是分子标记物，引物1)扩增结果的条带，引物2)扩增结果的条带，引物3)扩增结果的条 带，引物4)扩增结果的条带。
【具体实施方式】
[0031] 以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本 发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
[0032] 本发明基于发现而合成了能够扩增出线粒体全基因组碱基的4对兼并性PCR引 物：
[0033] (1)鱼类mtDNA在部分区域在核酸序列上高度保守，这些区域在不同物种中可能 仅有几个碱基的差异。因此可以通过设计兼并性引物，优化引物组合和扩增条件，获得这些 保守区域。（2)这些高度保守区域是分散在mtDNA的不同位置，而且扩增长度不一。通过筛 选保留尽可能长的扩增区域，能够在减少引物对数的情况下获得鱼类的全长mtDNA序列。 ⑶选用引物对数适中，可以避免引物对数少对DNA模板的高要求，也可以避免引物对数多 导致操作步骤繁琐。
[0034] 本发明所涉及的这4对PCR引物经实验证明，能够对线粒体全基因组进行特异性 扩增。
[0035] 这4对引物见表1:
[0036] 表14对简并性引物组合
[0037]
[0038] 其中，N 代表 A、T、C、G
[0039] 这4对通用引物的PCR体系以及预扩增长度如表2。
[0040] 表2 4对PCR引物扩增条件
[0041]
[0042] 由于不同鱼类线粒体长度不一，因此预期长度也不一样。
[0043] 选用上述线粒体全基因组测序用4对PCR引物，将上下游引物稀释成10 ymol/L， 作为工作液。
[0044] PCR反应体系：体系总体积为20 μ L，其中含DNA模板1 μ L(含至少50ng全基因组 0嫩)，目的片段的相应上下游引物（1(^111〇1/1)各0.5以1^，2\了&9酶反应混合液1(^1^(反 应混合液包括0. lU/yL Taq酶，2XPCR反应缓冲液，3mmol/L MgC12,和 0. 4mmol/L dNTP)， ddH20 8 μ I 〇
[0045] 引物的PCR扩增基础参数为：94°C变性45s，根据PCR引物不同确定退火温度进行 30s，72°C延伸3~5分钟，共计36个循环（表2列出的PCR扩增条件）。
[0046] 下面通过【具体实施方式】结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0047] 实施例1 :
[0048] 本发明线粒体全基因组测序用PCR引物对见表1。
[0049] PCR扩增过程为：
[0050] 线粒体全基因组测序选用上述包含了 A、T、C、G所有组合的4对PCR引物，将上下 游引物稀释成10 μ mol/L，作为工作液。PCR反应体系：体系总体积为20 μ L，其中含DNA模 板I UL(含至少50ng全基因组DNA)，目的片段的相应上下游引物（10μπιο1/υ各0· 5yL， 2 X Taq酶反应混合液10 μ L (反应混合液包括0· IU/ μ L LA-Taq酶，2 X PCR反应缓冲液， 3mmol/L MgC12,和 0· 4mmol/L dNTP)，ddH20 8 μ 1。
[0051] 其中，上述DNA模板分别是企鹅灯、硬头鳟、虹鳟、鲫鱼、金鳟鱼和鲤鱼的基因组 DNA，提取线粒体DNA的方法参见常规操作说明书。
[0052] 本实验PCR反应所用试剂均为通用试剂，PCR产物的检测采用常规的方法。在本 实验中，PCR扩增参数见表3。
[0053] 表3实施例的PCR扩增条件 [0054；
[0055] 上述几种鱼类的PCR扩增产物大小采用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结果 见图1~图6，从图中可见，使用本发明提供的引物对对6种鱼类进行扩增，能确保PCR扩增 成功，并且每种引物扩增的单一性非常好，特异性也非常好，并且长度符合预期扩增长度。
[0056] 实施例2
[0057] 为验证扩增结果是否正确，我们挑选企鹅灯和硬头鳟的扩增产物分别进行测序。 我们将PCR扩增产物进行纯化回收，并进行Sanger测序。对企鹅灯的4段测序结果进行拼 接组装以获得完整线粒体基因组序列，其序列见序列表中的序列9所示。硬头鳟线粒体基 因组序列组装也如上操作，其序列见序列表中的序列10所示。
[0058] 企鹅灯线粒体全基因组序列长度为16524bp，与大部分鱼类线粒体基因组长度区 间一致。该序列为第一次公开的企鹅灯线粒体全基因组序列。同源序列比对发现，该序列 最相似的序列为盲鱼（Astyanax mexicanus)线粒体，序列相似性为80%，提示我们企鶴灯 与墨西哥脂鲤之间的物种近缘关系。
[0059] 硬头鳟线粒体全基因组序列长度为16653bp。硬头鳟为洄游型虹鳟鱼，是其一个 亚种。将测序得到的序列与参考序列（16656bp)比对，长度仅相差3个碱基，覆盖度达到 100%，共检测到33个差异位点，具体的差异位点结果见表4。
[0060] 表4.硬头鳟线粒体基因组与虹鳟线粒体基因组差异位点
[0061]
[0063] 从表4中可见，通过本发明提供的线粒体DNA扩增方法得到的硬头鳟线粒体全基 因组序列与亚种内其他的鱼类线粒体全基因组序列差异位点非常少，可见该方法能有效扩 增出鱼类线粒体全基因组序列。
【主权项】
1. 用于扩增鱼类线粒体全基因组DNA的引物对，其特征在于，所述引物对包括以下 1)~4)中的至少一对引物，优选含有1)~4)中的所有4对引物： 1) 为序列表中的序列1和序列2所示的核苷酸序列； 2) 为序列表中的序列3和序列4所示的核苷酸序列； 3) 为序列表中的序列5和序列6所示的核苷酸序列； 4) 为序列表中的序列7和序列8所示的核苷酸序列。2. -种使用权利要求1所述的引物对来进行扩增鱼类线粒体全基因组DNA的方法。3. 根据权利要求2所述的扩增方法，其特征在于，所述的扩增方法包括以鱼类DNA为模 板，进行PCR扩增。4. 根据权利要求2或3所述的扩增方法，其特征在于，所述PCR扩增时，各引物对的退 火温度为48~60°C，优选为56°C或58°C。5. 含有权利要求1所述的引物对的制剂。6. -种包含权利要求1所述的引物对的试剂盒。7. 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于鱼类线粒体全基因组 DNA的扩增。
【专利摘要】本发明提供了鱼类线粒体全基因组DNA扩增。首先本发明提供了鱼类线粒体全基因组DNA扩增的引物对，本发明还提供了利用上述引物组合来扩增鱼类线粒体全基因组DNA的方法。通过本发明提供的扩增方法，能够成功地获得各种鱼类线粒体基因组的克隆产物。并且本发明设计和筛选得到的引物对具有扩增性能好、产生副产物较少等优秀性质。
【IPC分类】C12N15/10, C12N15/11
【公开号】CN104911182
【申请号】CN201510292241
【发明人】李炯棠, 薛尉, 肖贵宝, 孙效文
【申请人】中国水产科学研究院
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月1日