一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物技术领域，具体涉及一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法。
【背景技术】
[0002]线粒体是细胞内一个重要的细胞器，其基因组DNA呈共价闭合环状，具有自主复制、转录和翻译能力。线粒体全基因组一般由13个蛋白质基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)共37个编码基因及一段非编码区(控制区)组成。与核DNA相比，线粒体基因组DNA具有母系遗传，拷贝数多，重组率低，进化速度较快等优点，已经作为动物的群体遗传学，系统发生学及保护生物学等研究领域的一种有效工具。如线粒体上一些基因(如CO1、CytBUes rRNA等)可作为重要的遗传分子标记应用于物种分类鉴定研究。线粒体基因组全序列信息(基因组结构组成和基因排列方式等)为动物分子系统发生提供最有利的证据。因此，对动物线粒体基因组结构的研究十分重要和必要。
[0003]蜘蛛是一类捕食性的节肢动物，主要捕食昆虫，它们在农田害虫的生物防治、维护生态系统的平衡中起着非常重要的作用。注意保护天敌种库，促进天敌群落重建，能有效的控制诸多农业害虫，诸如飞虱、叶蝉、螟虫、棉蚜等的发生和危害。与同属于节肢动物的昆虫相比，对蜘蛛的线粒体全基因组的研究大幅落后。目前仅测序完成13种蜘蛛的线粒体全基因，而蜘蛛种类繁多，还有极大部分的种类线粒体全基因组测序工作未完成。因此，设计蜘蛛线粒体全基因组序列扩增的通用引物和扩增方法尤为重要，在蜘蛛的保护利用，进化分析和遗传标记选择方面起着重要的作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物及扩增方法。
[0005]本发明所述的蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物，由6对单链寡聚核苷酸组成，6对通用引物的名称及序列如下:
第一对引物:
正向引物 I 如 SEQ ID NO:1 所示:5' - AGCTAATAAAGCTAATGAGTTCATA -3';
反向引物 I 如 SEQ ID NO:2 所示:5' - TAATTAATTTAAGAGACTAACACCT -3'；
第二对引物:
正向引物 2 如 SEQ ID NO:3 所示:5, - AATGTTCTGAAATTTGTGGTG -3';
反向引物 2 如 SEQ ID NO:4 所示:5, - CATACTACATCTACAAAATGTCA -3'；
第三对引物:
正向引物 3 如 SEQ ID NO:5 所示:5' - TGACATTTTGTAGATGTAGTATG -3';
反向引物 3 如 SEQ ID NO:6 所示:5, - AAGCTCATGTAGAAGCTCC -3'；
第四对引物: 正向引物 4 如 SEQ ID NO:7 所示:5' - GGAGCTTCTACATGAGCTT -3';
反向引物 4 如 SEQ ID NO:8 所示:5' - GAATTAGTATCAGGATTTAATGT -3'；
第五对引物:
正向引物 5 如 SEQ ID NO:9 所示:5, - ACATTAAATCCTGATACTAATTC -3';
反向引物 5 如 SEQ ID NO: 10 所示:5, - TGCTAAGGTAGCATAATCATT -3'；
第六对引物:
正向引物 6 如 SEQ ID NO: 11 所示:5, - AATGATTATGCTACCTTAGCA -3';
反向引物 6 如 SEQ ID NO: 12 所示:5, - TATGAACCCATTAGCTT -3'。
[0006]利用上述6对蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物，经PCR扩增，测序及拼接可得到蜘蛛线粒体基因组全序列信息，具体技术方案包括以下步骤:
(I) DNA抽提试剂盒提取农田蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。
[0007](2)利用上述的六对引物，以抽提好的蜘蛛基因组为模板，进行PCR扩增(结果见图 1)PCR 反应体系为 25 μ 1，其中:2μ1 模板 DNA (约 20ng)，2.5 μ I 10XLA PCR buffer,1μ I 10 mM dNTPs，各1μ I 10 mM正、反向引物，0.3 μ I 5U/μ I LATaq酶，加去离子水调至终体积25 μ I ；PCR反应条件如下:95° C预变性5分钟；92° C变性10秒，48° C退火10秒，68° C延伸3分钟，20个循环；92° C变性10秒，50° C退火10秒，68° C延伸3分钟，20个循环，每循环时间增加20s ；72° C再延伸10分钟。
[0008](3) PCR扩增产物凝胶电泳，均得到大小在1.0-4.0 kb之间的片段，割胶回收测序及与GenBank上同源序列的比对，证实为线粒体基因组序列片段的特异扩增产物。各序列经DNAMAN软件拼接后即可得线粒体基因组全序列。
[0009]作为优选，本发明所述的扩增方法中，其中步骤(I)所述的蜘蛛种类包括但不限于下述10种蜘蛛种类:拟水狼蛛(Pira ta subpira ticus),三突花蛛(Ebrech tellatricuspi0? )，横纹金蛛(Arg1pe bruennichi)，HI Il复宵虫?! ( 7? tragna tha maxillosa)，华 I? 肖蛾(Tetragnatha nitens),茶色新圆蛛(Afe1scima theisi)^ 脉娲蛛(Wadicosa
黑色妮虎paykulli),大腹园蛛(Araflew1S猫跳蛛
(Carrhotus xanthogramma)。
[0010]本发明的优点是:
1.本发明提供的蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物，可以高效和特异地扩增多种蜘蛛的线粒体基因组全序列，能应用于蜘蛛不同分类阶元系统进化和分类研究；
2.本发明提供的蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物，引物对数量少，省时省力，且节约试剂成本。
【附图说明】
[0011]图1为蜘蛛线粒体基因组全序列扩增引物扩增不同蜘蛛线粒体全序列的琼脂糖凝胶电泳图谱。
[0012]其中，A-J分别为拟水狼蛛，三突花蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛸，华丽肖蛸，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛、猫跳蛛…及1-6泳道依次为DNA分子量标准(Mark IV)及引物对1-6的扩增结果。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:
(I)蜘蛛样品的采集，鉴定及保存
实施例中所用蜘蛛种类均用陷阱法采自浙江省余姚市或桐乡县农田。所采标本带回实验室进行信息登记，均用体视显微镜鉴定，以确定种类。种类鉴定好的蜘蛛样品用100%的酒精浸泡并保存于4° C冰箱备用。所采集的蜘蛛种类包括:拟水狼蛛，三花突蛛，横纹金蛛，锥腹肖蛾，华丽肖蛾，茶色新圆蛛、脉娲蛛、黑色蝇虎，大腹园蛛、猫跳蛛。
[0014](2)蜘蛛基因组总DNA的提取
采用DNA抽提试剂盒提取不同种类蜘蛛的总基因组DNA。为避免污染，舍去头腹部，只从腿部提取DNA。DNA提取直接利用DNA抽提试剂盒(天根生化科技有限公司)提取。提取的总基因组-20° C保存备用。
[0015](3)蜘蛛线粒体基因组全序列的通用扩增引物的设计和合成
登陆NCBI网站中的GenBank数据库收索已公布的蜘蛛全线粒体基因组序列，经ClustalW软件同源比对,找出相对保