鱼类线粒体全基因组dna扩增的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及遗传学和分子生物学领域，具体地涉及鱼类线粒体基因组DNA扩增的 引物对以及扩增方法。
【背景技术】
[0002] 鱼类线粒体基因组（mtDNA)是细胞质中具自主复制、转录和翻译能力的闭合环状 双链DNA，包括一条重链和一条轻链。鱼类线粒体基因组主要包括37个编码基因（13个疏 水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因）、1个负责复制和转录起始的控制区（D-Ioop) 和1个轻链复制起始区。疏水蛋白基因编码的多肽包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体 的亚单位：细胞色素 b(Cyt b)、2个ATP合成酶的亚单位（ATPase6和ATPase8)、3个细胞色 素 c (Cyt c)氧化酶的亚单位（C0X1、C0X2和C0X3)和7个氢化辅酶I (NADH)脱氢酶的亚单 位（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5 和 ND6)。2 个 rRNA 基因为 12SrRNA 和 16SrRNA 基因。22 个 tRNA 基因编码的氨基酸为：Pro、Thr、Glu、Leu、Ser、His、Arg、Gly、Lys、Asp、Ser、Tyr、 Cys、Asn、Ala、Trp、Met、lie、Glu、Leu、Val 和 Phe〇
[0003] 同核基因组相比，mtDNA上的基因排列极其紧凑，且无内含子，编码效率较高。线 粒体基因组能以自身为模板进行复制，能转录生成信使RNA (mRNA)、转运RNA (tNA)和核糖 体RNA (rRNA)，也能编码合成一些维持自身结构和功能所必需的蛋白质，具有很大的独立 性。同时，线粒体的遗传行为受到核基因的调控，这种调控主要是通过向线粒体输入核DNA 编码蛋白质和一些小的RNA，特别是tRNA来实现的。
[0004] 鱼类线粒体中蛋白序列极为保守，几乎完全一样。如上所述的37个编码基因（13 个疏水蛋白基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因），在鱼类中非常保守。但是这些蛋白所对 应的核酸序列具有较高的突变率。同样，非编码基因区的保守性也非常低。大量研宄表明 线粒体DNA突变频率较核基因组高10倍以上。
[0005] 线粒体基因组是一种位于核外的胞质遗传系统，几乎仅遵从母系遗传，一般不发 生重组，父本线粒体在受精过程中被迅速降解或此后不久在复制时被丢失了。线粒体基因 组有相对恒定的进化速率，因此在种内水平及种间水平的分子生态学特别是分子系统地理 学的研宄中，是广泛应用的主流分子标记。另外，线粒体基因组还是进行物种鉴定的重要资 源。通过扩增获得未知物种的线粒体基因组，并与其他物种已有序列比对，可以了解该物种 所属。
[0006] 目前已经公开有针对鱼类线粒体部分区域的扩增方法，比如，针对线粒体COI序 列的通用引物和扩增方法，和D-Ioop区域扩增引物及其设计方法。但是这些方法仅能获得 鱼类线粒体基因组较短片段。
[0007] 目前常用的鱼类线粒体DNA的一种扩增方法，是利用近源物种的mtDNA序列设计 引物。该方法成功率较高，但是依赖于近源物种的mtDNA信息。
[0008] 另一种常用的鱼类线粒体DNA扩增方法，是利用二代测序技术方法测序后组装。 在提取核DNA和mtDNA后，对全基因组序列进行高通量测序并进行组装。这种方法不依赖 于近源物种的mtDNA信息，对于未知物种的mtDNA比较有效。但是这种方法要求有高深度 的基因组测序，成本高；同时，对全基因组组装技术要求较高；测序和组装结果主要是核基 因组DNA。
[0009] 考虑到扩增鱼类全长线粒体基因组的重要性，有必要开发一种全新的获得鱼类线 粒体基因组的方法。
【发明内容】
[0010] 为克服上述技术缺陷，本发明的一个目的是提供了一种用于鱼类线粒体全基因组 序列扩增的引物对。
[0011] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0012] 本发明的一个方面，提供了用于扩增鱼类线粒体全基因组DNA的引物对，所述引 物对包括以下1)~4)中的至少一对引物，优选含有1)~4)中的所有4对引物：
[0013] 1)为序列表中的序列1和序列2所示的核苷酸序列；
[0014] 2)为序列表中的序列3和序列4所示的核苷酸序列；
[0015] 3)为序列表中的序列5和序列6所示的核苷酸序列；
[0016] 4)为序列表中的序列7和序列8所示的核苷酸序列。
[0017] 本发明的另一个目的是提供了利用上述引物对来进行扩增鱼类线粒体全基因组 DNA的方法。
[0018] 本发明的一个优选方面，所述的扩增方法包括以鱼类DNA为模板，进行PCR扩增。
[0019] 进一步地，所述PCR扩增时，各引物对的退火温度为48~60 °C，优选为56°C和 58。。。
[0020] 本发明还提供了含有上述引物对的制剂。
[0021] 本发明还提供了含有上述的引物对的试剂盒。
[0022] 进一步地，所述试剂盒用于鱼类线粒体全基因组DNA的扩增。
[0023] 本发明提供的鱼类线粒体全基因组DNA扩增的简并性引物组合，适用于鱼类线粒 体基因组的扩增，该引物对数适中，可以避免引物对数少对DNA模板的高要求，也可简化后 续的PCR和纯化操作步骤。本发明进一步提供的鱼类线粒体全基因组DNA扩增方法，扩增 长度适中，对Taq酶的要求不高，主流的Taq酶都可用于扩增。该方法可以检测线粒体所有 基因，能够应用于鱼类基因组进化研宄、物种分类、线粒体基因突变以及鱼类物种鉴定。
[0024] 此外，通过本发明提供的方法得到的扩增产物经过纯化回收、测序后，将为鱼类的 种内水平及种间水平的分子生态学、分子系统地理学的研宄、鱼种的保种工作以及种群遗 传多样性的保护具有非常重要的意义。
【附图说明】
[0025] 图1为按照本发明方法得到的企鹅灯mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右 依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的 条带，引物4)扩增结果的条带；
[0026] 图2按照本发明方法得到的硬头鳟mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依 次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条 带，引物4)扩增结果的条带。
[0027] 图3为按照本发明方法得到的虹鳟mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依 次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条 带，引物4)扩增结果的条带；
[0028] 图4为按照本发明方法得到的鲫鱼mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依 次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条 带，引物4)扩增结果的条带；
[0029] 图5为按照本发明方法得到的金鳟鱼mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右 依次是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的 条带，引物4)扩增结果的条带；
[0030] 图6为按照本发明方法得到的鲤鱼mtDNA扩增产物凝胶电泳图；其中，从左到右依 次