马铃薯类t-dna元件与同源转基因体系及其应用
【技术领域】
[0001] 本专利属于植物基因工程技术领域。具体涉及25个马铃薯来源的类"T-DNA"元 件和1个可应用于马铃薯及其他植物安全转基因的同源转基因体系及应用。其中25个马 铃薯来源的类"T-DNA"元件及由此构建的同源转基因体系在提高马铃薯等各类植物转基因 安全性等方面具有显著功能，可以在植物安全转基因领域进行应用。
【背景技术】
[0002] 随着全球人口飞速增长，20世纪60年代起始的"第一次绿色革命"面对现今60 多亿人的吃饭问题已不堪重负。在2010年2月的美国科促会（AAAS)年会上，有专家预测， 全球人口总数将在2050年左右膨胀至90亿。然而，在人口快速增长的同时，全球可耕种的 农地、供使用的淡水和其他农业资源却没有多大的变化。为确保食品安全、减少环境损害， 突破耕地、水等资源约束，保障全球粮食安全和农产品长期有效供给，归根结底要靠科技创 新和应用。推进转基因技术研宄与应用，是确保全球粮食安全的重要途径。
[0003] 尽管如此，上个世纪末以来，转基因作物的安全性在全球范围内引起了激烈的争 论。总体而言，争论的焦点主要是无法完全确定所转移的其他物种基因在受体生物遗传背 景中的全部表现，特别是来源于微生物的基因与功能元件序列在植物中的全部表现无法完 全预测，转基因生物一旦进入自然环境，就会扎根繁衍，加上基因逃逸现象等，一旦确证存 在风险，要从环境中收回将非常困难(李尉民，岳宁等.转基因生物及其产品的风险与管 理·生物技术通报· 2000，4: 41-44)。
[0004] 为提高转基因作物的安全性，科学家们近年来提出了一种新的转基因策略一一内 源转基因（Cisgenesis/Intragenisis)。根据目标基因的来源不同，可以将转基因分为内源 转基因（Cisgenesis/Intragenisis)和异源转基因（Transgenesis)，内源转基因是利用受 体物种本身或其近缘野生种的基因进行遗传修饰的转基因技术，异源转基因则是利用不同 物种的功能基因，通过转基因将其导入到栽培品种中，育成新品种。内源转基因所用的基因 即内源基因（Cisgene)早已存在于受体同物种或其近缘野生种中，因此并没有改变受体物 种的基因库。和常规育种相比，内源转基因较常规育种可以简化操作、节约成本，且并无额 外的风险，这一观点在世界各地都达成了共识，包括新西兰、北美和欧洲等国家的民意调查 结果显示内源转基因技术普遍认为可被接受。因此，利用植物本身固有的功能基因采用内 源转基因的策略对作物进行遗传改良，不仅能够有效避免异源基因所带来的各种风险、打 消公众对转基因作物安全性的疑虑，而且简化了常规育种繁杂的田间杂交、选择程序，缩短 育种周期，最终提高作物育种的效率。
[0005] 马铃薯是粮、菜、饲料和加工原料兼用的农作物，其适应性广、丰产性好、营养丰 富、经济效益高，已成为世界上继水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物。我国是世界上 马铃薯生产第一大国，发展马铃薯产业对于保障我国粮食安全、促进农民增收和推动农业 和农村经济持续发展具有重大的意义。栽培种马铃薯iMerios?? L )的遗传基 础狭窄，常常需要从野生种和近缘栽培种中引入抗病、优质基因用于栽培品种的遗传改良。 但马铃薯栽培种为同源四倍体作物，遗传分离复杂，且与许多野生种及原始栽培种存在生 殖隔离，因此，传统的马铃薯育种技术一一杂交育种技术限制了对这些宝贵资源的利用。随 着现代科学技术的进步和不同学科间的相互渗透，基因工程育种技术已经融入到马铃薯育 种中，产生了一大批靠常规育种方式难以产生的育种材料，丰富了育种资源、加快了育种进 程。特别是近十多来年，我国学者利用基因工程技术进行了马铃薯抗病、抗逆及品质改良等 多方面的研宄，已经取得了一定的成绩，然而，如上所述，公众对基因工程改良品种安全性 的担心，极大地限制了转基因马铃薯的商品化进程。
[0006] 为解决马铃薯转基因产品的安全隐患，部分学者已开始着手马铃薯内源转基因技 术的研宄，现有的报道大多强调了目的性状基因的内源性，然而构建表达载体的DNA序列 仍然不能完全使用同源或者近缘物种来源的DNA序列，许多DNA序列仍然来源于微生物，例 如：农杆菌来源的T-DNA边界序列等。转基因载体上的异源序列可以随目的基因插入到植 物基因组中，其潜在的影响尚无法估计，引发公众对转基因产品的安全的忧虑。总体而言， 目前公众对转基因安全的质疑主要包括两个方面，一是来源于不同物种之间的目的性状基 因相互转化可能产生的威胁，二是转基因载体上的异源DNA序列元件(如农杆菌T-DNA序列 等）随目的性状基因插入到植物基因组中的潜在威胁。目前对于同源目的性状基因的克隆 研宄已有很多，但针对载体序列的安全性研宄还十分有限。因此，开发更加安全的转基因内 源DNA序列元件用于遗传改良，是包括马铃薯在内的植物转基因技术研发的当务之急。
[0007] 鉴于内源DNA序列元件对于转基因安全性的重要性，国际上有些学者在综述类文 章中对其进行了一些前瞻性的讨论[Conner A J, Barrell P J, et al. · Erasmuson A K, Nap JP, Jacobs J Μ. E. Intragenic vectors for gene transfer without foreign DNA. Euphytica. 2007, 154: 341-353 ；Rommens, C M, Haring M A, et al. . ^The intragenic approach as a new extension to traditional plant breeding. 〃 Trends Plant Sci. 2007，12(9): 397-403]，而且两个研宄小组已经对内源DNA序列元件做了一些 相关研宄。新西兰皇家研宄院作物与食品研宄所的Baldwin等[Baldwin, S.，A. Lokerse, et al. . Intragenic vectors: mining plant EST databases for T-DNA border-like sequences. Proceedings of the 13th Australasian Plant Breeding Conference, Christchurch, New Zealand. 2006 pp. 946-951]通过分析农杆菌 T-DNA 元件，发现该元 件序列具有两个重要的保守结构域，分别用这两个结构域搜寻植物EST数据库发现，保守 结构域在大多数植物的转录本中都广泛存在，搜索、分析及计算机辅助拼接后获得多条植 物来源的"T-DNA"序列。经内源转化验证，其中部分植物来源的"T-DNA"序列具有生物学 功能。Baldwin等研宄的植物"T-DNA"序列虽然完全来自植物转录本且具有生物学功能，但 是由于它们是将两个保守结构域进行分别搜索再经计算机拼接组成，因此，它们能否被定 义为植物来源的内源DNA元件尚有争议。
[0008] 美国辛普劳公司的 Rommens 等[1?01111116118，（1]\1，0.13〇1^1'；[，6七&1·· Plant-derived transfer DNAs. Plant Physiol 2005，139 (3) : 1338-49]则根据农杆 菌T-DNA的两个保守结构域设计简并引物，在马铃薯、水稻等多个植物基因组中分别克 隆得到了数条类"T-DNA"元件，经转基因烟草研宄，证实了 5条马铃薯基因组来源的类 "T-DNA"元件具有起始转移功能。相比农杆菌T-DNA起始转移效率，其中4条转移序列起 始转移效率在50%到105%之间。其后Rommens实验室又继续利用这些类"T-DNA"元件构 建了马铃薯同源转基因体系，并用于转基因改良马铃薯的低温糖化及油炸后高丙烯酰胺 等品质[Chawla, R. , R. Shakya, et al. . Tuber-specific silencing of asparagine synthetase-1 reduces the acrylamide-forming potential of potatoes grown in the field without affecting tuber shape and yield. Plant Biotechnol J 2012, 10 (8) :913-24 ；Rommens, C. M. , H. Yan, K. Swords, et al. . Low-acrylamide French fries and potato chips. Plant Biotechnol J 2008, 6 (8) :843-53 ; Rommens, C. M. , C. M. Richael, et al. . Engineered native pathways for high kaempferol and caffeoylquinate production in potato. Plant Biotechnol J 2008, 6 (9):870-86 ； Rommens, C. M. , J. M. Humara, et al. . Crop improvement through modification of the plant's own genome. Plant Physiol 2004, 135 (I):421-31. ]〇
[0009] 综上所述，虽然已经认识到内源DNA序列元件的鉴定和利用对于转基因安全性具 有重要性，但是目前国际上涉及到的报道多为综述类文章，相关研宄类报道较少且较初步， 仅Rommens实验室在该领域做出了一定的研宄成果。然而，Rommens实验室的研宄中使用 的简并引物扩增方法并不能够全面寻找马铃薯类"T-DNA"元件，因此，该研宄有待进一步全 面展开。
【发明内容】
[0010] 随着马铃薯基因组测序框架图的完成，本发明人更加系统、全面地分析了马铃薯 类"