一种生物源人工小口径血管及其制备方法

专利名称：一种生物源人工小口径血管及其制备方法
技术领域：
本发明属生物医学工程学领域，涉及一种人工小口径血管的交联制备方法。
背景技术：
心血管病和外周血管病具有很高的发病率、致残率和致死率[I]，2003年世界卫生组织报告，全世界每年约有1670万人死于心血管病，占总死亡人数的1/3 [2]。初步统计，我国每年大约有260万人死于心血管病，每12秒钟，就有一人死于该病，每15秒钟，就有一人因该病丧失工作能力。我国心血管病发病人数每年都在上升，所引起的死亡已经占到疾病死亡人数的44%左右[3],这其中以小血管病变更为常见。治疗严重小血管病变的常用办法是，取自身大隐静脉(saphenous vein)、乳房动脉(internal artery)和放射状动脉(radial artery)移植,做搭桥(bypass)手术,但约有10%的患者没有健康可供移植的自身小血管。因此小血管病变的修复便需要人工小血管替代。而常用的人工合成材料涤纶 (Dacron)和聚四氟乙烯(ePTFE)制成的小血管，常因弹性差、不柔顺、严重血栓、动脉瘤和感染等造成修复失败[4，5]。小于6mm直径的小血管仅6个月后血栓率就超过40% [6]。所以人们将修复的希望寄托于新型生物材料的应用和组织工程构建。我国是人口大国，随着老龄化的增长，发病率将进一步增高，小直径人工血管的需求将是一个很大的市场。面对需求，有必要加大研究力度，逐步促成我国在这个市场中拥有自主知识产权的产品。血管由内到外分为三层结构内膜层(intima)，中膜(media)和外膜(adventitia)。内膜是一层排列紧密的内皮细胞层构成，内皮细胞层通过多糖性细胞间质与很薄的内膜下层黏结。内膜下层是结缔组织，由多条环状弹性蛋白带以及胶原蛋白相互交织而成。中膜由多层平滑肌细胞和结缔组织细胞组成，细胞层间是环行排列的很厚的弹性蛋白纤维和多糖基质。外膜由结缔组织细胞和神经细胞组成。结缔组织富含相互交织的胶原蛋白和弹性蛋白。血管所处的环境为内膜与血液接触，外膜与体液接触。从病理生理学角度，血管内皮损伤后，细胞外基质或人工支架暴露于血液，引起血小板聚集，形成血栓。随着时间的推移，血管平滑肌细胞迁移、增殖并分泌沉积大量胞外基质，导致内膜增生，使血管狭窄，进一步促进局部血栓，引起受血部位的器官如大脑、心肌和肢体末端出现缺血损伤症状。小血管修复后再狭窄，也主要是由于内膜增生和血小板聚集二者共同作用引起[7]。理想的小口径人工血管应该具有以下性能[6，8，9] (1)生物相容性，包括不引起血栓，无免疫原性，抗感染；(2)具有连续、不活化的内皮层，该内皮层有应激修复能力，但不会引起炎症、钙化、肥大性增生、纤维囊形成等，利于长久抗血栓；(3)能够在体内局部环境的作用下进行重塑(remodeling)，最终成为自体血管的一部分，并与自体血管没有明显区别；(4)具备适当的机械性能，包括生理环境下适当的抗拉伸强度，弹性摸量，可弯曲能力，耐血流长期剪切作用，不形成动脉瘤，尤其要能耐受极端血压冲击；(5)具备适当的渗透能力，保证水分和溶解于水的物质，甚至一些细胞可以透过；(6)具备生理活性，如血管收缩/舒张反应，以维持正常血压；(7)便于临床处理和缝合。显然，用于制备大血管的dacron和ePTFE材料不可能满足上述要求。近年来，研究人员采用新型生物材料支架结合组织工程学的原理、方法、技术构建组织工程小口径人工血管(Tissue engineering blood vessel, TEBV),发展了多种构建方法。这些方法主要分为4类(1)合成高分子支架；(2)细胞薄膜的“组织自组装”方法；(3)水凝胶和生物聚合物支架；(4)脱细胞组织支架。这4类方法分别都取得了可喜进展[5]。 生物可降解高分子材料，如聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、聚羟基链烷酸酯(polyhydroxyalkanoate)、聚_4_轻基丁酸酯、聚己酸内酯-共-聚乳酸和聚乙二醇等，作为组织工程支架材料，可以很快成型为各种形状，可以保证所需的力学强度，可以在成型后种植细胞，植入体内后材料可被降解吸收，其降解吸收速率可依据利 于体内重塑的要求，调整化学组成而调控。但其弹性和柔顺度难以与正常血管匹配，没有在体外构建成熟的组织工程血管,植入体内后支架材料的降解速度难以与细胞新形成的胞外基质(extracellularmatrix, ECM)速度相匹配,容易引起血栓等严重问题。高分子材料支架复合以患者自身细胞，体外构建成熟的血管，已有一些临床应用成功的病例[10]。不过，这些病例植入的都是替代低血压(20 30mmHg)肺循环的血管,其构建时间长,不能随时取用。Niklason等在体外加脉冲压力动态培养构建，力学强度有很大提高，但植入后仍有材料引起的炎症反应。这类方法值得借鉴之处在于，支架复合细胞后，利用力学刺激环境提高人工血管的力学性能，促进其重塑与成熟。细胞薄膜的“组织自组装”方法是，将血管平滑肌细胞(SMC)培养于培养皿，加抗坏血酸，促其分泌大量胶原蛋白形成薄膜，将形成的薄膜用多孔小管卷成血管结构，再将内表面培养一层内皮细胞，再在外面包裹一层成纤维细胞薄膜，继续旋转培养，最后形成血管典型的3层结构。这样构建的血管其力学强度可支持相当于大隐静脉的血压(1680mmHg)。但其管壁中缺少弹性蛋白，柔顺度虽然较ePTFE好，但比正常小血管差很多，容易引起内膜增生性再狭窄[5]。这类方法值得借鉴之处在于，充分利用细胞本身的合成作用，以及利用旋转培养方法促进血管结构形成。生物聚合物或水凝胶支架由I型胶原蛋白和纤溶蛋白构成，加上内皮细胞和平滑肌细胞即构建成“生物人工动脉血管”(bioartificial artery, BAA)。I型胶原蛋白是人体含量最高、最常见的蛋白，也是细胞主要的天然支架材料。纤溶蛋白能够促进组织修复。将二者复合，加上细胞并压紧后，通过旋转培养可大量扩增细胞，促使纤溶蛋白形成围绕血管壁排列结构，并可诱导平滑肌细胞也围绕血管壁紧密排列，形成更近似于正常血管中膜的结构，提高了力学强度，同时也促进细胞更容易实现对血管的重塑。遗憾的是，这样的血管也没有弹性蛋白形成，仅靠细胞规则排列还不能实现较高的力学强度，仅能承受很低的血压(约300mmHg)。目前这种血管还在做各种交联处理和添加弹性蛋白，以提高力学强度[5]。该类方法值得借鉴之处在于充分利用细胞的天然支架材料I型胶原蛋白和弹性蛋白以及重塑促进因子纤溶蛋白。但上述方法也还存在问题，无法实现临床应用。综合起来，目前各类TEBV构建方法还存在以下几大关键问题需要解决[5] =(I)TEBV必须具有有充足细胞来源的内皮细胞衬里，确保其没有血栓诱导因子；(2)TEBV必须具有适当的机械性能，包括与自体血管相匹配的弹性和拉伸强度；(3)TEBV必须具有体内重塑的能力；(4)不能随时供应临床。而要同时解决这些问题，现有方法还过于复杂，且周期较长种子细胞来源有限需要培养扩增，构建后需要体外脉动培养。
脱细胞组织完全由天然胞外基质组成，基质中含有胶原蛋白、弹性蛋白和纤溶蛋白等，在机械性能方面和生物相容性方面具有极大的优势，可以直接植入体内，原位由宿主细胞再细胞化。脱细胞组织来源广泛，可以是脱细胞血管，可以是小肠黏膜下层(smallintestinal submucosa, SIS)等。一般采用去垢剂、酶、酶抑制剂和缓冲液，以及核酸酶等去除细胞而得到。如果是脱细胞血管，则可基本保持人工血管所要求的结构和组成。然而，脱细胞过程也会带来一些负面影响，如降低了拉伸强度、柔顺度和去除了糖蛋白引起的大幅度收缩等，此外异种组织还容易引起感染和血栓，也抑制再细胞化。SIS虽然能消除一些缺陷，但血栓问题始终难以解决[5]。这些研究提示如果能够完全脱细胞，提高脱细胞组织材料的拉伸强度，保持柔顺度，保持适当的弹性，抑制钙化，抑制血小板聚集以防血栓形成，那么所制成的血管将较为理想。采用交联剂对脱细胞血管组织进行处理是改善其力学和生物学性能的有效方法。常规动物组织常用戊二醛交联，但戊二醛具有一定的毒性，而且其交联的组织长期植入体内会发生钙化[12]。原花青素(procyanidins,PC)是由2-4个儿茶素((+) catechin)和/或表儿茶素((-) epycatechin)为单体聚合而成[11]的多种聚合物的混合体。PC最初是由地中海沿岸·的海岸松(Pinus maritina)树皮中提取而来，现已可从葡萄、山楂、可可和苹果等水果中大量提取，是干红葡萄酒的重要成分，没有任何毒性。PC与蛋白质脯氨酸残基有高亲和力，可结合蛋白质分子表面0H、C00-、NH等，并形成氢键交联。近年来的研究[13，14]发现其可用来交联蛋白质制备生物材料，交联的材料不仅具有优良的力学性能和稳定性，还能抑制钙化。国内也有用PC交联脱细胞心脏瓣膜制备人工生物瓣膜的专利(CN200510110957. 2)，但心脏瓣膜的结构较简单，仅有外层的内皮细胞和内部的间质细胞，远不如血管壁结构复杂。瓣膜细胞外基质的离心面为胶原蛋白，近心面为弹性蛋白[Frederick J. Schoen,I Robert J. Levy. Tissue heart valves Current challenges and future researchperspectives. J Biomed Mater Res, 47,439-465,1999. ], 二者不相互交叉排列，也不同于血管中的胶原蛋白和弹性蛋白的排列方式。人工生物瓣膜要求高度柔顺，而血管要求适当机械性能，以使管腔不致塌陷。心脏瓣膜所处环境为上下两面均与血液接触，不同于血管仅内膜与血液接触，而外膜与体液接触。人工生物瓣膜对体内细胞能否黏附没有要求，而人工血管内膜细胞黏附实现再细胞化，将能进一步保证人工血管的长期抗血栓性能。本发明采用PC交联脱细胞动物如牛、猪等的小口径血管材料，包括颈动脉或隐静脉脱细胞小口径血管材料，制备性能要求不同于瓣膜的新型人工小口径血管，用作临床所需的小口径血管替代品。

发明内容
本发明的目的，在于提供一种抗张强度高，细胞相容性好、血液相容性优良，抗血栓、抗钙化和低免疫原性的人工生物小口径血管。本发明旨在采用纯天然的、日常食物中存在的、无毒的并具有一定生理保护功效的、全新交联剂，交联脱细胞哺乳动物颈动脉和隐静脉血管材料，或其它来源材料(如来源于猪的小口径血管)，制备人工生物小口径血管，以满足临床上病人对小口径血管移植物的需求。本发明通过上述全新交联剂对哺乳动物颈动脉或隐静脉脱细胞小口径血管的交联而实现。与常规戊二醛交联结果相比，本发明制备的小口径血管材料不仅能降低所交联小口径血管的毒性，而且可保持小口径血管的天然形态、柔软性，提高小口径血管的力学强度和稳定性，有良好的血管细胞相容性、血液相容性，低免疫原性，并有较强的抗血栓性能和抑制小口径血管钙化的潜能。与PC交联脱细胞心脏瓣膜相比，由于血管壁中胶原蛋白和弹性蛋白交织排列，PC有更多机会将胶原蛋白和弹性蛋白分子同时交联，稳定或提高血管管腔结构，不致塌陷。本发明提供一种人工小口径血管的制备方法，所述方法包括D-Hanks使用原花青素作为交联剂对脱细胞的哺乳动物小口径血管材料进行交联处理的步骤。在一具体实施例中，所述方法包括以下步骤(I)获得哺乳动物小口径血管材料；(2)对所述小口径血管材料进行脱细胞处理，获得仍保存血管形状的天然胞外基 质；和(3)使用原花青素交联所述天然胞外基质。在一具体实施例中，所述哺乳动物小口径血管材料来自新鲜的哺乳动物颈动脉和隐静脉血管。在一具体实施例中，所述脱细胞处理包括(a)将清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中；(b)用含有O. 20 O. 30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流，然后浸泡在该D-Hanks溶液中，30 40°C下消化；(c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液终止消化，清洗；(d)将步骤(C)所得血管浸入包含triton X-100、脱氧胆酸钠和乙二胺四乙酸二钠溶液的D-Hanks混合溶液中，持续温和摇动，以脱去血管表面和内部的细胞；(e)将步骤(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脱氧核糖核酸酶溶液中，或者浸泡在含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的混合溶液中，以除去小口径血管内部细胞残余的细胞核成分；和(f)清洗步骤(e)所得血管，从而实现脱细胞处理。在一具体实施例中，所述脱细胞处理前还包括用I 6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和杂质的血管。在一具体实施例中，所述交联通过以每厘米血管长度I IOmL含O. I 10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脱细胞的哺乳动物小口径血管材料而实现。在一具体实施例中，所述原花青素的浓度为2. 5 5mg/mL，以每厘米血管长度3 5mL的量使用该含花青素的D-Hanks溶液。在一具体实施例中，交联条件为4 40°C下60 360rpm摇动交联I 96小时。在一具体实施例中，交联条件为30 40°C，摇动转速为120 180rpm，交联时间为24 72小时。在一具体实施例中，所述步骤(C)中的D-Hanks混合溶液为含有O. 3 O. 6%triton Χ-100、0· 3 O. 6%脱氧胆酸钠和O. 01 O. 05%乙二胺四乙酸二钠的D-Hanks溶液。在一具体实施例中，所述步骤(d)中的核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的浓度分别为 10 30 μ g/mL 和 100 300 μ g/mL。
在一具体实施例中，所述方法还包括交联后处理，所述后处理是将交联后的完全脱细胞的小口径血管浸入D-Hanks溶液中I 40天。本发明包括采用本发明方法制备得到的人工小口径血管。在一具体实施例中，本发明的人工小口径血管含有原花青素和哺乳动物小口径血管天然胞外基质。在一具体实施例中，本发明的人工小口径血管含有原花青素和哺乳动物小口径血管脱细胞处理后的产物。在一具体实施例中，本发明的人工小口径血管含有经原花青素交联处理的哺乳动物小口径血管天然胞外基质。在一具体实施例中，本发明在经原花青素交联处理后的人工小口径血管中，每厘米长含有约3 15mg原花青素。 在其它实施例中，本发明在经原花青素交联处理后的人工小口径血管中，每厘米长含有约3 8mg原花青素。。在一具体实施例中，所述哺乳动物小口径血管脱细胞处理后的产物为所述天然胞外基质。在一具体实施例中，所述天然胞外基质主要由胶原蛋白、弹性蛋白和纤溶蛋白等组成。在一具体实施例中，所述血管还包括内皮细胞和平滑肌细胞。在一具体实施例中，所述哺乳动物选自牛、猪、羊、兔和狗。在一具体实施例中，所述哺乳动物小口径血管选自哺乳动物的颈动脉和隐静脉血管。本发明提供一种组合物，所述组合物含有本发明的人工小口径血管和用于保存该血管的溶液。


图I显示，小牛小口径血管中的细胞成分经脱细胞处理之后细胞已全部去除干净，相对于正常致密的血管壁(图1B)，脱细胞血管壁变地疏松而富有空隙(图ID中的箭头)，同时血管壁中也无正常壁中的细胞核物质(图IB中的箭头)。图2为本发明的小血管形态照片。可以看出，新鲜血管呈正常的圆柱状，经脱细胞处理后，颜色变白，变软。经戊二醛(GA)和本发明所使用的原花青素交联后都稍变硬，而且随着原花青素交联浓度的增大，硬度有增大趋势。血管呈不同的颜色变化戊二醛交联后血管呈淡黄色，而PC交联后血管呈棕红色。原花青素在浓度为2. 5mg/mL和5mg/mL时交联效果较好。图3为本发明所交联的脱细胞血管样品力学性能的测试结果。图3A显示新鲜血管的最大抗拉强度为I. 84MPa，而经脱细胞和交联处理后最大抗拉强度显著增大至2 5倍，而经各个浓度原花青素交联后的最大抗拉强度更大。图3B显示新鲜血管的弹性模量为
I.96MPa，而经脱细胞和交联处理后的弹性模量为显著增大至IOMPa左右，而经各个浓度原花青素交联后的弹性模量更大。说明本发明原花青素交联处理的脱细胞小口径血管具有较高的力学性能。
图4A显示，脱细胞未交联组(对照)胶原酶降解快速，Ih降解80%多，24h降解近98% ;而本发明原花青素交联组降解速度慢；经胶原酶降解4h后，各个实验组血管降解几乎达到最大值，与24h时间点的降解率并没有明显的差异。因此，选取4h时间点做更精确的降解检测。图4B显示，经胶原酶体外降解4h后，原花青素能有效的抗体外酶降解，与戍二醒的抗降解能力相当。图5A为本发明交联制备的小血管中原花青素的交联稳定性。从中可以看出交联血管浸泡于D-Hanks溶液中初期有小部分未交联的原花青素释放快速,前4天基本释放完毕，30天之后检测不到各个交联浓度血管原花青素的释放。由图5B、5C可以看出随着时间的延长，累积释放量及释放率均增大，前3d增大速度最快，之后平缓增长，最后趋于平稳状态。从释放率图5C可以看出，30d后各个交联浓度的释放率(相当于原始交联溶液中的PC量)分别为24%、20%、25%、27%、27%，基本趋于稳定一致。这些结果说明原花青素能够稳定地存在于被交联的血管中，同时也说明原花青素能够稳定地交联脱细胞血管材料。图6为脱细胞血管样品浸泡于SBF中IOd后，脱细胞未交联组(control)及·6. 25mg/mL GA交联组分别生长了致密的一层羟基磷灰石，说明在该位点发生了钙化。而经各个浓度原花青素交联的脱细胞血管亦有零星的沉积位点，EDS显示Ca/P均在I. 36
I.57之间，并且随着交联浓度的增大，沉积位点逐渐减少。该结果表明，原花青素交联有明显的抗钙化作用，并且随着浓度的增大，抗钙化能力逐渐加强。原花青素在浓度大于5mg/mL时抗钙化效果较理想。图7为采用脱细胞血管支架表面种植细胞试验来检测交联血管的生物相容性。图7中可以看出，细胞接种2天后，脱细胞未交联对照(control)组血管表面细胞生长、伸展较好，形成连续的细胞单层，细胞形态呈鹅卵石状。GA交联血管支架表面并没有细胞贴附生长，可见一些细胞碎片，说明GA具有很强的细胞毒性，而不同浓度原花青素交联的血管支架表面细胞也生长贴附良好，细胞形态良好，随着交联浓度的增大，形成的细胞单层不连续，而高浓度lOmg/mL交联组血管表面贴附细胞略少。说明原花青素交联血管支架对细胞的生长没有明显的毒性。图8显示脱去细胞的小牛小口径血管(隐静脉)HE染色照片。图9A为各种交联样品与抗凝血孵育60min后3000rpm离心5min后的照片。可以看出，阳性对照全部溶血(溶血率100% )，脱细胞未交联，GA交联，2. 5mg/mL原花青素交联组均没有溶血现象。图9B为根据测定的上清OD值，结果计算得出脱细胞未交联血管(control组,η = 3)的溶血率为0. 49%，而GA和2. 5mg/mL原花青素交联血管的溶血率均稍有下降，分别为0. 25%,0. 35%，溶血率都远低于ISO 10993-4 :2002规定的血液相容性标准最大溶血率5 %。因此，原花青素同戊二醛相当，无溶血现象。图10A为血管内表面血小板粘附的扫描电镜照片，可以看出，脱细胞未交联组(control组)表面粘附较多血小板，呈颗粒状，但并未完全覆盖血管表面，仍可见血管纤维结构；6. 25mg/mL戍二醒交联组血管表面血小板粘附致密,完全覆盖住血管表面；而2. 5mg/mL原花青素交联的血管表面粘附少量血小板，血管纤维状结构清晰可见。图10B显示粘附前后血小板溶液血小板计数(η = 3)定量分析结果，表明脱细胞未交联组血小板粘附率为9. 10%，戊二醛交联组血小板粘附率显著增大，为21. 55%，而原花青素交联组血小板粘附率显著下降，为2. 94%，与脱细胞未交联组有显著性差异，与戊二醛交联组有极显著性差异。可见，原花青素能明显的抑制血小板粘附，从而抑制血栓形成。图11为本发明的原花青素交联制备的脱细胞小口径血管的免疫原性测试结果。人单核细胞经PMA诱导处理48h后可分化为巨噬细胞,经D-Hanks洗去未贴壁巨噬细胞后，得到的细胞为巨噬细胞。巨噬细胞处理16h后通过扫描电镜观察细胞的贴壁状况，巨噬细胞黏附越多则免疫原性越强。从图IlA可以看出脱细胞未交联血管(Control组)与2. 5mg/mL原花青素交联血管表面都有巨噬细胞贴附，形态良好；而戊二醛交联组细胞也有贴附，但细胞呈不规则形态，这进一步说明戊二醛具有细胞毒性。图IlB的细胞个数统计可以看出，三组血管间无差异，对巨噬细胞的吸附效果基本一致，相对于Control组，原花青素交联不会引起强免疫原性。
具体实施方式
本发明包括制备人工小口径血管的方法，该方法包括使用原花青素作为交联剂对脱细胞的哺乳动物小口径血管材料进行交联处理的步骤。在一具体实施例中，本发明的制备方法主要包括脱细胞处理和交联处理步骤。在一具体实施例中，本发明的制备方法包括(I)获得哺乳动物小口径血管材料；(2)对所述小口径血管材料进行脱细胞处理，获得仍保存血管形状的天然胞外基质；和(3)使用原花青素交联所述天然胞外基质。本文中，小口径血管指哺乳动物中内径小于等于6mm的血管。本发明主要采用哺乳动物(优选较大型哺乳动物，例如猪、牛、兔、羊和狗等)的小口径血管制备本发明的人工小口径血管。优选的，使用牛或猪的主动脉；更优选地，使用牛或猪的颈动脉和隐静脉。例如，可取出生48小时左右、体重50±10公斤重、新宰杀的牛颈动脉和隐静脉血管。或者，可取宰杀4小时以内、体重90±30公斤重的猪颈动脉和隐静脉血管。剪取的哺乳动物的小口径血管材料，可放入I 6°C的平衡盐缓冲液D-Hanks液中。用于本发明的D-Hanks溶液的配方如下
权利要求
1.一种人工小口径血管，其特征在于，所述人工小口径血管含有经原花青素交联处理的哺乳动物小口径血管天然胞外基质。
2.如权利要求I所述的人工小口径血管，其特征在于，所述血管还包括内皮细胞和平滑肌细胞。
3.如权利要求I 2中任一项所述的人工小口径血管，其特征在于，所述哺乳动物选自牛、猪、羊、兔和狗。
4.如权利要求I 3中任一项所述的人工小口径血管，其特征在于，所述哺乳动物小口径血管选自哺乳动物的颈动脉和隐静脉血管。
5.如权利要求I 4中任一项所述的人工小口径血管，其特征在于，每厘米所述人工小口径血管含有3 15mg原花青素。
6.如权利要求I 5中任一项所述的人工小口径血管，其特征在于，所述人工小口径血管的最大抗张强度在4 IlMPa的范围之内。
7.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求I 6任一项所述的人工小口径血管和用于保存该血管的溶液。
8.权利要求I所述的人工小口径血管的制备方法，其特征在于，所述方法包括使用D-Hanks液溶解的原花青素作为交联剂对脱细胞的哺乳动物小口径血管材料进行交联处理的步骤。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 (1)获得哺乳动物小口径血管材料； (2)对所述小口径血管材料进行脱细胞处理，获得仍保存血管形状的天然胞外基质；和 (3)使用原花青素交联所述天然胞外基质。
10.如权利要求8 9中任一项所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物小口径血管材料来自新鲜的哺乳动物颈动脉和隐静脉血管。
11.如权利要求8 10中任一项所述的方法，其特征在于，所述脱细胞处理包括 (a)将清洗后的血管浸泡在D-Hanks溶液中； (b)用含有O.20 O. 30%的胰蛋白酶的D-Hanks溶液灌流，然后浸泡在该D-Hanks溶液中，30 40°C下消化； (c)灌流4°C以下的D-Hanks溶液终止消化，清洗； (d)将步骤(c)所得血管浸入包含tritonX-100、脱氧胆酸钠和乙二胺四乙酸二钠溶液的D-Hanks混合溶液中，持续温和摇动，以脱去血管表面和内部的细胞； (e)将步骤(d)所得血管依次浸泡在用D-Hanks液配制的核糖核酸酶溶液和用D-Hanks液配制的脱氧核糖核酸酶溶液中，或者浸泡在含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的混合溶液中，以除去小口径血管内部细胞残余的细胞核成分；和 (f)清洗步骤(e)所得血管，从而实现脱细胞处理。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述脱细胞处理前还包括用I 6°C的D-Hanks溶液清洗清除了脂肪和杂质的血管。
13.如权利要求8 12中任一项所述的方法，其特征在于，所述交联通过以每厘米血管长度I IOmL含O. I 10mg/mL原花青素的D-Hanks溶液浸泡脱细胞的哺乳动物小口径血管材料而实现。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述原花青素的浓度为2.5 5mg/mL，以每厘米血管长度3 5mL的量使用该含花青素的D-Hanks溶液。
15.如权利要求13所述的方法，其特征在于，交联条件为4 40°C下60 360rpm摇动交联I 96小时。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，交联条件为30 40°C，摇动转速为120 180rpm，交联时间为24 72小时。
17.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的D-Hanks混合溶液为含有O. 3 O. 6% triton X-100,0. 3 (λ 6%脱氧胆酸钠和O. 01 O. 05%乙二胺四乙酸二钠的D-Hanks溶液。
18.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述步骤(d)中的核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶的浓度分别为10 30 μ g/mL和100 300 μ g/mL。
19.如权利要求8 18中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括交联后处理，所述后处理是将交联后的完全脱细胞的小口径血管浸入D-Hanks溶液中I 40天。
20.采用权利要求8 19中任一项所述方法制备得到的人工小口径血管。
全文摘要
本发明公开了一种人工小口径血管及其制备方法，包括采用原花青素对血管的天然胞外基质进行交联的步骤。本发明的人工小口径血管力学强度和稳定性提高，无毒，抗体内酶降解，抗钙化，抗血小板黏附，免疫原性低，交联剂和小口径血管本身蛋白质释放极微。这些交联特性使本发明的人工小口径血管在植入体内后，利于人体自身小口径血管平滑肌细胞和血管内皮细胞的移入、增殖、覆盖和长期抗钙化。
文档编号A61L27/38GK102836464SQ201110165428
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者常江, 翟万银, 侯永泰, 吴剑英 申请人:中国科学院上海硅酸盐研究所, 上海利康瑞生物工程有限公司