一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA的制作方法

一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA。本发明提供了一种提高水稻种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量的方法，包括如下步骤：抑制水稻中SBEIIb基因的表达；所述SBEIIb基因为编码SBEIIb蛋白的基因。本发明还保护一种提高水稻抗性淀粉含量的方法，包括如下步骤：抑制水稻中所述SBEIIb蛋白的活性。本研究利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑水稻SBEIIb基因，通过造成移码突变，敲除了水稻SBEIIb基因，获得了直链淀粉及抗性淀粉含量明显提高的新一代水稻新种质。
【专利说明】
一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用 sgRNA
技术领域
[0001] 本发明涉及一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专用sgRNA。
【背景技术】
[0002] 淀粉是小麦和水稻籽粒的主要组成部分，根据分子结构的特征，淀粉分为直链淀 粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)。淀粉合成过程受到一系列酶的调控。
[0003] 淀粉分支酶(Starch branching enzyme，SBE)是直接参与淀粉生物合成的关键 酶，它具有双重催化功能:一方面它能切开α_1，4糖苷键连接的葡聚糖链(包括直链淀粉和 支链淀粉的直链区）；另一方面它又能把切下的短链通过α_1，6糖苷键连接于受体链上，该 反应不仅产生分支，而且非还原端可供α-1，4葡聚糖链进一步延伸。SBE的分子量一般在70 ~114kD范围内。根据主要氨基酸序列，高等植物中的SBE主要分为SBE(A)和SBE(B)两大家 族。SBE(A)家族主要包括玉米SBE Ila、玉米SBEIIb、水稻SBEIIb(SBEm)和豌豆SBEKSBE (B)家族主要包括玉米SBEI、水稻SBE I和豌豆SBE II等。
[0004] CRISPR/Cas9系统是继ZFNs和TALENs技术之后出现的基因组定点编辑新技术。与 ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR/Cas9系统对靶位点的识别依赖于核酸之间碱基互补配对， 可对任何紧随PAM(NGG)的20bp的靶点序列进行编辑，且其靶点在基因组中的分布频率很 高，因此对于需要定点编辑的靶基因，更容易找到合适的靶位点。CRISPR/Cas9作为一种新 的靶向基因修饰技术，目前已经应用于水稻、小麦、拟南芥以及本生烟基因的定点修饰研究 中，但尚未有进行重要农作物目标农艺性状进行改良的研究。
[0005] 糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是一种因部分或完全胰岛素缺失、或细胞胰岛素 受体减少、或受体敏感性下降导致的疾病，是由遗传和环境因素共同作用而导致的一种慢 性、全身性的代谢性疾病。糖尿病及其并发症已成为严重危害人类健康的世界性公共卫生 问题，引起了世界各国的高度重视。据国家统计局2004年报告，我国糖尿病患病人数己超过 2000万。另据世界卫生组织预测，到2030年时，我国的糖尿病患者人数有可能翻一倍，达到 4230万，已被列为全球继心血管病、肿瘤之后第3位威胁人类健康的慢性非传染性疾病。糖 尿病引起的血糖的代谢异常往往又引起血脂的代谢紊乱，出现高血脂症。这两种因素可导 致血液黏稠度升高、血流缓慢，而易形成血栓、动脉硬化，造成血管病变，引起多种严重的慢 性系列并发症出现，流行病学证据强烈提示在血糖水平、动脉粥样硬化形成、心血管事件的 发生以及发病率和死亡率增加之间的相关关系。抗性淀粉(resistant starch)又称抗酶解 淀粉及难消化淀粉，主要存在于高直链、低支链淀粉籽粒或块茎中，其含量与高直链淀粉含 量直线正相关。研究表明，抗性淀粉不能在小肠消化吸收和提供葡萄糖，可直接进人大肠被 生理性细菌发酵，产生多种短链脂肪酸(丁酸等)和气体。此外，抗性淀粉还有刺激有益菌群 生长、减少人体热量摄取、控制体重等功能。对小鼠和人类研究中，抗性淀粉可以预防大肠 癌，提高大肠中短链脂肪酸含量。高直链淀粉有助于防止非可逆性胰岛素抵抗的发展，降低 血浆总脂、胆固醇和甘油三酯的浓度。Mantis等研究表明抗性淀粉可以促进餐后的脂质氧 化，长时间食用则可以降低脂肪的累积，帮助控制体重。人体摄入高抗性淀粉食物，具有较 少胰岛素反应，可延缓餐后血糖上升，有效控制糖尿病病情。丁玉琴等人对II型糖尿病大鼠 血糖血脂水平与抗性淀粉的相关性进行研究，表明抗性淀粉能降低型糖尿病大鼠血糖血脂 和尿素氮，提示抗性淀粉具有减轻糖尿病症状的作用并可能有保护肾脏功能的作用。王竹 等研究的抗性淀粉的代谢及对血糖的调节作用，证明抗性淀粉具有吸收慢的代谢特点，对 调节血糖稳态，减低餐后胰岛素分泌，增强胰岛素敏感性有一定作用，并初步论述了抗性淀 粉对餐后体内葡萄糖转运的影响，综合其他研究成果，预示抗性淀粉可能对预防慢性疾病 的发生，减少餐后组织负荷有益。另外，抗性物理特性和普通淀粉基本相同，加入到食品中 不影响食品的质地和口感。因此，抗性淀粉是一种新型的食品添加剂，可作为食品的膳食纤 维功能成分，广泛应用于碳水化合物、脂肪食品、低脂人造奶油等或作为一种单独的添加剂 加入食品配方中，是食用纤维及加工食品的理想材料。1992年，世界粮农组织（FAO)根据 Englyst和和欧洲抗性淀粉研究协作网（EURESTA)的建议，将抗性淀粉定义为:健康者小肠 中不吸收的淀粉及其降解产物。1998年世界粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)联合出版 的《人类营养中的碳水化物》专家论坛一书指出："抗性淀粉的发现和研究，是近年来碳水化 物与健康关系研究中的一项最重要的成果"，高度评价了抗性淀粉对人类健康的重要意义。

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是提供一种通过基因组编辑提高水稻抗性淀粉含量的方法及其专 用sgRNA。
[0007] 本发明提供了一种提高水稻种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量的方法， 包括如下步骤:抑制水稻中SBEIIb基因的表达;所述SBEIIb基因为编码SBEIIb蛋白的基因。
[0008] 所述SBEIIb蛋白为如下(al)或(a2):(al)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组 成的蛋白质；（a2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/ 或添加且具有相同功能的其衍生的蛋白质。
[0009] 所述SBEIIb基因为如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：1)编码区如序列表中序列6所 示的DNA分子;2)序列表中序列4所示的DNA分子;3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列 杂交且编码所述SBEIIb蛋白的DNA分子;4)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具 有75 %、至少具有80 %、至少具有85 %、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少 具有97%、至少具有98%或至少具有99%以上同源性且编码所述SBEIIb蛋白的DNA分子。 [0010] 所述抑制水稻中SBEIIb基因的表达是通过对水稻中SBEIIb基因进行基因编辑实 现的。所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现的。所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA(命名 为sgRNA2)的革E标序列如下：gccttagatgatgaattaag。所述sgRNA2的编码基因如序列表的序 列2中第7155-7257位核苷酸所示。
[0011] 所述抑制水稻中SBEIIb基因的表达是通过在出发水稻中导入含有Cas9蛋白的编 码基因和sgRNA2的编码基因的特异DNA分子实现的。所述抑制水稻中SBElib基因的表达是 通过在出发水稻中导入含有Cas9蛋白的编码基因的DNA分子和含有sgRNA2的编码基因的 DNA分子实现的。所述抑制水稻SBEIIb基因的表达是通过在出发水稻中导入含有所述特异 DNA分子的重组质粒实现的。
[0012] 所述Cas9蛋白的编码基因具体可为序列表的序列2中第386-4516位核苷酸反向互 补的DNA分子。所述sgRNA2的编码基因如序列表的序列2中第7155-7257位核苷酸所示。所述 重组质粒具体可如序列表的序列2所示。
[0013] 所述出发水稻具体可为水稻品种k i taake。
[0014] 本发明还保护一种特异s g R N A ( s g R N A 2 )，其靶标序列如下： 区(^1^383七83七8331^338。所述881?嫩2的编码基因如序列表的序列2中第7155-7257位核苷酸 所示。
[0015] 本发明还保护重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2,含有Cas9蛋白的编码基因和特异 sgRNA的编码基因；特异sgRNA的革E1标序列如下：gccttagatgatgaattaag。所述Cas9蛋白的编 码基因具体可为序列表的序列2中第386-4516位核苷酸反向互补的DNA分子。所述重组质粒 pCXUN-Cas9-gRNA2具体可如序列表的序列2所示。
[0016] 本发明还保护一种提高水稻抗性淀粉含量的方法，包括如下步骤:抑制水稻中所 述SBEIIb蛋白的活性。所述水稻具体可为水稻品种kitaake。
[0017] 本发明还保护一种抑制水稻中SBEIIb基因的表达的方法，包括如下步骤：借助 CRISPR/Cas9系统通过对水稻SBEIIb基因进行基因编辑从而抑制水稻SBEIIb基因的表达。 所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的革E标序列如下:gccttagatgatgaattaag。所述水稻具体可 为水稻品种k i taake。
[0018] 本研究利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑水稻SBEI和SBEIIb基因，通过造成移码突 变，敲除了水稻SBEI和SBEIIb基因，获得了直链淀粉及抗性淀粉含量明显提高的新一代水 稻新种质。获得的SBEIIb定点编辑株系与野生型对照相比，种子的恶白度、直连淀粉及抗性 淀粉含量均明显增加，聚合度DP 6-12之间的短链淀粉减少，而聚合度DP>14的长链淀粉增 加。RVA测定结果表明：其淀粉峰值粘度值，最高粘度值及崩解值均明显下降。a-淀粉酶水解 淀粉后还原糖浓度明显低于野生型对照。
[0019]淀粉是水稻籽粒的主要成分，也是人们食物的主要能量来源。水稻籽粒中淀粉主 要由直链淀粉和支链淀粉组成，其中，支链淀粉含量较高，约占总淀粉含量的75%-80%。直 链淀粉和支链淀粉的比例以及支链淀粉的精细结构决定了水稻籽粒的理化性质、营养品质 和最终产量。抗性淀粉难降解，在体内消化缓慢，吸收和进入血液都较缓慢，其性质类似溶 解性纤维，具有降低血糖功效，可预防高血糖和肥胖症的发生。因此，高直链淀粉农作物新 品种培育对预防高血糖、解决目前糖尿病、肥胖症患者所需低血糖食品缺乏问题，具有重要 意义。本发明可望直接用于生产，以满足糖尿病和肥胖症病人预防和治疗的巨大需求。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例2的步骤二中6株再生植株进行酶切后的电泳图。
[0021] 图2为实施例2的步骤二中6株再生植株进行测序后的结果。
[0022]图3为实施例2的步骤二中Cas9蛋白编码基因/sgRNAl编码基因的鉴定结果。
[0023] 图4为实施例2的步骤四中6株再生植株进行酶切后的电泳图。
[0024] 图5为实施例2的步骤四中6株再生植株进行测序后的结果。
[0025]图6为实施例2的步骤四中Cas9蛋白编码基因/sgRNAl编码基因的鉴定结果。
[0026] 图7为淀粉品质性状分析。
[0027] 图8为直链淀粉及抗性淀粉含量测定。
[0028]图9为淀粉RVA值的测定。
[0029]图10为淀粉链长分布分析。
[0030] 图11为淀粉经水解后还原糖浓度分析。
【具体实施方式】
[0031] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。
[0032] 7义稻品种kitaake，简称水稻kitaake又称Oryza sativa L.subsp.japonicaKitaake。提及"水稻kitaake" 的文献：Kim S L，Choi M，Jung K H，et al.Analysis of the early-flowering mechanisms and generation of T-DNA tagging lines in Kitaake，a model rice cultivar[J].Journal of experimental botany, 2013,64(14):4169-4182.。
[0033] 农杆菌EHA105:普如汀生物技术(北京)有限公司，货号为Biovector610134。
[0034] 实施例1、制备重组质粒
[0035] 人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNAl (环形质粒）。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNAl如 序列表的序列1所示。序列表的序列1中，第109-361位核苷酸与N0S终止子反向互补，第386-4516位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4537-6527位核苷酸与Ubi启动子反向互 补，第6751-7154位核苷酸为U3启动子，第7155-7257位核苷酸为sgRNAl的编码基因（其中第 7155-7174位核苷酸为靶序列识别区）。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNAl表达sgRNAl，sgRNAl的 靶序列位于水稻SBEI基因的第一外显子中。水稻SBEI基因如序列表的序列3所示（基因组 DNA)，序列3中第1875-1958位核苷酸为第一外显子，序列3中第1906-1925位核苷酸为 sgRNAl的靶序列。
[0036] 人工合成重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2(环形质粒）。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2如 序列表的序列2所示。序列表的序列2中，第109-361位核苷酸与N0S终止子反向互补，第386-4516位核苷酸与Cas9蛋白的编码基因反向互补，第4537-6527位核苷酸与Ubi启动子反向互 补，第6751-7154位核苷酸为U3启动子，第7155-7257位核苷酸为sgRNA2的编码基因（其中第 7155-7174位核苷酸为靶序列识别区）。重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2表达sgRNA2，sgRNA2的 靶序列位于水稻SBEIIb基因的第三外显子中。水稻SBEIIb基因如序列表的序列4所示(基因 组DNA)，序列4中第2759-2970位核苷酸为第三外显子，序列4中第2765-2784位核苷酸为 sgRNA2的靶序列。
[0037]实施例2、应用重组质粒制备转基因植物 [0038] 一、转基因植物的获得
[0039] 1、将重组质粒pCXUN-Cas9-gRNAl导入农杆菌EHA105,得到重组农杆菌。
[0040] 2、采用水稻kitaake为出发植物，采用步骤1得到的重组农杆菌，进行农杆菌介导 的遗传转化，得到To代再生植株。
[0041 ]遗传转化的具体步骤如下：
[0042] (1)用AAM培养基重悬步骤1得到的重组农杆菌，得到006(χ)Γ?=0.3-0.5的菌悬液。
[0043] AAM培养基（pH5 · 2): 4 · 3g/L MS salts&vitamins盐+68 · 5g/L鹿糖+0 · 5g/LMES+ 36g/L葡萄糖+500mg/L酪蛋白氨基酸+100ml 10XAA amino acids溶液+40mg/L乙酰丁香 酮。10XAA amino acids溶液:8.76g/L L-谷氨酰胺，2.66g/L L-天（门）冬氨酸，1.74g/L L_精氨酸和75mg/L甘氨酸。
[0044] (2)取水稻kitaake种子，剥去种皮，灭菌洗涤后，均匀点入R1固体培养基上，28°C 光照培养2-3周(诱导愈伤组织形成）。
[0045] R1 固体培养基（pH5.8):4.3g/L MS&Vitamins盐+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+300mg/L 酪蛋白氨基酸+2.8g/L L-脯氨酸+2mg/L 2,4-D+4g/L植物凝胶。
[0046] (3)完成步骤(2)后，取愈伤组织，转移到新的R1固体培养基上，28 °C光照培养3-5 天。
[0047] (4)完成步骤(3)后，取愈伤组织，浸泡于步骤（1)得到的菌悬液中，侵染5分钟，然 后取出并用滤纸吸干表面的菌液。
[0048] (5)完成步骤(4)后，取愈伤组织，转移到R2固体培养基上，25 °C光照培养三天。
[0049] R2固体培养基（pH5.2):4.3g/L MS&Vitamins盐+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+300mg/L 酪蛋白氨基酸+2mg/L 2，4-D+4g/L植物凝胶+20mg/ml乙酰丁香酮。
[0050] (6)完成步骤(5)后，取愈伤组织，转移到筛选培养基甲上，28°C光照培养2周。
[0051]筛选培养基甲：含50mg/L潮霉素的R1固体培养基。
[0052] (7)完成步骤(6)后，取愈伤组织，转移到新的筛选培养基甲上，28°C光照培养2周。 [0053] (8)完成步骤(7)后，取生长良好呈嫩黄色的阳性愈伤组织，转移到筛选培养基乙 上，28°C光照培养至幼苗株高为2至5cm。
[0054] 筛选培养基乙：含50mg/L潮霉素的R4固体培养基。
[0055] R4固体培养基（pH5.8):4.3g/L MS&Vitamins盐+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+2g/L酪 蛋白氨基酸+30g/L山梨醇+2mg/L激动素+lmg/L NAA+4g/L植物凝胶。
[0056] (9)完成步骤(8)后，取幼苗，转移至R5固体培养基上，28 °C光照培养2-3周。
[0057] R5固体培养基（pH5.8):2.15g/L MS&Vitamins盐+15g/L蔗糖+0.5g/L MES+2g/L植 物凝胶。
[0058] (10)完成步骤(9)后，移栽到培养土中，28-30°C光暗交替培养(16h光照/8h黑暗）。
[0059] 二、定点编辑的检测
[0060] 1、对To代再生植株的鉴定
[0061 ] (1)随机取40株步骤一得到的To代再生植株，提取基因组DNA，采用RC11-F和RC11-R 组成的引物对进行 PCR 扩增。RC11 -F: CGCTATAAATCGCCGCC; RC11 -R: GCGGCGAAGAAACCACG。 [0062] (2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶HinPlI进行单酶切。
[0063] (3)取步骤(2)得到的酶切产物，进行电泳。
[0064] (4)取步骤(3)得到的PCR扩增产物，进行测序。
[0065] 提取水稻k i taake的基因组DNA，代替再生植株的基因组DNA进行上述步骤。
[0066]如果再生植株的PCR扩增产物只有一种，且与水稻kitaake的PCR扩增产物的核苷 酸序列一致，该再生植株为野生型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，一种与水稻 kitaake的PCR扩增产物的核苷酸序列一致，另一种与水稻kitaake的PCR扩增产物的核苷酸 序列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换），该再生植株为杂 合型。如果再生植株的PCR扩增产物为两种，均与水稻kitaake的PCR扩增产物的核苷酸序列 相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换），该再生植株为双等位 突变型。如果再生植株的PCR扩增产物为一种，且与水稻kitaake的PCR扩增产物的核苷酸序 列相比发生了突变(突变包括一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换），该再生植株为纯合 突变型。野生型的再生植株的酶切产物电泳显示两条带，杂合型的再生植株的酶切产物电 泳显示三条带，双等位突变型的再生植株和纯合突变型的再生植株显示一条带。
[0067] 40株再生植株中，8株为野生型(20% )，5株为杂合型（12.5% )，11株为双等位突变 型(27.5%)，16株为纯合突变型(40%)。
[0068] 6株再生植株进行酶切后的电泳图见图1。图1中:M: DL2000Marker; 6代表To代植株 SBEI-6、18代表Το代植株SBEI-18、28代表Το代植株SBEI-28、29代表Το代植株SBEI-29、31代 表To代植株SBEI-31、40代表Το代植株SBEI-40;CK代表水稻kitaake，+代表酶切产物，-代表 PCR扩增产物。6株再生植株进行测序后的结果见图2。图2中:wild type代表水稻kitaake; 方框中CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，表示碱基删除。
[0069] (5)取6株再生植株，提取基因组DNA，采用Cas9_F和Cas9_R组成的引物对鉴定Cas9 蛋白的编码基因，采用U3F和U3R组成的引物对鉴定sgRNAl的编码基因。
[0070] Cas9-F：5，-TCGACAAGAAGTACTCCATCGGC-3，；Cas9-R：5 ，-CAAGAGAGAGGGCGATCAGGTTG-3,。
[0071 ] U3F:5 '-AAGGAATCTTTAAACATACGAACAGATC-3 '；U3R:5 '-ACTTTTTCAAGTTGATAACGG-3，。
[0072] 6株再生植株基于靶序列的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9蛋白的编码 基因的情况和携带sgRNAl的编码基因的情况见表1。
[0073] 表 1
[0074]
[0075] 注:i代表插入，i 1代表插入1个核苷酸，依次类推;d代表缺失，dl代表缺失1个核苷 酸，依次类推；当基于靶序列的突变类型为"双等位突变型"时，基于靶序列的基因型"Π / Π "代表的是两个染色体上的靶序列发生了不同的突变，但均为一个核苷酸的插入;当基于 靶序列的突变类型为"纯合突变型"时，基于靶序列的基因型"Π "代表的是两个染色体上的 靶序列发生了完全相同的突变，一个核苷酸的插入;依次类推;Y代表鉴定结果为阳性，N代 表鉴定结果为阴性。
[0076] 2、对1\代植株的鉴定
[0077]取 To 代植株 SBEI-6、To 代植株 SBEI-18、To 代植株 SBEI-28、To 代植株 SBEI-29、To 代植 株SBEI-31、TQ代植株SBEI-40，分别进行自交并收获1\代种子，培育1^代种子获得1^代植株。
[0078]按照步骤1的方法，对各个1\代植株进行鉴定。
[0079] 部分植株的Cas9蛋白的编码基因，sgRNAl的编码基因的鉴定结果见图3(Actin为 内参基因）。图3中，WT代表水稻kitaake，1-23代表不同的1^代植株。
[0080] 各项鉴定的结果见表2。
[0081] 表 2
[0082]
[0083]注:相关符号的含义同表1;24Y代表24株携带，以此类推。
[0084] 结果表明，To代SBEI被定点突变的纯合株系可以稳定遗传1^代，对于定点编辑的 SBEI的双等位突变株系通过严格的自交，1\分离情况符合孟德尔遗传规律，在?\代株系中没 有发现新的变异类型。在Ti代可获得没有Cas9和gRNAl的编辑株系。
[0085] 3、CRISPR/Cas9 的脱靶分析
[0086] 根据网上预测软件(http://crispr .dbcls. jp/)，对可能存在的脱革巴位 点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物:0FRC11-1F1和0FRC11-1R1组 成的引物对，0FRC11-1F2和0FRC11-1R2组成的引物对。
[0087] 0FRC11-1F1:5 '-AGTCAAATAAGGCTTGGAGGAT-3 ' ；0FRC11-1R1 : 5 '-GGGGAAAGCTTCCAAACGAA-3,。
[0088] 0FRC11-1F2:5'-AGCTGCCGAACACAGTATACAA-3' ；0FRC11-1R2 : 5'-TCAGTCCACCCGAGGAGAG-3,。
[0089] (1)取40株步骤一得到的再生植株(即步骤1中的40株植株），提取基因组DNA。
[0090] (2)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，分别采用0FRC11-1F1和0FRC11-1R1组成 的引物对和0FRC11-1F2和0FRC11-1R2组成的引物对进行PCR扩增。
[0091 ] (3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。
[0092]脱靶位点的信息见表3。
[0093] 表 3
[0094]
[0095]结果表明，对于上述3个脱靶位点40株植株均未存在脱靶现象，即gRNAl并不存在 脱靶情况。
[0096]三、转基因植物的获得
[0097] 用重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2代替重组质粒pCXUN-Cas9-gRNAl，按照步骤一进行 操作。
[0098]四、定点编辑的检测 [0099] 1、对To代再生植株的鉴定
[0100] (1)随机取30株步骤三得到的To代再生植株，提取基因组DNA，采用RC33-F和RC33- R组成的引物对进行PCR扩增。
[0101] RC33-F:TTAGTCCATACTAGTTGTCTGCGTG;RC33-R:TCAGCAGCTAATTCTTCAACCACTC。 [0102] (2)取步骤(1)得到的PCR扩增产物，用限制性内切酶Ddel进行单酶切。
[0103] (3)取步骤(2)得到的酶切产物，进行电泳。
[0104] (4)取步骤(3)得到的PCR扩增产物，进行测序。
[0105] 提取水稻k i taake的基因组DNA，代替再生植株的基因组DNA进行上述步骤。
[0106] 30株再生植株中，9株为野生型（30%)，2株为杂合型（6.7%)，11株为双等位突变 型（36.7%)，8株为纯合突变型（26.7%)。
[0107] 6株再生植株进行酶切后的电泳图见图4。图4中:M:DL2000Marker;l代表To代植株 SBEIIb-Ι、3代表Το代植株SBEIIb-3、4代表Το代植株SBEIIb-4、7代表Το代植株SBEIIb-7、9代 表To代植株SBEIIb-9、15代表Το代植株SBEIIb-15; CK代表水稻kitaake，+代表酶切产物，-代 表PCR扩增产物。
[0108] 6株再生植株的部分测序结果见图5。图5中：wild type代表水稻kitaake;方框中 CCG为PAM位点，带下划线序列为靶点序列，表示碱基删除。
[0109] (5)取6株再生植株，提取基因组DNA，采用Cas9-F和Cas9-R组成的引物对鉴定Cas9 蛋白的编码基因，采用U3F和U3R组成的引物对鉴定sgRNA2的编码基因。
[0110] 6株再生植株基于靶序列的基因型、基于靶序列的突变类型、携带Cas9蛋白的编码 基因的情况和携带sgRNA2的编码基因的情况见表4。
[0111] 表4 「01191
[0113] 注:相关符号的含义同表1和表2。
[0114] 2、对1\代植株的鉴定
[0115] 取 To 代植株 SBEIIb-1、To 代植株 SBEIIb-3、To 代植株 SBEIIb-4、To 代植株 SBEIIb-7、 To代植株SBEIIb-9、TQ代植株SBEIIb-15，分别进行自交并收获1^代种子，培育1^代种子获得 Τι代植株。
[0116] 按照步骤1的方法，对各个!\代植株进行鉴定。
[0117] 部分植株的Cas9蛋白的编码基因，sgRNA2的编码基因的鉴定结果见图6(Actin为 内参基因）。图6中，WT代表水稻kitaake，1-23代表不同的1^代植株。
[0118] 各项鉴定的结果见表5。
[0119] 表5
[0120]
[0121] 注:相关符号的含义同表1和表2。
[0122] 结果表明，To代SBEIIb被定点突变的纯合株系可以稳定遗传1\代，对于定点编辑的 SBEIIb的双等位突变株系通过严格的自交，1\分离情况符合孟德尔遗传规律，在1^代株系中 没有发现新的变异类型。在Ti代可获得没有Cas9和gRNA2的编辑株系。
[0123] 3、CRISPR/Cas9 的脱靶分析
[0124] 根据网上预测软件(http://crispr .dbcls . jp/)，对可能存在的脱革巴 位点进行预测，并根据可能存在脱靶位点的侧翼序列设计引物:0FRC33-1F1和0FRC33-1R1 组成的引物对，0FRC33-2F1和0FRC33-2R1组成的引物对。
[0125] 0FRC33-1F1:5-ATGCTTTGGGGAAAGACCCG_3, ;0FRC33-1R1:5-GCGCAAAAGGATTGCGTCA-3,。
[0126] 0FRC33-2F1：5-CGGGAACCATGTAACCGTCA-3，；0FRC33-2R1：5-TACCATTGCAGAGCACCAGG-3'。
[0127] (1)取30株步骤一得到的再生植株(即步骤1中的30株植株），提取基因组DNA。
[0128] (2)以步骤（1)提取的基因组DNA为模板，分别采用0FRC33-1F1和0FRC33-1R1组成 的引物对和0FRC33-2F1和0FRC33-2R1组成的引物对进行PCR扩增。
[0129 ] (3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行测序。
[0130] 脱靶位点的信息见表6。
[0131] 表6
[0132]
[0133] 结果表明，对于上述2个脱靶位点30株植株均未存在脱靶现象，即gRNA2并不存在 脱靶情况。
[0134] 五、性状的检测
[0135] 1、淀粉品质性状分析
[0136] 正常培育To代植株SBEI-6、T〇代植株SBEI-18、T〇代植株SBEI-28、T〇代植株SBEI-29、T〇 代植株 SBEI-31、T〇 代植株 SBEI-40、T〇 代植株 SBEIIb-l、T〇 代植株 SBEIIb-3、T〇 代植株 SBEIIb-4、Το代植株SBEIIb-7、Το代植株SBEIIb-9、Το代植株SBEIIb-15和水稻kitaake(WT)， 收获籽粒。
[0137] 籽粒的外观照片见图7A。籽粒的横切面照片见图7B。籽粒中的淀粉颗粒的电镜扫 描照片见图7(λΤ〇代植株SBEI-18、T〇代植株SBEI-28、T〇代植株SBEI-29、T〇代植株SBEI-31、T〇 代植株SBEI-40的各个表型均与To代植株SBEI-6相同。To代植株SBEIIb-3、T〇代植株SBEIIb- 4、T〇代植株SBEIIb-7、T〇代植株SBEIIb-9、T〇代植株SBEIIb-15的各个表型均与Το代植株 SBEIIb-Ι相同。各个植株的籽粒的外观没有明显差别。与水稻kitaake的淀粉粒相比，定点 突变SBEI基因的植株的淀粉颗粒呈不规则排列圆形，定点突变的SBEIIb基因的植株的淀粉 颗粒变小并且淀粉颗粒表面表现粗糙。
[0138] 2、直链淀粉及抗性淀粉含量测定
[0139] 正常培育To代植株SBEI-6、T〇代植株SBEI-18、T〇代植株SBEI-28、T〇代植株SBEI-29、T〇 代植株 SBEI-31、T〇 代植株 SBEI-40、T〇 代植株 SBEIIb-l、T〇 代植株 SBEIIb-3、T〇 代植株 SBEIIb-4、Το 代植株 SBEIIb-7、Το 代植株 SBEIIb-9、Το 代植株 SBEIIb-15 和水稻 ki taake (WT)， 收获籽粒，脱壳，磨粉，得到待测面粉。
[0140]检测待测面粉中总淀粉的质量百分含量（采用Megazyme公司的Total Starch Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-TSTA)。结果见图8A。各个待测植株种子制备 的待测面粉的总淀粉含量没有显著差异。
[0141]检测待测面粉中直链淀粉和支链淀粉的质量百分含量（采用Megazyme公司的 Amylose/Amylopectin Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-AMYL)，计算直链淀 粉与支链淀粉的质量比。直链淀粉的质量百分含量见图8B。直链淀粉与支链淀粉的质量比 见图8C。结果表明：SBEIIb基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的直链淀粉含量 显著高于水稻kitaake，SBEI基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的直链淀粉含 量与水稻kitaake没有显著差异;SBEIIb基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的 直链淀粉与支链淀粉比值显著高于水稻kitaake，SBEI基因被定点敲除的植株的种子制备 的待测面粉的直链淀粉与支链淀粉比值与水稻kitaake没有显著差异。
[0142]检测待测面粉中抗性淀粉的质量百分含量（采用Megazyme公司的Resistant Starch Assay Kit并按说明书进行检测，试剂盒货号K-RSTAR)。结果见图8D。水稻kitaake 种子制备的待测面粉的抗性淀粉含量几乎为〇，SBEI基因被定点敲除的植株的种子制备的 待测面粉的抗性淀粉含量几乎为〇，SBEIIb基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉 的抗性淀粉含量在5 % -9 %之间。
[0143] 结果表明，SBEIIb基因的沉默，可明显提高直链淀粉和抗性淀粉的含量。
[0144] 3、淀粉RVA值的测定
[0145] 正常培育To代植株SBEI-6、T〇代植株SBEI-18、T〇代植株SBEI-28、T〇代植株SBEI-29、T〇 代植株 SBEI-31、T〇 代植株 SBEI-40、T〇 代植株 SBEIIb-l、T〇 代植株 SBEIIb-3、T〇 代植株 SBEIIb-4、Το 代植株 SBEIIb-7、Το 代植株 SBEIIb-9、Το 代植株 SBEIIb-15 和水稻 ki taake (WT)， 收获籽粒，脱壳，磨粉，得到待测面粉。采用配套软件为TCW(Thermal Cycle for Windows) 的3D型黏度速测仪(澳大利亚NewportScientific仪器公司）检测待测面粉的淀粉黏滞性谱 (RVA谱）。
[0146] 结果见图9。结果表明，SBEI基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的淀粉 峰值粘度值、最高粘度值及崩解值均与水稻kitaake没有显著差异，SBEIIb基因被定点敲除 的植株的种子制备的待测面粉的淀粉峰值粘度值、最高粘度值及崩解值显著低于水稻 kitaake。
[0147] 4、淀粉链长分布分析
[0148] 正常培育To代植株SBEI-6、T〇代植株SBEI-18、T〇代植株SBEI-28、T〇代植株SBEI-29、T〇 代植株 SBEI-31、T〇 代植株 SBEI-40、T〇 代植株 SBEIIb-l、T〇 代植株 SBEIIb-3、T〇 代植株 SBEIIb-4、Το代植株SBEIIb-7、Το代植株SBEIIb-9、Το代植株SBEIIb-15和水稻kitaake(WT)， 收获籽粒，脱壳，磨粉，得到待测面粉。利用美国Dionex Co公司生产的BioLC分析仪器检测 待测面粉的支链淀粉链长聚合度平均值进行比较分析。相对链长分布=转基因植株的种子 制备的待测面粉中支链淀粉的链长分布-水稻ki taake种子制备的待测面粉中支链淀粉的 链长分布。
[0149] 链长分布的结果见图10A，相对链长分布的结果见图10B。结果表明：与水稻 kitaake相比，SBEI基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉中聚合度DP 6-12之间短 链淀粉增加，聚合度DP> 14的长链淀粉减少;与水稻ki taake相比，SBEIIb基因被定点敲除的 植株的种子制备的待测面粉中，聚合度DP 6-12之间的短链淀粉减少，而聚合度DP>14的长 链淀粉增加。
[0150] 5、淀粉经水解后还原糖浓度分析
[0151] 正常培育Το代植株SBEI-6、T〇代植株SBEI-18、T〇代植株SBEI-28、T〇代植株SBEIIb-1、To代植株SBEIIb-3、To代植株SBEIIb-4和水稻ki taake (WT)，收获籽粒，脱壳，磨粉，得到待 测面粉。将50mg待测面粉溶解于4ml乙酸钠缓冲液，得到待测溶液。采用a-淀粉酶法检测待 测溶液中的还原糖浓度。
[0152] 结果见图11。结果表明，SBEIIb基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的 还原糖含量明显低于水稻kitaake，SBEI基因被定点敲除的植株的种子制备的待测面粉的 还原糖含量与水稻kitaake无显著差异。
[0153] 6、定点编辑植株其它农艺性状分析
[0154] 正常培育Το代植株SBEI-6、To代植株SBEI-18、To代植株SBEI-28、To代植株SBEIIb-1、To代植株SBEIIb-3、Το代植株SBEIIb-4和水稻ki taake (WT)，统计农艺性状，结果见表7。定 点突变SBEI基因和SBEIIb基因均对植株的有效分蘖、株高等农艺性状没有影响。
[0155] 表7
[0156]

【主权项】
1. 一种提高水稻种子中的抗性淀粉含量和/或直链淀粉含量的方法，包括如下步骤:抑 制水稻中SBEIIb基因的表达;所述SBEIIb基因为编码SBEIIb蛋白的基因。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述SBE lib蛋白为如下(al)或(a2): (al)由序列表中序列5所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (a2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有相同功能的其衍生的蛋白质。3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述SBEIIb基因为如下1)或2)或3)或4)的 DNA分子： 1) 编码区如序列表中序列6所示的DNA分子； 2) 序列表中序列4所示的DNA分子； 3) 在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述SBEIIb蛋白的DNA分子； 4) 与1)或2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90 %、至少具有95 %、至少具有96 %、至少具有97 %、至少具有98 %或至少具 有99%以上同源性且编码所述SBEIIb蛋白的DNA分子。4. 如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述抑制水稻中SBEIIb基因的表 达是通过对水稻中SBE lib基因进行基因编辑实现的。5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于:所述基因编辑是借助CRISPR/Cas9系统实现 的。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列 如下：gccttagatgatgaattaag。 7 ·特异sgRNA，其革 E 标序列如下：gccttagatgatgaattaag。8. 重组质粒pCXUN-Cas9-gRNA2，含有Cas9蛋白的编码基因和特异sgRNA的编码基因；所 述特异sgRNA的革E标序列如下：gccttagatgatgaattaag。9. 一种提高水稻抗性淀粉含量的方法，包括如下步骤:抑制水稻中SBEIIb蛋白的活性。10. -种抑制水稻中SBEIIb基因的表达的方法，包括如下步骤:借助CRISPR/Cas9系统 通过对水稻中SBE II b基因进行基因编辑从而抑制水稻中SBE II b基因的表达;所述SBE II b基 因为编码SBEIIb蛋白的基因。
【文档编号】A01H5/00GK106086028SQ201610705816
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月23日
【发明人】夏兰琴, 孙永伟
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所