脉环强烈地增加了微血管派 生085 士 74)。R印(5 μ g/ml)加入到VEGF处理的环降低微血管数量为285 士 74。较低浓度 的U94 (2. 5-1 μ g/ml)仍然是抑制性的，但有效性较低。在0. 5 μ g/ml的浓度下，Rep不影 响大鼠主动脉血管发生。此结果显示，R印不仅能够干扰自发血管发生的潜在机制，还使主动脉环对有效力的VEGF诱导的血管发生活性完全不敏感。
权利要求
1.用于在哺乳动物受试者中预防或治疗血管发生和/或淋巴管发生相关的疾病、状态 或病症的治疗组合物，其单独包含以下或包含以下的组合a)编码具有抗血管发生和抗淋巴管发生活性的蛋白质的HHV-6核酸分子，其中所述核 酸分子具有选自以下的序列i)SEQID NO 1 ；ii)由于遗传密码的简并性而不同于SEQID NO 1的序列；iii)在严格条件下与SEQID NO 1杂交的序列；b)包含如上所定义的核酸分子的表达载体；c)由如上所定义的核酸分子编码的蛋白质，或其携带保守性取代且保留抗血管发生和 抗淋巴管发生活性的类似物。
2.权利要求1的组合物，其中所述哺乳动物受试者是人类。
3.权利要求1的组合物，其中所述核酸分子是裸DNA的形式。
4.权利要求1的组合物，其中所述表达载体是病毒载体。
5.权利要求4的组合物，其中所述病毒载体是以下之一腺病毒载体、反转录病毒载 体、腺伴随病毒载体、单纯疱疹病毒载体、SV40载体、多瘤病毒载体、乳头瘤病毒载体、小 RNA病毒载体和痘苗病毒载体。
6.权利要求1的组合物，其中所述由核酸分子编码的蛋白质具有序列SEQID NO :2。
7.权利要求6的组合物，其中所述蛋白质是纯化的重组蛋白质的形式。
8.权利要求1的组合物，其是DNA-脂质复合物、脂质体介导的或配体/聚-L-赖氨酸 的缀合物、唾液酸糖蛋白介导的递送系统、生物可降解聚合物或负载质粒DNA的微泡的形 式。
9.权利要求1-8中任一项的组合物，其用于以下疾病或病症之一的治疗血管瘤、实体 瘤、卡波西肉瘤、白血病、转移、毛细血管扩张症、银屑病、硬皮病、脓性肉芽肿、心肌血管发 生、斑块新血管形成、冠状动脉侧枝、脑侧枝、动静脉畸形、缺血性肢血管发生、角膜疾病、潮 红、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病、晶状体后纤维组织形成、关节炎、类风湿性关节 炎、糖尿病性新血管形成、黄斑变性、班氏吴策线虫感染、巴尔通体感染、创伤愈合、消化性 溃疡、骨折、瘢痕疙瘩、血管发生、血细胞发生、排卵或月经。
10.权利要求1-8中任一项的组合物，其用于显示分化为内皮样细胞和形成毛细管样 结构的能力的肿瘤的治疗。
11.权利要求1-8中任一项的组合物，其用于人乳腺癌和人黑素瘤的治疗。
12.权利要求1-8中任一项的组合物，其用于抑制子宫内膜血管形成中的或胚胎植入 中的血管发生和/或淋巴管发生。
全文摘要
本发明描述了人疱疹病毒6型(HHV-6)U94基因及其产物蛋白质Rep、适合用于递送U94基因或从其编码的蛋白质至治疗部位的表达载体和药物组合物对在有需要的受试者中抑制血管发生和淋巴管发生过程的用途。
文档编号C12N15/38GK102066406SQ200980121826
公开日2011年5月18日 申请日期2009年6月10日 优先权日2008年6月12日
发明者A·卡鲁索, D·迪卢卡 申请人:福玻斯有限公司