专利名称：一种抑制炎症反应的小分子多肽及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，更具体地，涉及ー种新的预防和治疗炎症疾病的小分子多肽，所述小肽是源自C型凝集素的多肽。本发明还涉及所述多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。
背景技术：
炎症(inflammation)是具有血管系统的活体组织对损伤因子所发生的防御反应。炎症反应使血液中产生大量的促炎性细胞因子(proinflammatory cytokines),如IL-1，TNF-α，IFN-gamma, IL-6等，刺激内皮细胞、中性粒细胞、单核细胞等活化，合成和分泌蛋白及细胞因子，參与炎症反应的各个阶段，如血管扩张，血管通透性增高，炎症细胞粘 附、迁移及趋化，新生血管形成等过程。在此过程中，白细胞也通过释放蛋白水解酶、大量炎症介质和氧自由基等促进炎症反应，使病情加重，造成组织损伤。眼部葡萄膜炎是ー类临床常见、治疗棘手的免疫原性疾病，可破坏血眼屏障，引起眼内邻近组织的增生，从而导致白内障、黄斑水肿、继发性青光眼以及最終眼内组织损伤，致盲率高，严重影响患者的视觉质量和生活质量。在欧美国家，约有35%的葡萄膜炎患者出现不同程度的视カ损害；国内葡萄膜炎致盲率为18.76%。目前，葡萄膜炎的治疗方法主要是局部或全身使用非留体类消炎药、激素和免疫抑制剂。然而，激素或免疫抑制剂不可避免存在一些严重的毒副作用，如白内障、高眼压、感染以及肾毒性等；而非留体类消炎药局部刺激性强，且药物分子量大，因而眼部屏障的低通透性在一定程度上限制了药物在眼组织局部的有效浓度。C型凝集素(C-type lectins)代表了一类依赖钙离子的凝集素大家族，包括许多细胞内吞受体、蛋白聚糖、所有的胶原凝集素和选择蛋白等。其糖识别域(carbohydrate-recognition domains, CRD)结构，即 C 型凝集素结构域(C-type lectindomain, CTLD)具有高度同源性，由约115-130个氨基酸组成，是C型凝集素的主要功能区域，參与介导各种生物学反应，如细胞间的黏附，凋亡，以及免疫反应等，其中免疫反应包括炎症、肿瘤免疫以及病毒感染的细胞等。研究表明，许多C型凝集素蛋白具有抑制炎症的作用，如血栓调节蛋白(Thrombomodulin, TM)、甘露糖结合蛋白(Mannose-binding protein,MBP)等。在C型凝集素家族中，PAP是ー个分子量为16. 6kDa的胰腺分泌蛋白，由ー个CTLD结构域与氨基末端序列相连接构成。研究证明，PAP在胰腺炎以及胰腺外炎症情况下均具有抑制炎症损伤的作用，通过减少TNF-α和PGE2的合成来抑制巨噬细胞的激活从而达到抑制炎症的作用。在大鼠急性胰腺炎模型中予以抗PAP抗体可加重胰腺的炎症反应；ΡΑΡ对fMLP诱导的肺水肿和血管收缩有抑制作用，并且对中性粒细胞导致的肺损伤具有保护作用。近年来，越来越多的生物制剂通过实验室或临床证实具有抑制眼部炎症的作用，然而，这些生物制剂分子量大，体外合成方法复杂，存在制备过程中重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足；且容易因蛋白构象以及修饰改变而导致生物学活性丧失；由于其分子量大，难以通过血眼屏障，需要经过反复玻璃体腔注射或者转基因等方法发挥抗炎的作用，存在组织损伤等严重并发症的风险。 在开发有效的眼部炎症抑制剂时，应充分考虑到眼科用药的特殊性第一，眼部存在多个解剖性和功能性的屏障。全身给药常常由于血-房水屏障和血-视网膜屏障而无法在眼组织局部达到足够的药物浓度；局部给药，如玻璃体腔注射，大于76. 5kD的大分子在理论上很难穿透视网膜作用于视网膜和脉络膜新生血管。第二，药物在亲水的泪液、房水、玻璃体液中溶解的程度与其有效性呈正相关。第三，基于上述主要原因，眼科用药的生物利用度很低；要使之提高，需加大给药的浓度。但高浓度药物的毒副作用较为明显，全身和局部均无法高剂量给药。第四，目前虽然已经有一系列相对安全的内源性炎症抑制剂被先后证实，如血栓调节蛋白(Thrombomodulin, TM)、膜腺炎相关蛋白(Pancreatitis-associated protein,PAP)、甘露糖结合蛋白(Mannose-binding protein,MBP)等,但由于其分子量较大且空间构象复杂，故在制备过程中存在重组表达纯化工艺繁琐和内毒素残留等不足。因此，本领域迫切需要开发一种适于眼球组织的安全有效的小分子炎症抑制剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种适于眼球组织的安全有效的可抑制眼部炎症的小分子多肽——PAP-16多肽以及其片段、类似物和衍生物。本发明的另一目的是提供含所述多肽的制法和应用。在本发明的第一方面，提供了一种如下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[XaalI]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7](I)式中，XaaO是无，或1_3个氨基酸构成肽段；Xaal是选自下组的氨基酸Tyr、Phe、lie、Asn、Asp或无；Xaa2是选自下组的氨基酸Val、Leu、Thr或Ile ;Xaa3是选自下组的氨基酸Tyr、Trp或Ile ;Xaa4是选自下组的氨基酸IIe、Leu或Trp ;Xaa5是选自下组的氨基酸Ala或Gly ;Xaa6是选自下组的氨基酸Leu或Ile ;Xaa7是选自下组的氨基酸Arg或His ;Xaa8是选自下组的氨基酸Asp或Glu ；Xaa9是选自下组的氨基酸Ala或Pro ；XaalO是选自下组的氨基酸Thr或Ser ；Xaall是选自下组的氨基酸Asn、Gin、Lue或Met ；Xaal2是选自下组的氨基酸Ala或Gly ;Xaal3 是选自下组的氨基酸Ser、Thr、Gl y、Tyr、Ala 或 Gln ;Xaal4是选自下组的氨基酸Glu、Asp、Asn或Gln ；
Xaal5是选自下组的氨基酸Pro或Ala ;Xaa16 是选自下组的氨基酸Asn、Gin、His、Lys 或 Arg ；Xaa17是无，或1-3个氨基酸构成肽段；并且所述的多肽具有抑制炎症的活性，且所述多肽的长度为15-22个氨基酸。在另一优选例中，所述多肽的长度为16-22个氨基酸。在另一优选例中，XaaO和Xaal7为无。
在另一优选例中，XaaO是1_3个氨基酸构成肽段。在另一优选例中，XaaO选自下组S、Y、Q、YS、YQ、SYS、和SYQ ;更佳地，XaaO选自下组S、SY、SYS。在另一优选例中，Xaal7是1_3个氨基酸构成的肽段。在另一优选例中，Xaal7选自下组G、E、R、GG、EG、RG、GEG, GGG、或RGG ;更佳地，Xaal7 选自下组G、GE、GEG。在另一优选例中，所述多肽选自下组(a)具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO 1所示氨基酸序列经过1_5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症功能的由(a)衍生的多肽。在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了 > 70%的SEQ ID NO : I的所示多肽的抑制炎症免疫反应的活性。在另一优选例中，所述的衍生多肽与SEQ ID NO : I的相同性彡80 %，较佳地^ 90% ;更佳地彡95%。本发明还提供了抑制炎症免疫反应的、式I化合物的二聚体和多聚体形式。在本发明的第二方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明第二方面所述的多肽。在本发明的第三方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有(a)本发明第三方面所述多肽或其药学上可接受的盐；(b)药学上可接受的载体或赋形剂。在另一优选例中，所述药物组合物还包括(C)药学上可接受的抗炎药物。在另一优选例中，抗炎药物选自下组地塞米松、甲强龙等留体类抗炎药；阿司匹林、吲哚美辛、水杨酸钠等非留体类抗炎药；环磷酰胺、硫唑嘌呤、霉酚酸酯等免疫抑制剂。在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。在另一优选例中，所述药物组合物为缓释剂型。在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，所述多肽或药学上可接受的盐用于制备抑制炎症或治疗与炎症相关疾病的药物。在另一优选例中，所述的与炎症相关疾病选自下组眼部炎性疾病、胰腺炎、炎症性肠病、肺部炎症、接触性皮炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等。在本发明的第五方面，提供了一种抑制哺乳动物炎症的方法，包括步骤给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。在另一优选例中，所述的对象是人。
在另一优选例中，所述的炎症免疫反应是与葡萄膜炎相关的炎症反应。应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
图I显示了 PAP-16多肽的HPLC分析结果，PAP-16多肽洗脱峰位于11. 637分钟，纯度为96. 65%。图2显示了 PAP-16多肽的质谱分析结果，PAP-16多肽分子量1827，纯度大于95%。图3显示了大鼠EIU临床观察结果。 图3A显示正常对照组大鼠无明显炎症表现。图3B显示LPS组大鼠在LPS注射24小时后出现虹膜血管迂曲扩张、前房闪辉、瞳孔区膜状物、瞳孔膜闭等炎症表现。图3C显示20 μ gPAP-16干预组炎症表现明显减轻，仅见虹膜血管轻度充血，未见渗出。图3D显示大鼠EIU临床评分结果。图4显示大鼠房水炎性细胞浸润定量计数结果。正常对照组大鼠房水无明显炎性细胞浸润；LPS组大鼠房水炎性细胞对照组相比显著增多(P <0.01) JOyg和20 μ gPAP-16干预组与LPS组相比，炎性细胞明显减少(P < O. 01)。图5显示大鼠房水蛋白定量结果。正常对照组大鼠房水仅含有少量蛋白；LPS组大鼠房水蛋白浓度与对照组相比有显著统计学差异；10 μ g和20 μ gPAP-16干预组与LPS组相比，蛋白浓度逐步减少。其中20 μ gPAP-16干预组蛋白浓度与LPS组相比具有统计学差
巳升。图6显示了大鼠眼球组织病理学观察结果。图6A显示正常大鼠眼球组织。图6B显示LPS组可见前房大量噬伊红样无定形物质和炎症细胞浸润，大量白细胞分布于虹膜、睫状体基质内和前、后房；玻璃体腔近视网膜内表面有大量炎症细胞；视网膜增厚，可见炎症细胞浸润。图6C显示20 μ gPAP-16干预组，虹膜及睫状体表面、基质内和玻璃体腔内细胞渗出明显减少，视网膜仅见少量炎症细胞浸润。图7显示了 PAP-16对LPS诱导RAW264. 7细胞促炎症细胞因子和蛋白表达的影响结果。图7A显示各处理组RAW264. 7细胞TNF- α浓度测定结果。空白对照组细胞上清液中仅含有少量的TNF-α (191.00±21.97pg/ml);而LPS组细胞上清液中TNF-a的浓度约为空白对照组的20倍；PAP-16的干预(O. I、I、10 μ M)明显抑制了细胞上清液中TNF-a的表达水平，且抑制作用呈剂量依赖性，10 μ M和I μ M PAP-16干预组与LPS相比差异有统计学意义(P1 < O. 01，P2 < O. 05);而O. I μ M PAP-16干预组与LPS组相比差异无统计学意义(P > O. 05)。
图7B显示各处理组RAW264. 7细胞PGE2浓度测定结果。空白对照组细胞上清液中几乎未测出PGE2 ；LPS组细胞上清液中PGE2的水平明显升高；10 μ MPAP-16的干预明显抑制了细胞上清液中PGE2的表达水平，与LPS相比差异有统计学意义(P <0.01);而0.111皿和I μ M PAP-16干预组与LPS组相比，PGE2的浓度稍有降低，但差异无统计学意义(P > O. 05)。图7C显示各处理组RAW264. 7细胞C0X_2mRNA表达水平检测结果。细胞经药物干预6小时后，LPS组C0X-2mRNA表达水平高于正常对照组，其相对量为10. 68± I. 58，10 μ MPAP-16干预组C0X-2mRNA表达水平明显低于LPS组，其相对量为7. 47±0. 23，差异有统计学意义(P < 0.01)。图7D显示各处理组RAW264. 7细胞iNOS mRNA表达水平检测结果。细胞经药物干预6小时后，LPS组iNOS的mRNA表达水平高于正常对照组，其相对量为10. 23±0. 34，10 μ MPAP-16干预组iNOS的mRNA表达水平明显低于LPS组，其相对量为和3. 72±0. 70，差异有统计学意义(P < O. 01)o图8显示了 PAP-16细胞安全性试验结果。各浓度组PAP-16对细胞相对 增殖率分别为 100. 05±1· 64 %, 101. 66±1· 79 %, 100. 78±1· 55 %,99. 7±1· 20 % 和91. 94±1· 72%。不同浓度组之间两两比较显示PAP-160. I、I、10 μ Μ、100 μ M组之间差异无统计学意义(P > O. 05)，ImM组细胞相对增殖率均低于其他各组，且差异均有统计学意义(P < O. 01)。图9显示了多个候选序列PAP-16、ΡΑΡ_1、ΡΑΡ-2抑制炎症效果。图9Α显示多个候选序列PAP-16、ΡΑΡ-1、PAP-2EIU临床评分结果。图9Β显示多个候选序列ΡΑΡ-16、ΡΑΡ_1、ΡΑΡ-2房水炎性细胞计数结果。图9C显示多个候选序列PAP-16、PAP-I、ΡΑΡ_2房水蛋白定量结果。图10 显示了多个衍生多肽 ΡΑΡ-3、ΡΑΡ-4、ΡΑΡ-5、ΡΑΡ-6、ΡΑΡ-7、ΡΑΡ-8 抑制炎症的效果。图IOA 显示了多个衍生多肽 PAP-3、PAP-4、PAP-5、PAP-6、PAP-7、PAP-8EIU 临床评
分结果。图IOB 显示了多个衍生多肽 PAP-3、PAP-4、PAP-5、PAP-6、PAP-7、PAP-8 房水炎性细胞计数结果。图IOC 显示了多个衍生多肽 PAP-3、PAP-4、PAP-5、PAP-6、PAP-7、PAP-8 房水蛋白
定量结果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次制备了一种源自C型凝集素的具有抑制炎症功能的，分子量仅I. 827KDa的小分子多肽。具体而言，本发明人应用生物信息学的方法，基于同源性分析和生物学特性等分析，选定了数个候选序列，采用固相法将其合成后，再经内毒素诱导大鼠葡萄膜炎模型筛选，获得了一类新型的、具有预防和治疗眼部炎症功能的小分子多妝，即PAP-16。本发明的小肽PAP-16的分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体液中保持较高的浓度；安全性高，对生物组织毒副作用小；眼局部用药生物利用度高，可减少剂量，从而减小全身副作用。在此基础上完成了本发明。
活性多肽在本发明中，术语“本发明多肽”、“PAP-16多肽”、“PAP-16小肽”或“肽PAP-16”可互换使用，都指具有炎症抑制活性的肽PAP-16氨基酸序列YVWIGLHDPTQGTEPN(SEQ ID NO I)的蛋白或多肽。此外，所述术语还包括具有抑制炎症功能的、SEQ ID NO :1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)1_5个(通常为1-4个，较佳地1-3个，更佳地1-2个，最佳地I个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为5个以内，较佳地为3个以内，更佳地为2个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。例如，C型凝集素中SEQ ID NO. 1的相邻上游残基为SYS(人)和SYQ(哺乳动物)，相邻下游残基为GEG (人)，或GGG和RGG (哺乳动物)。本发明还包括PAP-16蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片 段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持抑制炎症功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或
(iii)PAP-16多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的然后蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。一类优选的活性衍生物指与式I的氨基酸序列相比，有至多5个，较佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地I个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表I进行氨基酸替换而产生。表I
权利要求
1.一种下式I表示的多肽，或其药学上可接受的盐[XaaO]-[Xaal]-[Xaa2]-[Xaa3]-[Xaa4]-[Xaa5]-[Xaa6]-[Xaa7]-[Xaa8]-[Xaa9]-[XaalO]-[XaalI]-[Xaal2]-[Xaal3]-[Xaal4]-[Xaal5]-[Xaal6]-[Xaal7](I) 式中， XaaO是无，或1-3个氨基酸构成肽段； Xaal是选自下组的氨基酸Tyr、Phe、Ile、Asn、Asp或无； Xaa2是选自下组的氨基酸Val、Leu、Thr或lie ; Xaa3是选自下组的氨基酸Tyr、Trp或Ile ; Xaa4是选自下组的氨基酸Ile、Leu或Trp ； Xaa5是选自下组的氨基酸Ala或Gly ； Xaa6是选自下组的氨基酸Leu或Ile ; Xaa7是选自下组的氨基酸Arg或His ； Xaa8是选自下组的氨基酸Asp或Glu ； Xaa9是选自下组的氨基酸Ala或Pro ； XaalO是选自下组的氨基酸Thr或Ser ； Xaall是选自下组的氨基酸Asn、Gin、Lue或Met ； Xaa12是选自下组的氨基酸Ala或Gly ； Xaa13是选自下组的氨基酸Ser、Thr> Gly、Tyr> Ala或Gln ； Xaa14是选自下组的氨基酸Glu、Asp、Asn或Gln ； Xaa15是选自下组的氨基酸Pro或Ala ； Xaa16是选自下组的氨基酸Asn、Gin、His、Lys或Arg ； Xaa17是无，或1-3个氨基酸构成肽段； 并且所述的多肽具有抑制炎症的活性，且所述多肽的长度为15-22个氨基酸。
2.如权利要求I所述的多肽，其特征在于，Xaal7是1_3个氨基酸构成的肽段。
3.如权利要求I所述的多肽，其特征在于，XaaO是1_3个氨基酸构成肽段。
4.如权利要求I所述的多肽，其特征在于，所述多肽选自下组 (a)具有SEQID NO : I所示氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO: I所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制炎症功能的由(a)衍生的多肽。
5.一种分离的核酸分子，其特征在于，它编码权利要求I所述的多肽。
6.一种药物组合物，其特征在于，它含有 (a)如权利要求I所述多肽或其药学上可接受的盐； (b)药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为眼药水、针剂、眼用凝胶或眼药膏。
8.权利要求I所述的多肽或药学上可接受的盐的用途，其特征在于，用于制备抑制炎症或治疗与炎症相关疾病的药物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的与炎症相关疾病的选自下组眼部炎性疾病、胰腺炎、炎症性肠病、肺部炎症、接触性皮炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎等。
10.一种抑制哺乳动物炎症的方法，其特征在于，给需要的对象施用本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐。
全文摘要
本发明涉及一种抑制炎症反应的小分子多肽及其应用。具体地，本发明还涉及所述小分子多肽的制法和应用以及含所述多肽的药物组合物。本发明多肽具有多种优点，例如分子量小，可透过各种眼组织屏障；水溶性好，能在中性泪液、房水和玻璃体中保持较高的浓度；合成简单、制备成本低等。
文档编号A61K38/16GK102827253SQ20111016520
公开日2012年12月19日 申请日期2011年6月17日 优先权日2011年6月17日
发明者许迅, 杨晓璐 申请人:上海市第一人民医院