专利名称:用于发酵生产l-赖氨酸的重组dna、菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及L-赖氨酸的生产方法，特别涉及一种用于发酵生产L-赖氨酸的DNA、菌株及方法，属于微生物工程技术领域：
。
背景技术：
发酵法生产L-赖氨酸，大多采用从自然环境分离的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突变株。已知的高产人工突变株大多为S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、赖氨酸乙酯盐酸盐(Lys-OEt)等抗性，且多为高丝氨酸缺陷型或苏氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型，并且属于埃希氏属、棒杆菌属，短杆菌属。
就埃希氏属来说，根据专利公开号CN 1423691A披露了通过增强来源于大肠杆菌脱敏的天冬氨酸激酶II1、二氢吡啶二羧酸还原酶、四氢吡啶二羧酸琥珀酰酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱酰酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和天冬氨酸- β -半醛脱氢酶来增加L-赖氨酸
的产量。
就棒杆菌和短杆菌属来说，根据专利公开号CN 100451104C中的报道，通过增强
丙酮酸羧化酶、二氢吡啶二羧酸合酶、天冬氨酸激酶、L-赖氨酸输送蛋白和二氢吡啶二羧酸还原酶来增加L-赖氨酸的产量。
在大肠杆菌中，L-赖氨酸合成以草酰乙酸为前体，通过过量表达来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，将磷酸烯醇式丙酮酸直接羧化为草酰乙酸，增加了 L-赖氨酸合成的前体；通过过量表达来源于大肠杆菌的脱敏的天冬氨酸激酶III和天冬氨酸-β -半醛脱氢酶来增加天冬氨酸代谢途径的代谢通量；通过过量表达来源于大肠杆菌的脱敏的二氢吡啶二羧酸合酶和来源于棒杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶来增加L-赖氨酸合成的代谢流量。
但是，上述用于增强表达大肠杆菌中L-赖氨酸合成途径关键酶的质粒都需要在表达的基因前面加入启动子，例如专利CN 1423691Α所述的pCABDEl过量表达了 lysC、dapA、dapB、ddh、dapE这5个基因，其中dapA受Ptet启动子的控制，lysC、dapB、ddh和dapE分别受4个Plac启动子的控制。
发明内容
本发明的目的之一是克隆L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成途径关键酶的基因，并解析其序列。
本发明的另一目的是获得对L-赖氨酸脱敏的天冬氨酸激酶III和二氨基庚二酸合酶。
本发明的又一目的是表达L-赖氨酸生物合成途径的酶的基因，提高L-赖氨酸的产量。
此外， 本发明的目的还包括提供一种大肠杆菌菌株，其中如下L-赖氨酸生物合成途径的酶的活性得到增强:[0011]①IysC基因编码的天冬氨酸激酶III ；
②dapA基因编码的二氨基庚二酸合酶；
③PPC基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；
④asd基因编码的天冬氨酸-β-半醛脱氢酶；
⑤ddh基因编码的二氨基庚二酸脱氢酶。
本发明的目的还包括提供一种发酵L-赖氨酸的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用了如下技术方案:
一种用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，包括解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。
具体而言，所述解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制的天冬氨酸激酶III从N端开始计算，该天冬氨酸激酶111催化亚基的第318位氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；第323位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸，其序列见SEQ ID NO: 14，且该二氢吡啶二羧酸合酶调节亚基的第118位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸，其序列见SEQ ID NO:15。
所述天冬氨酸-β -半醛脱氢酶是来源于大肠杆菌的编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶，其包含与SEQ ID NO: 16实质相同的氨基酸序列。
所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，其包含与SEQ ID NO: 18实质相同的氨基酸序列。
所述二氨基庚二酸脱氢酶是来源于棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶，其包含与SEQ ID NO: 17实质相同的氨基酸序列。
包含如上所述重组DNA的表达质粒pWG-aACPD。
一种大肠杆菌，包含如上所述的重组DNA。
一种大肠杆菌，是导入如上所述的重组DNA或表达质粒pWG-aACPD而转化过的。
如上所述大肠杆菌在发酵生产L-赖氨酸工艺中的应用。
一种生产L-赖氨酸的方法，包括:在发酵培养基中对如上所述的大肠杆菌进行培养以生产L-赖氨酸。
作为特别优选的实施方案，所述培养温度在37°C，培养时间在48h左右。
根据本发明，在大肠杆菌中表达L-赖氨酸产生菌种的L-赖氨酸合成基因，根据L-赖氨酸生物合成酶的最适温度，采用高温短时发酵，菌株的代谢强度得到提高，L-赖氨酸生物合成酶的活性提高，L-赖氨酸的产量和糖酸转化率提高。
本发明可被运用于采用棒状杆菌的L-赖氨酸的生产。
为达成上述目标，本案发明人进行了长期研究和大量实践，并发现与现有技术相t匕，本发明采用表达L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成基因，能大大提高L-赖氨酸的产量；且根据L-赖氨酸生物合成酶的最适温度，构建发酵模型，尤其是高温短时发酵模型，菌株的代谢强度得到提高， L-赖氨酸生物合成酶的活性提高，L-赖氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提闻。
[0032]图1是由葡萄糖生物合成L-赖氨酸路线图及其关键酶基因；
图2是表达质粒pWG-aACPD的构建图谱；
图3是大肠杆菌JNU-11/pWG-aACPD发酵生产L-赖氨酸的进程曲线图。
具体实施方式
作为本发明的一种典型应用方式，本发明的技术方案可以包括:
1、用于提供L-赖氨酸生物合成基因的L-赖氨酸产生菌株的筛选
“L-赖氨酸产生菌株”是指在培养基中培养该菌株时，有在培养基中积累L-赖氨酸的能力。L-赖氨酸产生菌株大多为从自然环境分离的微生物菌株并由此微生物菌株得到的人工突变株。如营养缺陷型突变株、结构类似物抗性株或者代谢调节突变株等，且营养缺陷型突变、结构类似物抗性或者代谢调节突变等特性可以单独赋予或者两项或多项联合赋予。已知的高产人工突变株大多为S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、磺胺胍(SG)、赖氨酸乙酯盐酸盐(Lys-OEt)等抗性，且多为高丝氨酸缺陷型或苏氨酸缺陷型和蛋氨酸缺陷型。
L-赖氨酸产菌大致有:大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、黄色短杆菌(Brevibacterium fIavum)和乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)等诱变选育而来。
2、L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成途径关键酶基因的解析和制备
L-赖氨酸生物合成途径关键酶来源于上述产L-赖氨酸大肠杆菌，具有营养缺陷型突变、结构类似物抗性和代谢调节突变的特性。
(I)用于本发明方法中编码天冬氨酸激酶III的基因IysCf:
用于本发明方法中的编码突变体天冬氨酸激酶III具有突变，解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制:从N端开始计算，该天冬氨酸激酶III催化亚基的第318位氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸；第323位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸。
(2)用于本发明方法中编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶的基因dapA*:
用于本发明方法中的编码突变体二氢吡啶二羧酸合酶具有突变，解除了 L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制:从N端开始计算，二氢吡啶二羧酸合酶调节亚基的第118位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。
(3)用于本发明方法中编码天冬氨酸-半醛脱氢酶的基因asd:
用于本发明方法中编码天冬氨酸_β -半醛脱氢酶的asd是来源于大肠杆菌的编码天冬氨酸半醛脱氢酶。
(4)用于本发明方法中编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因ppc:
用于本发明方法中的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
(5)用于本发明方法中编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因ddh:
用于本发明方法中编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh是来源于棒状杆菌的二氨基
庚二酸脱氢酶。
3、表达质粒pWG-aACPD的构建
将上述获得的 L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成途径的酶的基因与合适的表达载体相连，如PDXW-8 (参阅公开号为CN101693901A的发明专利)。在pDXW_8的基础上构建了表达质粒pWG-aACPD，其含有双Ptac启动子，分别控制L-赖氨酸合成途径的5个关键基因的表达，其中asd、IysCf和dapA*受一个Ptac启动子的控制,ppc和ddh受另外一个Ptac启动子的控制。前述Ptac启动子是由Plac和Ptrp启动子人工构建的杂合启动子，受Iac阻遏蛋白的负调节，其启动能力要比Plac启动子强的多，所以不用每个基因前面都加入启动子。
4、大肠杆菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌的构建
将上述构建的表达质粒pWG-aACPD转化大肠杆菌JNU-1l宿主菌，构建JNU-1l/pWG-aACPD基因工程菌。
5、利用构建的大肠杆菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌发酵生产L-赖氨酸
可采用常规方法进行培养，采用典型培养基，其中含有碳源、氮源、矿物质、以及所需要的诸如氨基酸、维生素等微量有机营养物。另外，合成或天然的培养基均可采用。只要菌株可以利用以进行培养，任何碳源和氮源均可采用。
就碳源而言，诸如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解糖，糖蜜等糖类，以及诸如醋酸、柠檬酸等有机酸均可采用。另外，乙醇等醇类也可以单独或者与其他碳源组合使用。
就有机营养而言，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，酵母提取物，玉米浆、大豆蛋白分解产物等物质均可采用。当某种营养缺陷型突变株的生长需要一种氨基酸或类似的物质时，优先添加该需要营养物。
就矿物质而言，磷酸盐、镁盐、铁盐、锰盐等均可采用。
培养条件为好氧，相对溶氧20%-50%为宜。培养温度控制在20-45°C，pH5_9，培养过程中PH下降时，可以加入氨水或气氨之类的碱予以中和。用上述方法培养20-50h后，培养基中就会积累大量的L-赖氨酸。
培养结束后，可以采用常规方法从发酵培养基中收集L-赖氨酸。
发酵过程中，检测0D、残糖、L-赖氨酸浓度，并控制残糖浓度在10_15g/L左右，绘制发酵过程曲线。
以下结合若干较佳实施例对本发明的技术方案作更为详细的说明:
实施例1大肠杆菌JM109感受态的制备和转化
①将用20%甘油冷冻保藏的菌液，在相应抗性的LB平板上划线，于37°C恒温箱隔夜培养，待长出单菌落后，接单菌于15mL相应抗性的LB液体培养基，于37°C，100r/min摇床隔夜培养；
②将隔夜培养物按I %的接种量转接于50mL/500mL新鲜LB液体培养基，于37°C，100r/min摇床培养约1.5_2h，待0D600约为0.5，冰浴IOmin ；
③4 °C, 5，000r/min离心IOmin,丢弃上清，收集菌体；将菌体重悬于20ml100mmol/L的CaCl2溶液中，冰浴20min ；4°C, 5, 000r/min离心IOmin,丢弃上清,收集菌体；
⑤取ImL IOOmmoI/L的CaCl2溶液(含有15%甘油)慢慢吹吸轻柔悬浮菌体；
⑥取70 μ L分装于灭菌1.5mL离心管中，直接用于转化或者_20°C保存；
⑦取2 μ L质粒或10 μ L酶连产物,待感受态于冰上融化后，慢慢吹吸轻柔混勻后冰浴30min ；[0071]⑧42°C热激90s后冰浴lmin，加入ImL新鲜LB或者SOC培养基，37°C复苏Ih ；
⑨8，000 Xg离心lmin，弃上清，取100 μ L，吹吸混匀后涂布相应的抗性平板。
⑩于37°C恒温箱培养10_12h，待长出转化子后挑取转化子于相应抗性的LB液体培养基37°C培养12h后，抽提质粒进行酶切验证质粒连接是否正确。
实施例2表达质粒pWG-aACPD的构建
①dapA*、lysC*、ddh、ppc、asd、XXXlysC 基因的克隆:以 E.coli JNU-1l 基因组作为模板，SEQ ID NO:1(含SD序列)和SEQ ID NO:2为引物，PCR获得dapA ;以E.coliJNU-1l基因组作为模板，SEQ ID NO:3(含SD序列)和SEQ ID NO:4为引物，PCR获得IysC ;以 C.glutamicum ATCC 13032 基因组作为模板，SEQ ID NO:5(含 SD 序列)和 SEQ ID NO:6为引物，PCR获得ddh ;以E.coli JNU-1l基因组作为模板，SEQ ID N0:7(含SD序列)和SEQ ID NO:8为引物，PCR获得ppc ;以E.coli JNU-11基因组作为模板，SEQ ID N0:3(含SD 序列)和 SEQ ID NO:13 为引物，PCR 获得 XXXlysC0
②dapA*片段与T载体相连为pMD-19T_dapA ；asd片段与T载体相连为pMD-19T-asd ；dapA* 片段与 pMD-19T_asd 通过 Kpn I 切点连接，获得 pMD-19T-asd_dapA* ；lysC* 和 pMD-19T-asd_dapA* 通过 Sac I 单切点进行连接，获得 pMD-19T-asd_dapA*-lysC* ；用 EcoR I 酶切 pMD-19T-asd-dapA*-lysC* 获得 EcoR 1-asd-dapA*-lysC*-EcoR I 片段。
③ddh片段与pUC19通过EcoR I单切点进行连接，获得pUC19_ddh ；ppc片段与pUC19-ddh通过Sac I单切点进行连接，获得pUC19_ddh-ppc。
④pDXW-8Nco I 切点的去除:XXXlysC 用 Kpn I 酶切后得到 Kpn 1-XXXlysC-KpnI，通过Kpn I单切点与pDXW-8连接，用EcoR I酶切去除包含Nco I在内的大部分XXXlysC片段，得到去除Nco I切点的pDXW-8X。
⑤EcoR 1-asd-dapA*-lysC*-EcoR I 和 pDXff-8X 用 EcoR I 进行连接，命名为pDXW-8X-asd-dapA*-lysC*，并以之为模板，用 SEQ ID N0:11 和 SEQ ID NO:12 为引物，PCR得到 Ptac-asd_dapA*-lysC*。
⑥Ptac-asd-dapA*-lysC*片段和pDXW-8的连接通过BamH I和Xba I进行连接，获得 pWG-aAC。
⑦以pUC19-ddh-ppc 为模板，SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:8 为引物，PCR 得到ddh-ppc ；ddh-ppc和pWG-aAC通过Nco I单切点进行连接,得到表达质粒pWG-aACPD。
实施例3大肠杆菌JNU-1I/pWG-aACPD基因工程菌的构建
(I)大肠杆菌JNU-1l感受态制备
①接单菌于相应抗性的15mL LB培养基,于合适温度下隔夜培养；
②按I %的接种量转接于新鲜的IOOmL液体LB培养基(如需要，则加入L-阿拉伯糖进行诱导)，于合适温度下培养至0D600约为0.5 ；
③冰上冷却IOmin, 4V, 5, 000r/min离心IOmin,丢弃上清，收集菌体；
④用20mL预冷的10 %甘油洗涤4次；
⑤用ImL 10%甘油重悬后，取合适体积的感受态细胞和适量pWG-aACPD于Imm电击杯混勻，置冰IOmin ；
(2)转化
①1800V，5ms 电击一次， 电击参数:Tc (ms) 5，Volt(V) 1800, Cap (μ Fd) 25，Res(Q)200 ；
②立即加入预热到37°C的SOC培养基lmL，37°C复苏2h ；
③8，000 Xg离心lmin，留100 μ L，其余上清丢弃，吹吸混匀后涂布相应的抗性平板，37°C培养12h ；
④将长出的阳性转化子转接于LB液体培养基，培养12h后抽提质粒进行酶切鉴定是否为正确导入pWG-aACPD。
实施例4利用大肠杆菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌发酵生产L-赖氨酸
经液体种子培养基、液体摇瓶发酵培养基和发酵罐液体培养基对上述大肠杆菌JNU-11/pWG-aACPD基因工程菌进行培养，生产L-赖氨酸，其中，
①液体种子培养基(g/L):葡萄糖25，硫酸铵14，玉米浆45，KH2P040.5,MgSO4.7Η201，FeSO4.7Η20 0.01，MnSO4.4Η20 0.01、碳酸钙 40。种子培养基装液量 50mL/500mL，培养温度37°C，摇床转速100r/min，培养时间12h。
②液体摇瓶发酵培养基(g/L):葡萄糖40，硫酸铵40，玉米浆20，KH2PO40.5，MgS04*7H20 LFeSO4.7Η20 0.0LMnSO4.4Η20 0.01，生物素 0.1，甜菜碱 0.03，碳酸钙 40。液体摇瓶发酵培养基装液量25mL/500mL，培养温度37°C，摇床转速100r/min，发酵时间48h，接种量10%。
权利要求
1.用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于:包括解除了L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸- β -半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。
2.如权利要求
1所述的用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述解除了L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III的反馈抑制的天冬氨酸激酶III，从N端开始计算，该天冬氨酸激酶III催化亚基的第318位氨基酸由蛋氨酸变为异亮氨酸，第323位氨基酸由甘氨酸变为天冬氨酸；并且该二氢吡啶二羧酸合酶调节亚基的第118位氨基酸由组氨酸变为酪氨酸。
3.如权利要求
1所述的用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述天冬氨酸-β -半醛脱氢酶来源于大肠杆菌的编码天冬氨酸-β -半醛脱氢酶。
4.如权利要求
1所述的用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶来源于大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶。
5.如权利要求
1所述的用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA，其特征在于，所述二氨基庚二酸脱氢酶来源于棒状杆菌的二氨基庚二酸脱氢酶。
6.包含如权利要求
1-5中任一项所述重组DNA的表达质粒pWG-aACPD。
7.一种大肠杆菌，其特征在于，它包含如权利要求
1-5中任一项所述的重组DNA。
8.一种大肠杆菌，其特征在于，其特征在于，它是导入如权利要求
1-5中任一项所述的重组DNA或如权利要求
6所述的表达质粒pWG-aACPD而转化过的。
8.如权利要求
7或8所述大肠杆菌在发酵生产L-赖氨酸工艺中的应用。
9.一种生产L-赖氨酸的方法,其特征在于,包括在发酵培养基中对如权利要求
7或8所述的大肠杆菌进行培养以生产L-赖氨酸。
10.根据权利要求
9所述生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，所述培养温度在37°C，培养时间在48h以上。
专利摘要
本发明公开了一种用于发酵生产L-赖氨酸的重组DNA、菌株及其应用。该重组DNA包含解除了L-赖氨酸对天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶反馈抑制的编码天冬氨酸激酶III和二氢吡啶二羧酸合酶的DNA序列、编码天冬氨酸-β-半醛脱氢酶的DNA序列、编码二氨基庚二酸脱氢酶的DNA序列以及编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的DNA序列。该菌株包含导入上述重组DNA而转化过的大肠杆菌。本发明采用表达L-赖氨酸产生菌L-赖氨酸生物合成基因，能大大提高L-赖氨酸的产量；且根据控制发酵过程中的葡萄糖和硫酸铵浓度使L-赖氨酸的产量和糖酸转化率可得到进一步提高。
文档编号C12N15/54GKCN103215286SQ201210450748
公开日2013年7月24日 申请日期2012年11月12日
发明者张伟国, 宋灿辉, 钱和 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan