一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，其包括以下步骤：(一)梨再生最适个体筛选：通过对田间性状表现优良的多株梨进行单株采果取种、单株播种以及多轮再生培养方式筛选不定芽再生效果最好的单株作为梨再生最适个体；(二)梨转基因植株获得：在筛选到梨再生最适个体基础上进一步建立高效再生、生根及转基因体系，并通过抗生素筛选获得转基因植株。本发明的方法操作简单，取材方便，成本较低，适用于所有梨属材料。可以利用现有的通用再生培养基进一步筛选最适的转基因材料并建立高效再生、生根及转基因体系，为梨遗传转化提供技术支持。
【专利说明】
一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明涉及高效遗传转化体系领域，尤其涉及一种用于梨同源转基因功能验证材 料的筛选方法。
【背景技术】
[0002] 梨是主要以嫁接繁殖的果树，合理的梨砧木可以在一定程度上改善植株的非生物 胁迫耐性、果实品质、丰产性、成熟期等，如何获得性状更加优良的梨砧木一直是育种家们 努力的目标。在梨砧木育种中，一般通过传统杂交育种方式获得性状优良的梨砧木优系。但 传统杂交手段用时长，目标性状不宜被锁定，工作量大。因此，在生物技术快速发展的大背 景下，通过基因工程获得目标性状明显的转基因梨砧木新材料成为研究热点。同时，基因的 同源转化也是对梨中控制特殊性状基因进行功能验证的必要手段，通常建立离体培养的高 效再生体系是果树植物基因工程的基础，但亚洲梨再生率低，且存在较强的基因型依赖性， 在一定程度上限制了通过转基因方法进行同源基因的功能验证，影响了这类植物相关基因 功能解析的可信度，也影响了通过基因工程获得新材料的可行性。
【发明内容】
[0003] 鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种用于梨同源转基因功能验 证材料的筛选方法，以通过同源转化进行基因功能验证，建立具有优良再生能力的遗传转 化体系。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明方案包括：
[0005] -种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，其包括以下步骤：
[0006] (1)秋子梨再生最适个体筛选
[0007] A、选择田间性状表现优良的多株秋子梨单株，分别于果实成熟时期采果取种，并 对种子进行层积处理；
[0008] B、将完成层积处理的种子，流水洗净，用2%的次氯酸钠溶液消毒处理10分钟，无 菌水冲洗干净后将种子播种于MS+蔗糖30g/L+琼脂6.0-7.0g/L，PH5.8-6.0的培养基上；
[0009] C、待种子萌发至长出6-8片真叶后，分别将每株实生苗的真叶剪下，剪成5mm X 5mm外植体，并于叶脉处横切2-4个伤口，将叶片正面朝上接种于诱导梨属植物不定芽的通 用再生培养基上，在25 ±2 °C条件下暗培养2周，通用再生培养基为丽69+噻苯隆（TDZ) 2 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA)O ? 3mg/L+蔗糖 40g/L+琼脂 6 ? Og/L，PH5 ? 8;
[0010] D、在步骤C的暗培养结束后转入光下培养，在光下培养过程中观察每株实生苗的 外植体愈伤组织和不定芽产生情况，将不定芽产生速度快、数量多、状态好的外植体对应单 株作为秋子梨再生的初选材料；
[0011] E、将步骤D中初选材料诱导出的不定芽接种于增殖培养基上，使芽尽快长成健壮 的嫩梢，并进行适当增殖；
[0012] F、对已经进行芽增殖培养的初选材料，再次分别取嫩梢幼叶按照步骤C、步骤D的 操作进行不定芽诱导，然后将不定芽产生速度最快、数量最多、状态最好的外植体作为遗传 转化的候选材料;将候选材料诱导出的不定芽按照步骤E的操作进行芽增殖培养，获得大量 用于遗传转化的试管苗；
[0013] (2)秋子梨转基因植株获得
[0014] G、最适再生培养基筛选:在通用培养基基础上调整激素配比，筛选出最适于秋子 梨候选单株材料的再生培养基；
[0015] H、预培养:选择生长一致的用于遗传转化的试管苗幼叶作为外植体，用无菌刀片 垂直于叶片中脉横切2~4个伤口，叶片正面朝上接种于不定芽诱导的再生培养基上，暗环 境下预培养5天；
[0016] I、侵染:将预培养的外植体叶片浸入含转化载体的农杆菌侵染液中10-30分钟，其 中农杆菌菌液〇D6qq = 0.6~0.8 ；
[0017] J、共培养:将吸干水分的外植体叶片继续接种到再生培养基上，黑暗条件下共培 养2天；
[0018] K、脱菌筛选培养:将外植体叶片转接到含10mg/L卡那霉素筛选剂与200mg/L头孢 霉素脱菌剂的再生培养基上进行抗性苗筛选，暗培养7天后，转到光下培养，培养温度为25 ±2°C，将在含卡那霉素的再生培养基上能够正常生长的植株初步确定为转基因抗性植株；
[0019] L、生根培养:待转基因抗性植株长到2.5-3.5cm时，将其转接到含5mg/L卡那霉素 筛选剂的生根培养基上进行生根培养，将能够在含卡那霉素培养基上生根的植株确定为转 基因阳性植株，生根培养基为1 /2MS+吲哚丁酸（IBA) 0 ? 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6 ? Og/L，pH值 为 5.8〇
[0020] 所述的筛选方法，其中，上述步骤（1)中通过单株采果取种、单株播种以及多轮再 生培养方式筛选秋子梨再生最适个体。。
[0021] 所述的筛选方法，其中，上述步骤（1)与步骤G中先利用梨属植物通用再生培养基 筛选秋子梨再生最适个体作为候选材料，再利用候选材料在通用培养基基础上筛选再生效 率最高的再生培养基。
[0022]所述的筛选方法，其中，所述步骤E中增殖培养基为MS+6-苄氨基嘌呤（6-BA) 1 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA) 0 ? lmg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 6 ? 0-7 ? Og/L，培养基 pH 值为 5 ? 8-6 ? 0。 [0023] 所述的筛选方法，其中，所述步骤G、H、J和K中再生培养基为NN69+噻苯隆（TDZ) 3 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA) 0 ? 3mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 6 ? Og/L，PH5 ? 8。
[0024]所述的筛选方法，其中，所述步骤K和L中筛选剂卡那霉素浓度分别为10mg/L和 5mg/L〇
[0025]所述的筛选方法，其中，所述步骤L中生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸（IBA)0.5mg/L +蔗糖 30g/L+琼脂 6 ? 0g/L，PH5 ? 8。
[0026]本发明提供的一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，通过种子获得实 生苗，在实生苗中筛选再生效果最好的植物材料，进而筛选出具有优良再生能力的秋子梨 材料，并在此基础上进一步建立高效再生、生根及遗传转化体系，将为应用现代分子生物学 手段培育性状更加优良的转基因梨砧木新品种（系），或通过同源转化进行基因功能验证， 进一步深入开展相关基因对某些生物性状调控机理研究奠定技术支持。
【具体实施方式】
[0027]本发明提供了一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，为使本发明的目 的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述 的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028]本发明提供了一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，以秋子梨为例， 选择秋子梨性状典型的材料，以叶片为外植体，在秋子梨实生种子后代中选择具有最优良 再生能力的秋子梨单株材料，并利用这一候选材料建立高效再生及遗传转化体系，获得转 基因抗性植株。其具体的步骤包括：
[0029] 步骤一，选择田间性状表现优良的多株秋子梨单株，分别于果实成熟时期采果取 种，并对种子进行层积处理；
[0030] 步骤二，将完成层积处理的种子，流水洗净，用2%的次氯酸钠溶液消毒处理10分 钟，无菌水冲洗干净后将种子播种于MS+蔗糖30g/L+琼脂6.0-7. Og/L，PH5.8-6.0的培养基 上；
[0031] 步骤三，待种子萌发至长出6-8片真叶后，分别将每株实生苗的真叶剪下，剪成5mm X 5mm外植体，并于叶脉处横切2-4个伤口，将叶片正面朝上接种于诱导梨属植物不定芽的 通用再生培养基上，在25±2°C条件下暗培养2周，通用再生培养基为NN69+噻苯隆（TDZ) 2 ? 0mg/L+吲哚丁酸（IBA)O ? 3mg/L+蔗糖 40g/L+琼脂 6 ? Og/L，PH5 ? 8;
[0032] 步骤四，在步骤三的暗培养结束后转入光下培养，在光下培养过程中观察每株实 生苗的外植体愈伤组织和不定芽产生情况，将不定芽产生速度快、数量多、状态好的外植体 对应单株作为秋子梨再生的初选材料；
[0033] 步骤五，将步骤四中初选材料诱导出的不定芽接种于增殖培养基上，使芽尽快长 成健壮的嫩梢，并进行适当增殖；
[0034]步骤六，对已经进行芽增殖培养的初选材料，再次分别取嫩梢幼叶按照步骤三、步 骤四的操作进行不定芽诱导，然后将不定芽产生速度最快、数量最多、状态最好的外植体作 为遗传转化的候选材料;将候选材料诱导出的不定芽按照步骤E的操作进行芽增殖培养，获 得大量试管苗；
[0035] 步骤七，在通用培养基基础上调整激素配比，筛选出最适于秋子梨候选单株材料 的再生培养基。其中，不同激素配比及浓度对不定芽诱导的影响如表1，表2所示；
[0036] 表1
[0041 ] 如表1所示，在秋子梨再生培养基中，添加3.0mg/L TDZ和0.3mg/L IBA能得到最高 的再生效率，且每个外植体上的不定芽数量最多，可以达到8.48个。
[0042] 步骤八，选择生长一致的用于遗传转化的试管苗幼叶作为外植体，用无菌刀片垂 直于叶片中脉横切2~4个伤口，叶片正面朝上接种于不定芽诱导的再生培养基上，暗环境 下预培养5天；
[0043] 步骤九，将预培养的外植体叶片浸入含转化载体的农杆菌侵染液中10-30分钟，其 中农杆菌菌液0D6Q() = 0.6-0.8，将吸干水分的外植体叶片继续接种到再生培养基上，黑暗条 件下共培养2天后，将外植体叶片转接到含10mg/L卡那霉素筛选剂与200mg/L头孢霉素脱菌 剂的再生培养基上进行抗性苗筛选，暗环境培养7天后，转到光下培养，培养温度为25 ± 2 °C，将在含卡那霉素的再生培养基上能够正常生长的植株初步确定为转基因抗性植株。其 中，不同预培养、共培养时间对转化效率的影响如表3所示。
[0044] 表 3
[0046]由表3可得出，预培养5天，共培养2天的培养条件能够获得最多的抗性植株，而经 检测，虽有假阳性植株存在，但转化效率较高，为11.93%。
[0047]步骤十，待转基因抗性植株长到2.5-3.5cm时，将其转接到含5mg/L卡那霉素筛选 剂的生根培养基上进行生根培养，将能够在含卡那霉素培养基上生根的植株确定为转基因 阳性植株，生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸（IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值为 5.8。其中，不同浓度生长素对不定根的诱导情况如表4所示。
[0048]表 4
[0050]如表4所示的，为不同浓度生长素对不定根的诱导情况，在IBA含量为0.5mg/L时， 秋子梨生根诱导率最高，为45.5%。
[0051]当然，以上说明仅仅为本发明的较佳实施例，本发明并不限于列举上述实施例，应 当说明的是，任何熟悉本领域的技术人员在本说明书的教导下，所做出的所有等同替代、明 显变形形式，均落在本说明书的实质范围之内，理应受到本发明的保护。
【主权项】
1. 一种用于梨同源转基因功能验证材料的筛选方法，其包括以下步骤： (1) 秋子梨再生最适个体筛选方法 A、 选择田间性状表现优良的多株秋子梨单株，分别于果实成熟时期采果取种，并对种 子进行层积处理； B、 将完成层积处理的种子，流水洗净，用2%的次氯酸钠溶液消毒处理10分钟，无菌水 冲洗干净后将种子播种于MS+蔗糖30g/L+琼脂6.0-7.0g/L，PH5.8-6.0的培养基上； C、 待种子萌发至长出6-8片真叶后，分别将每株实生苗的真叶剪下，剪成5mmX5mm外植 体，并于叶脉处横切2-4个伤口，将叶片正面朝上接种于诱导梨属植物不定芽的通用再生培 养基上，在25 ± 2°C条件下暗培养2周，通用再生培养基为NN69+噻苯隆（TDZ)3.0mg/L+吲噪 丁酸（IBA) 0 · 3mg/L+蔗糖 40g/L+琼脂 6 · Og/L，PH5 · 8; D、 在步骤C的暗培养结束后转入光下培养，在光下培养过程中观察每株实生苗的外植 体愈伤组织和不定芽产生情况，将不定芽产生速度快、数量多、状态好的外植体对应单株作 为秋子梨再生的初选单株材料； E、 将步骤D中初选材料诱导出的不定芽接种于增殖培养基上，使芽尽快长成健壮的嫩 梢，并进行适当增殖； F、 对已经进行芽增殖培养的初选材料，再次分别取嫩梢幼叶按照步骤C、步骤D的操作 进行不定芽诱导，然后将不定芽产生速度最快、数量最多、状态最好的外植体作为遗传转化 的候选单株材料;将候选材料诱导出的不定芽按照步骤E的操作进行芽增殖培养，获得大量 候选材料试管苗； (2) 秋子梨转基因植株获得方法 G、 最适再生培养基的筛选:在通用培养基基础上调整激素配比，筛选出最适于秋子梨 候选单株材料的再生培养基； H、 预培养:选择生长一致的用于遗传转化的试管苗幼叶作为外植体，用无菌刀片垂直 于叶片中脉横切2~4个伤口，叶片正面朝上接种于不定芽诱导的再生培养基上，暗环境下 预培养5天； I、 侵染:将预培养的外植体叶片浸入含转化载体的农杆菌侵染液中10-30分钟，其中农 杆菌菌液OD6〇〇 = 0.6~0.8 ； J、 共培养：将吸干水分的外植体叶片继续接种到再生培养基上，黑暗条件下共培养2 天； K、 脱菌筛选培养:将外植体叶片转接到含10mg/L卡那霉素筛选剂与200mg//L头孢霉素 脱菌剂的再生培养基上进行抗性苗筛选，暗培养7天后，转到光下培养，培养温度为25±2 °C，将在含卡那霉素的再生培养基上能够正常生长的植株初步确定为转基因抗性植株； L、 生根培养:待转基因抗性植株长到2.5-3.5cm时，将其转接到含5mg//L卡那霉素筛选 剂的生根培养基上进行生根培养，将能够在含卡那霉素培养基上生根的植株确定为转基因 阳性植株，生根培养基为1/2MS+吲哚丁酸（IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6.0g/L，pH值为 5 · 8〇2. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，上述步骤（1)中通过单株采果取种、单 株播种以及多轮再生培养方式筛选秋子梨再生最适个体。3. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，上述步骤（1)与步骤G中先利用梨属植 物通用再生培养基筛选秋子梨再生最适个体作为候选材料，再利用候选材料在通用培养基 基础上筛选再生效率最高的再生培养基。4. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，上述步骤E中增殖培养基为MS+6-苄氨 基嘌呤(6-BA) 1 ·Omg/L+吲哚丁酸（IBA)O· lmg/L+蔗糖30g/L+琼脂6·0-7·Og/L，培养基pH值 为5.8-6.0。5. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤G、H、J和K中再生培养基为 NN69+噻苯隆（TDZ) 3 · 0mg/L+吲哚丁酸（IBA) 0 · 3mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 6 · Og/L，PH5 · 8。6. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤K和L中筛选剂卡那霉素浓度 分别为l〇mg/L和5mg/L。7. 根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤L中生根培养基为1/2MS+吲 哚丁酸（IBA) 0 · 5mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂 6 · Og/L，PH5 · 8。
【文档编号】A01H4/00GK105850740SQ201610242856
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】王然, 杨英杰, 李鼎立, 张梅, 李健楠
【申请人】青岛农业大学