胃癌相关性miRNA标志物及其应用
【专利摘要】胃癌相关性miRNA标志物及其应用，涉及微小RNA。所述胃癌相关性miRNA标志物为miR?632；所述miR?632为成熟miR?632。标志物可在制备三叶因子相关的胃癌诊断工具中应用。诊断工具包括试剂盒、试纸、试剂、芯片、高通量测序平台。利用实时荧光定量PCR实验证明miR?632在正常对照组织和胃癌组织中的表达存在差异，且该差异依赖于三叶因子的表达，因此认为miR?632是诊断三叶因子相关性的胃癌的分子标志物。通过体外培养的细胞实验及小鼠体内实验证明miR?632抑制剂可抑制与胃癌血管生成发生相关的细胞过程，且该过程通过调控三叶因子的表达实现，因此认为miR?632是治疗胃癌的药物靶标。
【专利说明】
胃癌相关性m i RNA标志物及其应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及微小RNA，尤其是涉及胃癌相关性miRNA标志物及其应用。
【背景技术】
[0002] 微小RNA是天然存在于人体内的非编码RNA，长约20~22nt。通常与靶基因 mRNA的 5'端非编码区、3'端非编码区结合，也可与编码区结合，引起靶基因 mRNA降解或抑制蛋白质 翻译，进而发挥功用。
[0003] 三叶因子具有组织表达特异性，胃癌的发生发展及浸润转移密切相关。三叶因子 是一群主要由胃肠道黏液细胞分泌的具有P结构域的小分子多肽，由38~39个氨基酸通过6 个半胱氨酸残基经由3个二硫键相互连接，使整个肽链扭曲、折叠形成三叶状结构，在消化 道复杂的环境中能保持生物活性。
[0004] 研究表明，三叶因子1具有保护胃黏膜、抑制胃癌发生发展的作用，是胃肠道黏膜 保护与胃肠道肿瘤研究领域中的一种重要的小分子多肽。微小RNA能够通过与三叶因子结 合，调控三叶因子的表达，影响胃癌进程。因此，在未来的临床诊断中，监测微小RNA的表达 水平能够给疾病的临床诊断提供参考，成为早期诊断和疾病病程相关的标志物;通过调控 微小RNA及其靶基因的表达，能够为胃癌的诊治提供新策略。
[0005] 参考文献：
[0006] 1.Liu,J.,et al·,miRNA423_5p regulates cell proliferation and invasion by targeting trefoil factor lin gastric cancer celIs.Cancer Lett,2014.347(1): 98-104.
[0007] 2. Shi ,Y.,et al·,miR218_5p regulates the proliferation of gastric cancer cells by targeting TFFlin an Erkl/2-dependent manner.Biochim Biophys Acta,2015.1852(5):970-979.
【发明内容】
[0008] 本发明的目的之一在于提供一种可用于早期诊断胃癌的胃癌相关性miRNA标志 物。
[0009] 本发明的目的之二在于提供所述胃癌相关性miRNA标志物的用途。
[0010] 所述胃癌相关性miRNA标志物为miR-632;所述miR-632为成熟miR-632。
[0011] 所述胃癌相关性miRNA标志物可在制备三叶因子相关的胃癌诊断工具中应用。
[0012] 所述诊断工具包括但不限于试剂盒、试纸、试剂、芯片、高通量测序平台等。
[0013] 所述试剂盒包括但不限于诊断miR-632的引物和/或探针;所述芯片包括但不限于 固相载体、固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括但不限于特异性的 对应于miR-632的部分或全部序列；所述试纸包括但不限于针对诊断miR-632的引物和/或 探针;所述高通量测序平台包括但不限于针对诊断miR-632的引物和/或探针。
[0014] 所述针对诊断miR-632的引物和/或探针还可包括针对现有技术中已经报道的可 以用于检测所述微小RNA表达水平的引物和/或探针。将多种微小RNA的检测引物和/或探针 放置在同一试剂盒中通过检测多种微小RNA指标联合诊断三叶因子相关的胃癌的情况。
[0015] 所述寡核苷酸探针还可包括诊断现有技术中已报道的可用于检测miR-632的表达 水平的寡核苷酸探针。将多种微小RNA的检测探针放置在同一芯片上通过检测多种微小RNA 指标联合诊断三叶因子相关的胃癌的情况。
[0016] 所述固相载体还可包括采用基于芯片领域的各种常规材料，例如但不限于尼龙 膜、经活性基团（如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
[0017] 所述miRNA可选自初微小RNA、前体微小RNA、成熟微小RNA;初始微小RNA能在人体 细胞内被剪切并表达为成熟微小RNA;前体微小RNA能在人体细胞内被剪切并表达为成熟微 小RNA;所述微小RNA为成熟miR-632。
[0018] 所述miRNA包括组成型核酸分子的功能相同的变体，其显示完整微小RNA核酸分子 相同功能，尽管通过核苷酸残基的缺失、置换或者插入而突变。
[0019] 为了保护miRNA的稳定性，可在miRNA的一端或两端增加保护性碱基，如TT，也可以 对miRNA进行化学修饰，甚至合成双链微小RNA。上述修饰不影响miRNA的功能，但会使miRNA 的表达更稳定、作用更持久，能克服体内细胞膜、组织等障碍富集于靶细胞。因此，在不影响 miR-632功能的前提下，可对miR-632进行化学修饰或在序列两端增加碱基所获得的序列。
[0020] 虽然在本发明的某些【具体实施方式】中所使用的是成熟微小RNA，但是本领域技术 人员可以预测，初始微小RNA、前体微小RNA可以获得与成熟微小RNA同样的技术效果，因为 人体细胞有能力进一步将初始微小RNA、前体微小RNA剪切并加工为成熟的微小RNA。
[0021] 本发明的微小RNA核酸分子可以单链或双链的形式存在。成熟微小RNA主要以单链 形式存在，而前体微小RNA是以双链形式存在。本发明的核酸分子可以是RNA、DNA、PNA、LNA 的形式。
[0022]所述微小RNA芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法，例如，如 果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5'端含有氨基酸修饰的聚dT串，可将寡核苷 酸探针配置成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵 列，然后通过放置过夜固定，即可得到本发明的微小RNS芯片。
[0023] 本发明的miR-632是天然的或人工合成的，或者使用可以表达miR-632的DNA片段 的载体转染细胞获得。所述载体包括病毒载体、真核载体。
[0024] 病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺 病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒载体。
[0025] 真核表达载体可以是任何适当的载体，包括但不限于pCMT-Myc表达载体、 pcDNA3.0表达载体、pcDNA6.0表达载体、pEGFP表达载体、Pef Bos表达载体、pTet表达载体、 pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，如pBin438、pCAMBIA1301等。 [0026] 可以表达微小RNA的DNA片段可以通过如下方式获得：从微小RNA数据库中 (http: //microrna · sanger · ac · uk/sequences/)寻找微小RNA在基因组上的位置及具体序 列信息，根据基因组序列确定初始微小RNA位置，在初始微小RNA位置的上下游500-800bp区 间设计特异性引物，扩增引物中间的序列即可获得表达微小RNA的DNA片段。
[0027]药物筛选:在得知了全面所述miR-632与三叶因子相关的胃癌的密切相关性后，可 以基于该特征来筛选促进miR-632表达的物质。之后，可从所述物质中找到对于治疗三叶因 子相关的胃癌真正有用的药物。
[0028]因此，本发明还提供了一种筛选治疗三叶因子相关的胃癌的潜在物质的方法，所 述方法包括：用候选物质处理三叶因子相关的胃癌相关细胞体系，若所述候选物质可促进 前面所述miR-632表达或活性，则表明该候选物质是治疗三叶因子相关的胃癌的潜在物质。 所述细胞体系可以是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系（如动物模型， 优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。优选的，对获得的潜在物质进行进一 步的细胞实验和/或动物实验，以进一步选择和确定对于治疗三叶因子相关的胃癌真正有 用的物质。
[0029]本发明还提供了miR-632在制备三叶因子相关的胃癌的药物及药物组合物中的应 用。
[0030]所述药物组合物包括有效剂量的促进剂。所述促进剂能够促进miR-632的表达、或 能够促进miR-632的活性、或能够促进miR-632的有效作用时间、或能促进miR-632的稳定 性。所述促进剂的靶标不限于miR-632本身，还包括miR-632的上下游，例如:编码miR-632的 基因组序列，miR-632的靶基因、调控miR-632的蛋白或基因。
[0031 ] miR-632促进剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体。
[0032] 所述用于寡核苷酸表达的载体包括病毒载体、真核载体。
[0033] 所述病毒载体可以是任何适当的载体，包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载 体、腺病毒相关病毒载体、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)载体、甲病毒 载体。
[0034] 所述真核表达载体可以是任何适当的载体，包括但不限于pCMT-Myc表达载体、 pcDNA3.0表达载体、pcDNA6.0表达载体、pEGFP表达载体、Pef Bos表达载体、pTet表达载体、 pTRE表达载体、或者在公知表达载体的基础上经改造的载体，如pBin438、pCAMBIA1301等。
[0035] 本发明的治疗三叶因子相关的胃癌的药物还包括药物学上可以接受的载体，所述 载体包括但不限于:稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合 剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载 体等。
[0036] 所述药物可以制成包括但不限于显微注射技术、适于转染的剂型、注射液、片剂、 粉剂、粒剂、胶囊剂。上述各种剂型的药物均可以按照药物学领域的常规方法制备。
[0037] 所述药物可以单独施用;或者与其他能够治疗三叶因子相关的胃癌的药物进行组 合施用。
[0038] 所述药物可以离体施用：将miR-632的表达载体在体外导入或转染人体自身或异 体细胞(或异种细胞），经体外细胞扩增后，输回人体。
[0039]所述药物可以体内施用:将miR-632的表达载体直接导入体内。这种载体可以是病 毒型或非病毒型，甚至是裸DNA或RNA。
[0040] 所述受试者可以是人类或者其他哺乳动物。更具体的，受试者是器官、组织、细胞。
[0041] 本发明使用的"有效剂量"是指可对人体和/或动物产生功能或活性的且可被人 和/或动物所接受的量。本发明所述miR-632有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严 重程度等而变化。优选的有效剂量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定 (例如通过临床试验）。所述因素包括但不限于:所述miR-632促进剂的药代动力学参数例数 生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病严重程度、患者的体重、患者的免疫状 态、给药途径等。
[0042] 分析微小RNA表达谱的方式包括但不限于以下几种:反转录聚合酶链式反应方法 (RT-PCT)、实时荧光定量聚合酶链式反应方法(Real-time PCR)、原位杂交方法（In situ hybridization)、Northern印迹杂交方法(Northern blotting)、核糖核酸酶保护测定方法 (RNase protection assay)、Solexa测序技术（Solexa sequencingtechnology)和生物芯 片。在本发明的【具体实施方式】中，采用了实时荧光定量聚合酶链式反应方法和原位杂交方 法。
[0043] 本发明中使用的"微小RNA"与"miRNA"、"miR"通用。
[0044] 本发明中使用的"诊断三叶因子相关的胃癌"包括对三叶因子相关的胃癌病变的 预判、即判断受试者是否存在患有三叶因子相关的胃癌的风险，也包括对三叶因子相关的 胃癌的诊断，即判断受试者是否存在复发的可能性或者判断受试者已经复发。
[0045] 本发明中使用的"治疗三叶因子相关的胃癌"包括疾病的好转、缓解、治愈。
[0046]本发明使用体外培养的胃癌细胞来研究miR-632对三叶因子相关的胃癌的治疗作 用。
[0047]本发明的优点和有益效果：
[0048] 本发明首次发现了 miR-632与三叶因子相关的胃癌相关，通过检测受试者miR-632 的表达，可以判断受试者是否患有胃癌、或判断受试者是否存在患有胃癌的风险，从而知道 临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0049] 本发明发现了一种新的分子标志物:miR-632,相比传统的检测手段，微小诊断更 具及时性、更具特异性、更具灵敏性，能够实现胃癌的早期诊断，从而降低胃癌的死亡率。
【附图说明】
[0050] 图1显示利用Real-time PCR检测miR-632在胃癌细胞中的表达情况。
[0051 ] 图2显示利用In situ hybridization检测miR-632在胃癌组织中的表达情况。
[0052] 图3显示抑制miR-632表达对胃癌细胞血管形成的影响。
[0053]图4显示抑制miR-632表达对胃癌细胞血管形成的分支点数的影响。
【具体实施方式】
[0054] 下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用 于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员可 以根据本
【发明内容】
对本发明做出一些非本质的改进和调整。
[0055] 下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道 获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学 出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述条件，或按照制造商所建议的条件。 除非另行定义，所使用的所有专业与科学用于与本领域技术人员所熟悉的用意相同。此外， 任何与所记载内容相似或均等的方法及材料均可应用于本发明中。
[0056] 实施例l:Real-time PCR检测miR-632在胃癌组织中的表达情况 [0057] 1.样本收集及制备
[0058] 收集8例胃癌患者，抽取全血4ml，以3000r/min的速度离心10min，收集血浆标本， 为实验组。同时抽取8例健康志愿者的全血4ml，以3000r/min的速度离心10min，收集血浆标 本，为正常对照组。分别将所收集的血浆标本于-80°C冰箱储存待用。
[0059] 2.RNA 提取
[0060] 将上述血浆标本于冰上溶解，用以提取包括mi croRNA在内的总RNA，提取方法根据 miRNeasy Serum/Plasma Kit(QIAGEN;Cat·Νο·217184)说明书进行操作，应用QIAcube全自 动核酸纯化议自动完成microRNA与总RNA的共纯化。将所得RNA于-80°C保存备用。
[0061 ] 3.反转录
[0062] First-strand cDNA合成根据miScriptll RT Kit(QIAGEN;Cat.No.218161)说明 书进行操作，具体操作如下：冰上溶化RNA模板。在室温溶化无 RNase的水、10 X mi Script Nucleics Mix和5XmiScript HiSpec Buffer(15~25°C)。将溶液轻柔混勾，短暂离心将溶 液沉集到试管底，放在冰上待用。在冰上准备反转录反应溶液，各组份配比如表1所示。
[0063] 表 1
[0064]
[0065]将RNA模板加入含反转录反应溶液的试管中。轻轻混匀，短暂离心，然后放在冰上 保存。在37°C反应60min。在95°C反应5min以抑制miScript反转录反应溶液的活性，然后放 在冰上保存。用无 RNase的纯净水稀释cDNA，立即进行实时PCR反应或放入-20 °C冷冻箱中保 存。
[0066] 4.Real-time PCR
[0067] Real-time PCR 反应根据 mi Script SYBR Green PCR Kit(QIAGEN； 〇&七.化.218073)说明书进行操作，具体操作如下：在室温（15~25°〇解冻2\〇皿1^^6(^ SYBR Green PCRMaster Mix、10XmiScript Primer Hs-miR-632(MS00010402)/Hs-RNU6、 cDNA引物及无 RNase-free的水。配制反应混合液，轻柔混勾。各组份配比如表2所示。
[0068] 表 2
[0069]
[0070] 96孔miScript miRNA PCR Array每孔加入体积25yL，轻柔涡旋后，置入荧光定量 PCR仪进行扩增。循环条件如表3所示。
[0071] 表3
[0072]
[0073] 5.结果
[0074] 如图1所示，与健康对照组相比，胃癌患者的血浆中miR-632表达升高。
[0075] 实施例2:Real-time PCR筛选胃癌相关微小RNA与三叶因子相关 [0076] 1.胃上皮细胞培养
[0077]胃上皮细胞株GES-1为贴壁型细胞，用含10%胎牛血清的DMEM培养液培养。调整细 胞浓度为(3~5) X 106/L，接种于培养盘中，培养条件为37°C，5%C02，95%湿度。每天观察细 胞生长状况、跟换培养液，细胞呈单层贴壁生长。
[0078] 2.胃癌细胞培养
[0079] 胃癌细胞株86(：-823、1?^-803、1題-45为贴壁型细胞，均用含10%胎牛血清的 RPMI-1640培养液培养。调整细胞浓度为（3~5) X 106/L，接种于培养盘中，培养条件为37 °C，5 % C02，95 %湿度。每天观察细胞生长状况、跟换培养液，细胞呈单层贴壁生长。
[0080] 胃癌细胞株AGS为贴壁型细胞，均用含10%胎牛血清的Ham's F12K培养液培养。调 整细胞浓度为(3~5)X106/L，接种于培养盘中，培养条件为37°(：，5%0) 2,95%湿度。每天观 察细胞生长状况、跟换培养液，细胞呈单层贴壁生长。
[0081] 3.RNA 提取
[0082]提取包括microRNA在内的总RNA，收集（1~5) X107个培养的胃上皮细胞或胃癌细 胞于1.5ml EP管中，提取方法根据miRNeasy Micro Kit(QIAGEN;Cat.No.217004)说明书进 行操作，应用QIAcube全自动核酸纯化议自动完成microRNA与总RNA的共纯化。将所得RNA 于-80°C保存备用。
[0083] 4.反转录
[0084] 方法如实施例1。
[0085] 5.Real-time PCR
[0086] 方法如实施例1。
[0087] 6.结果
[0088] 如图2所示，在胃上皮细胞和胃癌细胞中，miR-632表达水平均不同。其中在胃上皮 细胞 GES-1 中，miR-632表达水平较高；与之相比，miR-632在 BGC-823、MGC-803、MKN-45 和 AGS 等四株胃癌细胞中表达水平较低。
[0089]实施例3:胃癌细胞血管形成实验检测抑制miR-632表达对胃癌细胞的影响 [0090] 1.胃癌细胞培养 [0091]方法如实施例1。
[0092] 2 .miR-632模拟物转染
[0093] miScript miRNA Inhibitor Anti-has_miR-632(MSY0003302)、miScript miRNA Mimic Syn-has-miR-632(MIN0003302)及其对照均购买于QIAGEN公司。按HiPerFect转染试 剂说明书进行转染：当细胞生长密度达70 %~90 %时，更换10ml新鲜培养液;将miR-632模 拟物及转染试剂加入到基础培养基中，轻轻混匀，室温静置lOmin;将上述混合物滴加到细 胞培养皿中，轻轻摇动使其均匀混合;在细胞培养箱中培养8h后，更换新鲜培养液继续培 养，培养条件37 °C，5 % C02，95 %湿度。24h后，收集胃癌细胞上清液。
[0094] 3.基质胶制备
[0095] 融化matrigel胶，每孔50μ1加至96孔板，不要有气泡;37度孵育30~60min;
[0096] 4.体外血管形成实验
[0097] 消化脐静脉内皮细胞，每孔细胞数约(2~3) X104个;将脐静脉内皮细胞均匀铺至 于96孔板内的matrige 1胶上。将上述收集的胃癌细胞上清液对脐静脉内皮细胞进行培养， 培养条件37°C，5%⑶2，95%湿度。2~8h之内，显微镜观察成像，计数体外血管形行的成环 数及分支点数目。
[0098] 5.结果
[0099] miR-632抑制剂可减少体外血管成环数，如图3所示。
[0100] miR-632抑制剂可减少体外血管形成的分支点数，如图4所示。
[0101]因此，miR-632抑制剂可显著抑制胃癌细胞引起的血管生成能力，进而抑制胃癌的 进展。
【主权项】
1. 胃癌相关性miRNA标志物为miR-632。2. 如权利要求1所述胃癌相关性miRNA标志物，其特征在于所述miR-632为成熟miR-632〇3. 如权利要求1所述胃癌相关性miRNA标志物在制备三叶因子相关的胃癌诊断工具和 治疗药物及药物组合物中应用。4. 如权利要求3所述应用，其特征在于所述诊断工具包括但不限于试剂盒、试纸、试剂、 芯片、高通量测序平台； 所述药物组合物包括有效剂量的促进剂;所述促进剂的祀标不限于miR-632本身，还包 括miR-632的上下游，所述miR-632的上下游包括编码miR-632的基因组序列，miR-632的靶 基因、调控miR-632的蛋白或基因； 所述促进剂包括蛋白、寡核苷酸、小分子化合物、寡核苷酸表达载体； 所述寡核苷酸表达载体包括病毒载体、真核表达载体； 所述病毒载体包括但不限于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、疱疹 病毒载体、甲病毒载体； 所述真核表达载体包括但不限于pCMT-Myc表达载体、pcDNA3.0表达载体、pcDNA6.0表 达载体、pEGFP表达载体、Pef Bos表达载体、pTet表达载体、pTRE表达载体、或在公知表达载 体的基础上经改造的载体； 所述药物包括药物学上可以接受的载体，所述载体包括但不限于:稀释剂、缓冲剂、混 悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、 吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体； 所述药物可以制成包括但不限于显微注射技术、适于转染的剂型、注射液、片剂、粉剂、 粒剂、胶囊剂。5. 如权利要求4所述应用，其特征在于所述试剂盒包括但不限于诊断miR-632的引物 和/或探针;所述芯片包括但不限于固相载体、固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡 核苷酸探针包括但不限于特异性的对应于miR-632的部分或全部序列；所述试纸包括但不 限于针对诊断miR-632的引物和/或探针;所述高通量测序平台包括但不限于针对诊断miR-632 的 引物和 / 或探针。6. 如权利要求5所述应用，其特征在于所述针对诊断miR-632的引物和/或探针还包括 用于检测所述微小RNA表达水平的引物和/或探针、将多种微小RNA的检测引物和/或探针放 置在同一试剂盒。7. 如权利要求5所述应用，其特征在于所述寡核苷酸探针还包括诊断用于检测miR-632 的表达水平的寡核苷酸探针。8. 如权利要求5所述应用，其特征在于所述固相载体还包括采用基于芯片领域的常规 材料，所述常规材料包括但不限于尼龙膜、经活性基团修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、 塑料片;所述活性基团包括醛基、氨基中的一种。9. 如权利要求3所述应用，其特征在于所述miRNA选自初微小RNA、前体微小RNA、成熟微 小 RNA〇10. 如权利要求3所述应用，其特征在于所述miRNA的一端或两端增加保护性碱基、对 miRNA进行化学修饰、合成双链微小RNA。
【文档编号】A61K31/7105GK106086027SQ201610518320
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月3日
【发明人】施颖, 任建林
【申请人】厦门大学