发明背景
技术领域：
本发明一般涉及分子生物学、免疫学、重组DNA技术和核酸扩增领域。更具体地，本发明涉及包含蜡组分的冻干生物试剂和这种试剂的用途。
背景技术：
：大多数生物试剂在环境温度下固有地不稳定。冻干(冷冻干燥)是可用于使生物试剂稳定以使得其可以在室温下长时间储存的一种方法。可以加入赋形剂如糖、蛋白质、聚合物、缓冲剂和表面活性剂来使冻干生物分子稳定。例如，Crowe等描述了通过糖来使干磷脂双层和蛋白质稳定(Biochem.J.242：1-10(1987))，并且还在“Thetrehalosemythrevisited：Introductiontoasymposiumonstabilizationofcellsinthedrystate”Cryobiology43，89-105(2001)中综述了对细胞的海藻糖稳定之机制的理解。生物试剂的冻干导致产生具有非常低的含水量(moisturecontent)(＜5％)的材料，并且如果其不是干燥储存的话，则冻干材料的功能受损。实现干燥储存条件可涉及使用二级储存容器(secondarystoragecontainer)、真空密封或低湿度储存设施或室。然而，这些储存机制可能是麻烦的。因此，需要可在环境温度和湿度下储存的稳定的冻干生物组合物。技术实现要素：在第一实施方案中，提供了稳定的冻干生物试剂的组合物，其包含含有至少一种生物试剂的冻干团块(pellet)，所述团块用蜡组分涂覆或浸渍。出乎意料地发现，蜡不会不利地影响冻干团块，而是通过减少或防止冻干团块的湿气吸收来保护冻干团块。此外，对于某些应用例如PCR，蜡在其熔化后从冻干团块离开并在水性PCR溶液上方形成层之后通过充当蒸发屏障提供额外的益处。在某些方面，一些实施方案的冻干团块包含两种、三种、四种或更多种不同的生物试剂。在某些方面，将一些实施方案的冻干团块提供在容器中，例如管或孔中。管可以是例如PCR管。孔可以是例如多孔板的孔。优选地，管或孔由基本上非反应性的材料(例如塑料)构成。在另外一些方面，提供了包含一些实施方案的多个冻干团块的板，使得每个团块设置在板的单独的孔中。因此，一些实施方案的一些方面涉及涂覆或浸渍在实施方案的冻干团块中的蜡组分。在一些方面，蜡组分可以包含动物蜡、植物蜡、矿物蜡或石油衍生蜡，或这些蜡的混合物。在另外一些方面，蜡可以包含纯化蜡或合成蜡(例如，聚乙烯或化学改性的蜡)。例如，一些实施方案的组合物可包含动物蜡，例如蜂蜡、中国蜡或虫胶。在另一些方面，组合物包含植物衍生蜡、例如杨梅蜡、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、蓖麻蜡、西班牙草蜡(espartowax)、日本蜡、霍霍巴木蜡、小冠巴西棕榈蜡(ouricurywax)、米糠蜡、大豆蜡或牛脂树蜡。在另外一些方面，蜡组分可以包含矿物蜡(例如，地蜡(ceresinwax或ozocerite))或石油蜡(例如石蜡、微晶蜡、二十二烷、硅氧烷蜡、Chill-outTM蜡或凡士林)。技术人员将认识到，蜡可以由多种不同的烃或经取代烃分子构成，或者可以基本上由单一种类的分子构成。在某些优选的实施方案中，蜡在储存条件(例如，在室温)下为固体，在相关生物/化学反应期间的至少一个温度下为液体。例如，如果冻干团块包含用于50℃的逆转录反应的试剂，则蜡优选具有低于50℃但高于冻干团块储存温度的熔化温度(meltingtemperature)。以这种方式，在加热到反应温度时蜡熔化，从冻干团块离开，使得试剂再水化。可以使用具有较高熔化温度的蜡，但是在较低温度下开始进行反应之前需要将其初始加热至高于反应温度以将蜡与冻干团块分离。在另外一些方面，蜡组分(涂覆或浸渍一些实施方案的冻干团块)由至少两种、三种或四种不同的蜡的混合物或者至少一种、两种或三种蜡和至少一种、两种或三种油的混合物构成。在一些方面，蜡组分由二十二烷和聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)油构成。例如，在一些方面，蜡组分可包含按体积计约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或由其可得到的任何范围的二十二烷，和余量的PDMS油(即50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％或由其可得到的任何范围的PDMS油)。任选地，蜡组分可以包含二十二烷、石蜡和PDMS油。例如，在一些方面，蜡组分可以包含按体积计约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％或35％或由其可得到的任何范围的的二十二烷；按体积计约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％或35％或由其可得到的任何范围的石蜡；和余量的PDMS油。在一些方面，蜡组分包含二十二烷和矿物油。例如，在一些方面，蜡组分可包含按体积计约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或由其可得到的任何范围的二十二烷，和余量的矿物油(即50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％或由其可得到的任何范围的PDMS油)。任选地，蜡组分可包含二十二烷、石蜡和矿物油。例如，在一些方面，蜡组分可以包含按体积计约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％或35％或由其可得到的任何范围的二十二烷；按体积计约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、30％或35％或由其可得到的任何范围的石蜡；和余量的矿物油。根据一些实施方案使用的某些蜡组分包括但不限于(以体积百分比计)：(1)25-35％二十二烷和65-75％PDMS油；(2)10-45％二十二烷、5-35％石蜡和25-75％PDMS油；或(3)10-45％二十二烷、25-55％石蜡和25-40％矿物油。根据实施方案使用的一些具体的蜡组分包括但不限于(以体积百分比计)：(1)30％二十二烷和70％PDMS油；(2)15％二十二烷、15％石蜡和70％PDMS油；(3)42％二十二烷、28％石蜡和30％PDMS油；(4)38.5％二十二烷、31.5％石蜡和30％PDMS油；(5)22.5％二十二烷、7.5％石蜡和70％PDMS油；或(6)20％二十二烷、10％石蜡和70％PDMS油。在某些方面，可以使用蜡和油的组合，例如石蜡、二十二烷和矿物油。例如，石蜡、二十二烷和矿物油可以以30∶40∶30或50∶15∶35的比例组合。可以首先制备蜡的共混物，然后将其作为共混蜡团块加入冻干材料(例如，然后通过加热将共混蜡团块熔化)。蜡的共混物也可以首先熔化，然后添加到冻干材料的上方。在另一些方面，可以使用蜡和油的组合，例如二十二烷和矿物油。在一些方面，矿物油可以添加到蜡覆盖的冻干饼的上方。例如，可以将至少1μL的油添加到蜡覆盖的冻干饼的上方。在另外一些方面，将约5-15μL的油添加到蜡覆盖的冻干饼的上方。在另外一些方面，可以使用双层蜡，其中一种蜡在室温下为固体，并且第二种蜡在室温下为液体。例如，可以将二十二烷蜡添加到冻干材料的上方，然后熔化以产生蜡浸渍的冻干饼(lyocake)。在另一些方面，将在低于室温(例如，14℃以下)为固体且在室温下为液体的蜡(例如Chill-outTM蜡)添加到蜡浸渍的冻干饼的上方，从而允许液体蜡在冻干饼周围形成密封。在一些方面，可以使用双层蜡，其中一种蜡在室温下为液体，并且第二种蜡在室温下为固体。例如，可以将在低于室温(例如，14℃以下)为固体且在室温下为液体的蜡(例如Chill-outTM蜡)加入到冻干材料的上方以浸渍冻干饼，然后可以将二十二烷蜡加入到上方并熔化以在冻干饼和液体蜡上形成密封。在另外一些方面，可以使用双层密封方法，其中将矿物油(比蜡密度更高的材料)添加到冻干材料的上方，使得其浸渍冻干饼，然后可以将二十二烷蜡(比油密度更低的材料)添加到上方并熔化以在冻干饼和矿物油上形成密封。在某些实施方案中，蜡是熔点在约5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃或40℃至约40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃之间的那些。对于给定的应用，本领域技术人员可以选择具有适当熔化温度的蜡，因为蜡的熔化温度容易获得和/或容易确定。在一些优选的方面，根据一些实施方案使用的蜡的比重小于水性液体的比重。在另外一些方面，蜡与湿(即，在冻干之前)试剂或冻干团块的体积：体积比例为1∶5至5∶1，1∶4至4∶1，1∶3至3∶1，或1∶2至2∶1。在一些优选的方面，蜡组分比试剂的量大于1∶4或大于1∶3(例如大于1∶2.5)。在另外一些方面，包含实施方案的冻干团块的组合物具有小于约10％的水含量。例如，水含量可以小于5％、4％、3％、2％或1％。在某些方面，水含量为约0.1％至5％。因此，一些实施方案的某些方面涉及生物试剂，例如包含在冻干团块中的生物试剂。在一些方面，生物试剂是多核苷酸，例如DNA、eDNA或RNA(例如，信使RNA(mRNA)、小干扰RNA(siRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA)。在另外一些方面，生物试剂是多肽。在一些方面，生物试剂是治疗性试剂或测定试剂。在一些优选的方面，一些实施方案的生物试剂是多肽，例如酶、配体或抗体。在某些方面，酶可以是DNA甲基转移酶或核酸酶，如DNA酶、RNA酶(例如，RNA酶A，RNA酶H(或RNA酶H-2)RNA酶I、RNA酶III、RNA酶L、RNA酶P、RNA酶PhyM、RNA酶T1、RNA酶T2、RNA酶U2或RNA酶V)、外切核酸酶或限制性内切核酸酶(例如甲基化敏感的限制性内切核酸酶)。在另外一些方面，酶是聚合酶，例如RNA聚合酶、DNA聚合酶或逆转录酶。在一些具体实例中，酶是Taq聚合酶或Klenow聚合酶。在另一些实例中，生物试剂是连接酶(例如，T4DNA连接酶)。在一些实施方案的另外一些方面，冻干团块可以包含另外的组分，例如缓冲剂、盐、标记和/或酶辅因子。例如，在某些方面，一些实施方案的冻干团块包含除了模板核酸分子(和水)之外进行聚合酶链式反应(PCR)或逆转录-PCR所需的所有组分。在一些方面，冻干团块还可以包含至少一种寡核苷酸引物或至少一种引物对。在另外一些方面，冻干团块包含至少2、3、4、5、6、7、8、9或10种引物或引物对(例如，用于进行多重PCR反应)。在某些方面，冻干团块还可以包含缓冲剂(例如HEPES、MES、MOPS、TRIS或BIS-TRIS丙烷)和/或核苷三磷酸(NTP)(例如dATP、dGTP、dCTP、TTP、UTP或其组合)。在某些方面，冻干团块还包含至少第一经修饰NTP，例如异碱基(isobase)(例如异G或异C)、标记的核苷酸(例如，dabcycldiGTP、生物素-diTTP、荧光标记的核苷酸(fluor-labelednucleotide)或淬灭剂标记的核苷酸)。在另外一些方面，一些实施方案的冻干团块包含至少一种标记(即有助于分子例如核酸序列的检测的分子)。例如，标记可以共价连接到核苷酸或插入染料。可以根据一些实施方案使用的许多标记分子是已知的，包括但不限于荧光团、发色团和放射团(radiophore)。荧光团的非限制性实例包括红色荧光方酸染料(squarinedye)如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚啉基甲基]环丁烯二-1，3-二氧戊环，红外染料如2，4-双[3，3-二甲基-2-(1H-苯并[e]二氢亚吲哚啉基甲基)]环丁烯二-1，3-二氧戊环，或橙色荧光方酸染料如2，4-双[3，5-二甲基-2-2-吡咯基]环丁烯二-1，3-二氧戊环。荧光团的另外的非限制性实例包括量子点、磺化香豆素、罗丹明、呫吨或花青染料(例如AlexaFluorTM染料)、氨基甲基香豆素(Aminomethylcoumarin，AMCA)、硼-二吡咯亚甲基(BODIPYTM)、花青(Cy2TM)或花青衍生物，如吲哚羰花青(Cy3TM)或吲哚二羰花青(Cy5TM)、DNA插入染料、6-羧基荧光素(6-FAMTM)、荧光素、亚磷酰胺(HEXTM)、6-羧基-4′，5′-二氯-2′7′-二甲氧基荧光素、琥珀酰亚胺酯(6-JOETM)，藻胆蛋白，包括但不限于藻红蛋白和别藻蓝蛋白，罗丹明衍生染料、四甲基罗丹明或呫吨衍生物(例如OregonGreenTM或TexasRedTM)。在一些方面，信号放大试剂如酪胺(PerkinElmer)可用于增强荧光信号。预期根据一些实施方案使用的间接标记分子包括但不限于生物素，其必须与另一分子结合，例如用于检测的链霉亲和素-藻红蛋白。也可以使用标记对，例如荧光共振能量转移对或染料-淬灭剂对。在一些方面，一些实施方案的冻干团块还包含糖(例如，单糖、寡糖或多糖)或糖的混合物。在某些方面，糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖、阿拉伯糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、己糖、艾杜糖、甘露糖、塔罗糖、庚糖、果糖、葡萄糖酸、山梨醇、甘露醇、甲基α-吡喃葡萄糖苷、麦芽糖、异抗坏血酸、抗坏血酸、内酯、山梨糖、葡糖二酸、赤藓糖、苏糖、阿洛糖、阿卓糖、古洛糖、赤藓酮糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸(galacturonan)、甘露糖醛酸、葡糖胺、半乳糖胺、神经氨酸、阿拉伯聚糖、果聚糖、岩藻多糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖、左聚糖(levan)、岩藻多糖、角叉菜胶、半乳卡洛糖(galactocarolose)、果胶、果胶酸、直链淀粉、短梗霉聚糖、糖原、支链淀粉、纤维素、葡聚糖、环糊精、石耳葡聚糖(pustulan)、几丁质、琼脂糖、角蛋白、软骨素、皮肤素(dermatan)、透明质酸、藻酸、黄原胶或淀粉、或这些糖中的两种或更多种的组合。在一些具体方面，糖是海藻糖、葡聚糖、甘露醇、蔗糖、棉子糖或其组合。糖的示例性组合包括但不限于海藻糖和葡聚糖，甘露醇和葡聚糖，或者海藻糖和甘露醇。例如，在某些方面，冻干团块包含生物试剂和按体积计约1％至约30％的糖(例如，约1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、9％、10％、11％、12％、13％或15％的糖至约20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、29或30％的糖)的水性混合物形成。在某些具体方面，冻干团块由包含约1-10％海藻糖和/或约1-10％葡聚糖(例如约5％海藻糖和约5％葡聚糖)的水性混合物形成。在另外一些方面，一些实施方案的冻干团块还包含稳定剂(例如蛋白稳定剂，例如牛血清白蛋白(BSA)或明胶)。在某些具体方面，一些实施方案的冻干团块由包含约0.1至约1.0mg/ml的多肽稳定剂例如BSA的水性混合物形成。例如，团块可以由包含约0.5mg/mlBSA的水性混合物形成。在一些方面，蜡稳定的冻干团块还可以包含至少一个固体物体。固体物体可有助于在蜡熔化之后蜡层和水性层的倒置(inversion)和/或在蜡熔化之后使冻干试剂混合或分散到水性溶液中。固体物体可以定位在蜡稳定的冻干团块的上方，蜡稳定的冻干团块的下方或甚至蜡稳定的冻干团块内。在一些方面，固体物体可以包埋在与冻干团块结合的蜡中。固体物体可以是例如球形(即“球”)、盘形或杆形。固体物体优选由对旨在用于冻干团块中的生物试剂的反应条件呈惰性的材料制成或至少涂覆有该材料。在某些方面，固体物体可以包括陶瓷、玻璃、塑料(例如，聚苯乙烯、聚乙烯、聚乙烯、聚丙烯、氯丁橡胶、聚(四氟乙烯))或金属(例如，不锈钢)。在一个实施方案中，固体物体是已被钝化以从其表面去除游离铁或其他夹杂物(inclusion)的不锈钢物体。不锈钢可以通过例如一系列酸浴钝化，所述酸浴从表面清除游离铁或其他夹杂物，并形成保护不锈钢免受腐蚀的均匀的自然氧化物层。在某些方面，固体物体是磁性的或磁性响应的。当蜡稳定的冻干团块包括固体物体的目的是促进蜡和水性层的倒置和/或将冻干的试剂混入水性溶液中时，固体物体应具有适当的尺寸以在考虑容器的尺寸和形状的情况下实现这些功能。在某些方面，固体物体可以在其最长尺寸中具有约0.5mm至约5mm或约1mm至约2mm的直径或长度。在一些方面，水性液体可以具有比固体物体小的比重。在一些替代方面，水性液体可具有比固体物体大的比重。在另一个实施方案中，本文提供了进行酶促反应的方法，其包括：(a)在容器中将包含酶底物和根据一些实施方案的蜡涂覆(或浸渍)的冻干团块组合，其中所述蜡涂覆的冻干团块包含酶；(b)熔化所述蜡；和(c)在有利于酶促反应的条件下孵育所述混合物，从而进行酶促反应。在一个方面，该方法还可以包括在步骤(c)之前和/或与步骤(c)同时混合反应溶液。在一些情况下，混合可以通过搅拌容器(例如，管或孔)、通过声处理、通过移液或通过蜡的移动(例如，通过在蜡熔化时蜡层和水层的倒置)或容器中固体物体的移动(例如，通过重力或磁性吸引)进行。在又一个实施方案中，本文提供了进行PCR或逆转录PCR的方法，其包括：(a)在容器中将包含核酸和任选的一种或更多种另外的RT-PCR或PCR试剂的水性液体与根据一些实施方案的蜡涂覆(或浸渍)的冻干团块组合，其中蜡涂覆的冻干团块包含在水性液体中不提供的任何RT-PCR或PCR试剂(条件是蜡涂覆的冻干团块包含至少一种在水性液体中不存在的RT-PCR或PCR试剂)；(b)熔化所述蜡；(c)任选地，进行至少一个逆转录循环和(d)进行至少一个PCR循环。在一个方面，所述方法还可以包括在步骤(c)或步骤(d)之前混合反应溶液。在另外一些方面，所述方法包括进行定量PCR反应或对PCR的产物进行量化。在一些情况下，混合可以通过搅拌容器(例如，管或孔)、通过声处理、通过移液或通过蜡的移动(例如通过熔化蜡)或容器中固体物体的移动(例如，通过重力或磁引力)进行。在一些方面，一些实施方案的方法可以包括在将冻干团块与水性液体组合之前熔化冻干团块的蜡组分。在一些方面，可以预加热水性液体，并且通过将预加热的水性液体与蜡涂覆的冻干团块组合来熔化蜡。在另一些方面，用于一些实施方案的方法中的蜡组分位于冻干团块的下方，并且具有比水性液体更小的比重。因此，在某些方面，可以通过熔化蜡并使其迁移通过水性液体来混合反应。在另外一些方面，一些实施方案的方法还包括在反应混合后(例如通过反应中固体物体的移动)测量水性液体的均匀性。因此，在一些方面，如果未确定水性液体足够均匀，则进行一个或更多个额外的混合步骤。在一些具体方面中，例如，测量水性液体的均匀性包括测量水性液体中的荧光标记的荧光信号。在另一些方面，实施方案的方法包括使用包含固体物体的组合物。在一个方面，方法还可以包括通过诱导固体物体的移动(例如通过磁性或重力)来混合水性液体(和/或熔化的蜡组分)。在某些方面，固体物体可以是磁性的或磁性响应的固体物体，并且可以通过磁体诱导固体物体的移动。例如，固体物体可以是可以通过磁体移动的不锈钢球、盘或杆。在一些方面，固体物体可以从容器的底部移动到水性液体/蜡界面的两倍固体物体直径以内的位置，并且固体物体不接触水性液体/蜡界面。在某些方面，固体物体仅移动一次以完成混合。在另一些方面，固体物体可以重复移动，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30或更多次。在又一个实施方案中，提供了制备稳定的冻干生物试剂的组合物的方法，包括：(a)冻干所述生物试剂(例如，生物试剂的水性混合物)；以及(b)形成接触和包围所述冻干生物试剂的蜡屏障以形成生物试剂的稳定的冻干团块。在一些方面，形成蜡屏障包括添加固体蜡，然后熔化蜡。在另一些方面，蜡以熔融(液体)形式添加。在某些方面，形成蜡屏障可以包括在生物试剂冻干之前将生物试剂和蜡组合。因此，在一些方面，蜡可以在冻干机中熔化。在一些另外的方面，形成蜡屏障可以包括：(a)将冻干生物试剂和固体蜡组合；和(b)熔化所述固体蜡以形成液体蜡。在某些方面，固体蜡的熔化可以使用加热块(heatblock)、烘箱或微波进行。在某些方面，固体蜡的熔化可以在真空下进行。在一些方面，形成蜡屏障可以包括将冻干生物试剂和液体蜡组合。在某些方面，所述方法还可以包括加热冻干生物试剂和液体蜡。在多个方面，方法还可以包括对冻干生物试剂和液体蜡施加真空。在某些方面，所述方法还可以包括使蜡固化。在一些方面，所述方法还可以包括将固体物体放置在稳定的冻干生物试剂的上方。在另外一些方面，所述方法还可以包括将固体物体放置在稳定的冻干生物试剂的下方。在一些方面，所述方法还可以包括将固体物质包埋在包围所述稳定的冻干生物试剂的蜡中或将固体物质包埋在冻干团块中。在多个方面，固体物体可以是陶瓷固体物体、聚合物固体物体、玻璃固体物体、磁性固体物体或金属固体物体。在另一个具体实施方案中，提供了制备稳定的冻干PCR或RT-PCR试剂的组合物的方法，包括：(a)将固体物体和一种或更多种PCR(或RT-PCR)试剂在容器组合；(b)在所述固体物体存在下冻干所述一种或更多种冻干试剂和所述一种或更多种PCR试剂，以形成冻干PCR试剂；(c)向所述冻干PCR试剂中加入蜡；(d)熔化所述冻干PCR试剂和所述固体物体周围的蜡；和(e)使所述蜡重新固化以形成稳定的冻干PCR试剂。在一些方面，冻干试剂可以包含一种或更多种上述糖和稳定剂。在一些具体实施方案中，冻干试剂可以包含海藻糖、葡聚糖、甘露醇、蔗糖、棉子糖或其组合中的一种或更多种。在一些方面，PCR试剂可以包含聚合酶、逆转录酶、引物或核苷三磷酸中的一种或更多种。在一些方面，蜡是石蜡、二十二烷或硅酮蜡、植物蜡或其组合。如本文所使用，就特定组分而言，“基本上不含”在本文中用于指特定组分中没有一个被有目的地配制到组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非故意污染产生的特定组分的总量远低于0.05％，优选低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不能检测到特定组分之量的组合物。如本文在说明书和权利要求书中所使用的，未用数量词限定的名词可以表示一个或更多个。如本文在说明书和权利要求书中所使用的，当与词语“包括/包括”结合使用时，未用数量词限定的名词可以表示一个或多于一个。如本文所使用的，在说明书和权利要求中，“另一个”或“又一个”可以表示至少第二个或更多个。如本文在说明书和权利要求中所使用的，术语“约”用于表示值包括设备、用于确定该值之方法固有的误差变化，或者存在于研究对象之间的变化。从下面的详细描述中，本发明的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应当理解，虽然指示本发明的某些实施实施方案，但是详细描述和具体实例仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，本发明的精神和范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得明显。附图说明以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括以进一步说明本发明的某些方面。参考这些附图中的一个或更多个并结合本文给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。图1：图示出了甲型流感模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线和解链曲线(meltcurve)结果。使用冻干PCR试剂饼获得曲线，所述试剂饼用二十二烷蜡覆盖(曲线表示为A1、B1、A2、和B2)；用Chill-outTM蜡覆盖(A3、B3、和A4)；或没有添加蜡组分(曲线表示为F1、F2、F3和F4)。图2：图示出了甲型流感模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线和解链曲线结果。使用用熔化的石蜡覆盖的冻干PCR试剂饼获得曲线(曲线表示为A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11、和A12)；或者使用临PCR循环前配制的非冻干(“湿”)PCR试剂获得曲线(曲线表示为A1和A7)。图3：图示出了甲型流感模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线和解链曲线结果。使用用二十二烷蜡团块覆盖的冻干PCR试剂饼获得曲线(曲线表示为A2、A3、A4、A5、A6、A8、A9、A10、A11、和A12)；或使用临PCR循环前配制的非冻干(“湿”)PCR试剂获得曲线(曲线表示为A1和A7)。4：图示出了甲型流感模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线和解链曲线结果。使用用熔化的二十二烷蜡覆盖的冻干PCR试剂饼获得曲线(曲线表示为A1、A2、和A3)；或使用临PCR循环前配制的非冻干(“湿”)PCR试剂获得曲线(曲线表示为A4、A5、和A6)。图5A-D：图5A-B，图示出了由小鼠肝炎病毒(MouseHepatitisVirus，MHV)RNA和DNA的实时PCR扩增得到的Ct(A)和TM(B)值。从左至右各图示出了使用以下获得的结果：临PCR循环之前配制的非冻干(“湿对照”)PCR试剂；未添加蜡组分的冻干饼中的PCR试剂(“冻干对照”)或熔化的二十二烷蜡覆盖的冻干饼中的PCR试剂(“具有蜡”)。图5C，图示出了甲型流感模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线和解链曲线结果。曲线由冻干PCR试剂饼获得，所述饼保持未处理(A4)或用10μl(A3)、15μl(A2)、20μl(A1)量的熔化的二十二烷蜡覆盖并且在高湿度条件下孵育。使用非冻干(“湿”)PCR试剂的对照反应的曲线标记为A5和A11。未经受高湿度的冻干PCR试剂饼的曲线标记为A6。图5D示出了暴露于高湿度条件的如所示具有或不具有蜡组分的冻干PCR试剂饼。图6A-B：图6A示出了覆盖有陶瓷球的冻干PCR试剂饼(左图)和通过缓冲液添加再水化使得陶瓷球迁移到管底部的PCR试剂饼(右图)。图6B，图示出了MHV模板核酸的实时PCR扩增曲线的扩增曲线和解链曲线结果。结果表示从冻干PCR试剂饼获得的曲线，所述饼被熔化的二十二烷蜡覆盖且覆盖有陶瓷球(虚曲线)；或用临PCR循环之前配制的非冻干(“湿”)PCR试剂获得的曲线(实曲线)。图7A-B：图7A示出了在不锈钢球上冻干且覆盖有熔化的二十二烷蜡的PCR试剂饼(左图)和在蜡倒置后通过缓冲液添加再水化的PCR试剂饼(右图)。图7B，图示出了使用三种不同的荧光通道FAM(上方图)、AP593(中间图)和AP559(下方图)的诺如病毒(Norovirus)模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线(左图)和解链曲线(右图)结果。使用以下获得曲线：(1)包含不锈钢球且手工混合的非冻干(“湿”)的PCR试剂(描绘为曲线#1)；(2)没有蜡组分且未混合的冻干PCR试剂饼(描绘为曲线#2)；(3)没有蜡组分但包含不锈钢球的手工混合的冻干PCR试剂饼(描绘为曲线#3)；(4)没有蜡组分但包含不锈钢球的磁性混合的冻干PCR试剂饼(描绘为曲线#4)；(5)覆盖熔化的二十二烷蜡且包含不锈钢球的未混合的冻干PCR试剂饼(描绘成曲线#5)；(6)覆盖熔化的二十二烷蜡且包含二十二烷蜡的磁性混合的冻干PCR试剂饼(描绘为曲线#6)。图8：图示出了HSV模板核酸的实时PCR扩增的扩增曲线(左图)和解链曲线(右图)结果。结果表示使用以下获得的曲线：(1)未混合的非冻干(“湿”)PCR的试剂(描绘为曲线#1)；(2)覆盖有熔化的二十二烷蜡且包含陶瓷球的未混合的冻干PCR试剂饼；和(3)覆盖有熔化的二十二烷蜡且包含陶瓷球的磁性混合的冻干PCR试剂饼(描绘为曲线#3)。图9A-C：图9A-C示出了诺如病毒RNA的实时PCR扩增的扩增曲线(左图)和解链曲线(右图)结果。将覆盖有25μL二十二烷蜡(9A)或者二十二烷蜡覆盖后接着15μLChilloutTM蜡(9B)或者二十二烷蜡覆盖后接着15μL矿物油(9C)的冻干PCR试剂饼储存在80％相对湿度室中(虚线)或密封干燥室中(实线)。结果表明，二十二烷或者chillout蜡覆盖的二十二烷或这矿物油覆盖的二十二烷提供了有效的隔汽层(vaporbarrier)。图10：图示出了诺如病毒RNA的实时PCR扩增的结果。将覆盖有30μL二十二烷蜡或二十二烷蜡覆盖后接着矿物油的冻干PCR试剂饼，或者覆盖有30μL蜡的共混物(石蜡：二十二烷蜡：矿物油的比例为30：40：30)的冻干PCR试剂饼，或者覆盖有30μL石蜡的冻干PCR试剂饼储存在干燥的箱中(T1对照)或储存在环境条件下(T1环境)或存储在80％相对湿度室中(T180％)。覆盖有30μL二十二烷蜡且储存在80％相对湿度室中的冻干PCR试剂饼不产生任何PCR扩增结果。说明性实施方案的描述生物试剂在环境温度下固有地不稳定，常常利用糖通过冻干来稳定化。冻干任何生物材料(核酸/蛋白质/脂质/碳水化合物)导致产生冻干饼或团块，需要保护其免受湿气。本发明的实施方案提供了保持生物分子被保护免受环境湿气的解决方案。一旦冻干材料从冻干机中取出，蜡提供了防止或抑制湿气接近冻干生物材料的屏障。这可以通过在从冻干机中取出后使用例如加热块或烘箱或真空烘箱熔化冻干饼上的蜡，或者通过在冻干饼上施用液体形式的蜡来实现。或者，在蜡的存在下冻干生物试剂并且在冻干循环完成时在冻干机内熔化蜡也允许产生被保护免受大气湿气的冻干饼。冻干过程涉及在真空下通过升华从冷冻的生物材料/试剂中除去水。可以添加糖和稳定剂以帮助保持蛋白质和其他生物材料的结构，以使生物材料的功能活性不受到损害。因此，在一个方面，本公开内容提供了通过使冻干材料与蜡接触来提高冻干试剂的稳定性的方法。例如，蜡可以以一定方式加入，以使得蜡形成围绕冻干材料的层，或使得冻干材料被蜡组分浸渍。优选地，该蜡在环境温度固化并形成围绕冻干材料防止与环境有任何湿气交换的屏障。重要的是，本文提出的研究表明，这种冻干蜡组合物能够保持制剂中的组分的生物活性。特别是，研究表明，用于PCR的试剂可以以蜡冻干形式可靠地储存，并且例如，聚合酶的活性不仅保持，而且保持足够的活性以提供靶核酸的定量扩增。因此，该研究表明，对反应中的污染物敏感的蛋白质，甚至是酶(例如聚合酶)可以在冻干蜡剂型中储存并保持高活性。因此，包含蜡组分的冻干制剂可用于储存大范围的生物活性分子，例如酶和抗体，同时有效地保持了分子的生物活性。在某些具体的方面，实施方案的蜡制剂可以包含用于执行PCR循环的试剂。这种制剂可以通过将添加蜡作为冻干过程的一部分或者在冻干后用蜡(例如，熔融蜡)覆盖冻干试剂饼来产生。在这个方面，储存之后，在PCR循环之前或与PCR循环同时熔化蜡，并且冻干试剂与添加的待扩增靶分子接触。因此，在某些情况下，蜡也用作PCR过程中隔汽层，防止从反应中蒸发。此外，PCR循环后，蜡可固化并产生对潜在的扩增污染物的完全或部分的屏障。I.用于配制冻干组合物的试剂在某些方面，提供了冻干团块，其包含生物试剂和蜡组分(例如，涂覆该团块)，例如低温熔化蜡。如本文所使用的术语“冻干团块”或“冻干饼”可互换使用并且是指具有大幅降低的含水量的材料块，例如降低至小于约5％的水。例如饼或团块可以是任何形状或尺寸。如本文所使用的低温熔化蜡是熔点为约25℃至75℃的蜡材料。蜡材料可具有比正常人体温稍高的熔点，即约37℃至45℃。实例蜡材料包括直链烷烃，例如正二十二烷、正二十烷及其混合物。正二十二烷和正二十烷的熔点分别为约42-45℃、36-38℃。其他示例性的蜡材料是石蜡和硅酮蜡。硅酮蜡特性类似于典型烃蜡，在于其在一些明确定义的温度范围(通常稍高于室温)内经历从固体到粘性液体的相转变。在一些方面，本发明的蜡覆盖的团块可以包含固体物体(例如，球、盘或杆)或者团块上方可能放置有固体物体。这样的固体物体可以是例如陶瓷球、磁性球、金属球(例如，不锈钢)或玻璃球。球可以例如具有约0.5mm至约10mm的直径。许多糖使溶液中的生物分子稳定，并给予分离的细胞和生物分子以保护。因此，在一些方面，本发明的蜡覆盖的团块可以包含糖类，例如糖和多元醇(例如，海藻糖、葡聚糖、甘露醇、蔗糖和棉子糖)来改善生物分子的稳定性并延长保质期。糖可以组合使用，例如，海藻糖和葡聚糖，甘露醇和葡聚糖，或海藻糖和甘露醇。不受理论的束缚，对于糖的稳定作用的机制有两个主要理论：1)糖赋形剂用于稀释固体状态的蛋白质，从而降低蛋白质-蛋白质相互作用并防止分子降解，如聚集，以及2)糖赋形剂提供玻璃状基质，其中蛋白质的移动性最小化并且因此反应性最小化。在这两种机制中，认为重要的是糖保持无定形的蛋白质接触相。各种环境因素，如温度和湿度的提高可诱发糖结晶。此外，惰性蛋白质也可用于稳定生物分子。惰性蛋白是指不干扰酶活性的天然存在的或合成的肽或多肽或其混合物。不限制本发明的范围的实施是球蛋白、白蛋白(例如，牛血清白蛋白)、胶原及其衍生物。蛋白质优选以超过0.01mg/ml、超过0.05mg/ml和超过0.1mg/ml的浓度存在。优选的浓度不超过2mg/ml。在一个优选的实施方案中，惰性蛋白质是牛血清白蛋白(BSA)及其衍生物和片段。其片段超过天然存在的BSA的长度的50％，超过天然存在的BSA的长度的60％，超过天然存在的BSA的长度的70％，超过天然存在的BSA的长度的80％，超过天然存在的BSA的长度的90％，最优选地超过天然存在的BSA的长度的95％。在一些方面，本发明的蜡覆盖的团块可以包含适合与冻干生物分子一起使用的一种或更多种缓冲剂。这样的缓冲剂包括，例如双-三丙烷(bis-trispropane，BTP)和Tris。在多个方面，一些实施方案的蜡覆盖的团块将含有至少一种生物试剂，例如多肽。这样的生物试剂包括，例如酶(例如，DNA聚合酶、Taq聚合酶、逆转录酶、RNA聚合酶、Klenow聚合酶、连接酶、RNA酶H-2)、核酸分子(例如，引物或探针)和抗体。在一些方面中，可以存在用于PCR的扩增混合物的多种组分。在另一些方面，一些实施方案的冻干团块可以包含完整核酸杂交反应所需的组分。在另一些方面中，团块中包含完整蛋白质结合杂交或蛋白质-蛋白质相互作用所需的组分包含在团块中。聚合酶链式反应(PCR)是广泛用于分子生物学以通过体外酶促复制来扩增一段DNA的技术。通常，PCR应用采用热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。这种DNA聚合酶使用单链DNA作为模板和DNA引物以引发DNA合成来从核苷酸(dNTP)酶促组装新的DNA链。一个基本的PCR反应需要若干组分和试剂，包括：含有待扩增的靶序列的DNA模板；一种或更多种引物，其与靶序列5′和3′端的DNA区域互补；DNA聚合酶(例如，Taq聚合酶)，其优选地具有约70℃的最适温度；脱氧核苷三磷酸(dNTP)；缓冲溶液，提供用于最佳DNA聚合酶活性和稳定性的合适的化学环境；二价阳离子，通常为镁离子(Mg2+)；和单价阳离子钾离子。扩增混合物可以包含天然核苷酸(包括A、C、G、T和U)和非天然的或非标准核苷酸(例如，包括异C、异G、标记的核苷酸、dabcycldiGTP、生物素diGTP)。DNA和RNA寡核苷酸分别包含通过磷酸二酯键偶接的脱氧核糖或核糖。每个脱氧核糖或核糖包括偶接到糖的碱基。并入到天然存在的DNA和RNA中的碱基是腺苷(A)、鸟苷(G)、胸苷(T)、胞嘧啶(C)和尿苷(U)。这五种碱基是“天然碱基”。根据由沃森和克里克阐述的碱基配对原则，天然碱基杂交形成嘌呤-嘧啶碱基对，其中G与C配对，A与T或U配对。这些配对原则促进寡核苷酸与互补寡核苷酸的特异性杂交。如本文所使用的“核酸”是指单链或双链的DNA或RNA，及其任何化学修饰。修饰包括但不限于，提供向核酸配体碱基或核酸配体整体引入额外电荷、极性、氢键或静电相互作用的其他化学基团的那些修饰。这样的修饰包括但不限于2′-位糖修饰、5-位嘧啶修饰、8-位嘌呤修饰、环外胺修饰、4-硫尿苷取代、5-溴或5-碘-尿嘧啶取代、骨架修饰和甲基化。因此，本文所述的核酸不仅包括标准碱基腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)，还包括非标准或非天然核苷酸。非标准或非天然核苷酸还包括形成非天然氢键碱基对的碱基(例如，异碱基)。“非标准核苷酸”或“非天然核苷酸”是指A、G、C、T或U以外的碱基，其易并入到寡核苷酸中，且通过氢键或通过疏水、熵或范德华相互作用与互补的非标准或非天然核苷酸形成碱基对。一些实例包括异-C/异-G、K/X、K/P、H/J和M/N的磁基对组合，如美国专利No.6037120中示出，其通过引用并入本文。用于寡核苷酸的其他非标准核苷酸包括，例如萘、菲和芘衍生物，如例如在以下文献中讨论的：Ren等，J.Am.Chem.Soc.1996，118：1671和McMinn等，J.Am.Chem.Soc.1999，121：11585，两者都通过引用并入本文。这些碱基不是利用氢键来稳定，而是依靠疏水或范德华相互作用形成碱基对。在一些方面，在其氢键模式中与天然存在的碱基(A、T、C、G和U)不同的非天然碱基可以并入本文所述的引物和探针。一个实例是异C和异G碱基，其彼此形成氢键，但不是与天然碱基形成氢键。在引物和/或探针中并入这些非天然型碱基可用于减少非特异性杂交。使用这样的非天然碱基测定靶核酸的方法在美国专利No.6,977,161和7,422,850中公开，其通过引用并入本文。在一个方面中，用于扩增靶核酸的两种靶特异性引物中的至少一种包含至少1、2、3或4个非天然碱基，并且扩增反应中包含互补的非天然碱基，使得扩增产物中包含非天然碱基。引物是能够在依赖于模板的过程中引起新生核酸的合成的核酸。靶特异性引物指的是已被设计为引起特定靶核酸的合成的引物。引物对是指两种引物，即通常称为正向引物和反向引物，其被设计为扩增模板核酸分子上两种引物的结合位点之间的靶序列。在某些实施方案中，引物具有长度为10-40、15-30或18-26个核苷酸的靶特异性序列。探针是能够与互补核酸杂交的核酸。靶特异性探针是指被设计成与特定靶核酸杂交的探针。存在于反应中的探针可以包括封闭的3′羟基，以防止通过聚合酶延伸探针。3′羟基可以用例如磷酸基团、3′反向dT、核糖核苷酸或标记来封闭。可以选择高严格性杂交条件，这将仅允许完全互补的序列之间的杂交。如本文所使用的，“标记”是可用于标记核酸的化学或生物化学部分。“标记”包括荧光剂、化学发光剂、生色剂、淬灭剂、放射性核素、酶、底物、辅因子、闪烁剂、抑制剂、磁性颗粒和本领域中已知的其他部分。“标记”能够产生可测量的信号，并且可以共价或非共价结合到寡核苷酸。可用于标记核酸的众多标记是已知的，包括但不限于荧光团、发色团和放射团。荧光团的非限制性实例包括，红色荧光方酸染料如2，4-双[1，3，3-三甲基-2-二氢亚吲哚啉基甲基]环丁烯二-1，3-二氧戊环，红外染料如2，4-双[3，3-二甲基-2-(1H-苯并[e]二氢亚吲哚啉基甲基)]环丁烯二-1，3-二氧戊环，或橙色荧光方酸染料例如2，4-双[3，5-二甲基-2-2-吡咯基]环丁烯二-1，3-二氧戊环。如本文所使用的，“荧光染料”或“荧光团”是指可以被光激发以发射荧光的化学基团。一些合适的荧光团可通过光激发以发射磷光。染料可以包括受体染料，其能够淬灭来自荧光供体染料的荧光信号。荧光染料或荧光团可包括已经被修饰以促进缀合到另一个反应性分子的衍生物。这样，荧光染料或荧光团可包括胺反应性衍生物，例如荧光团的的异硫氰酸酯衍生物和/或琥珀酰亚胺酯衍生物。如本文所使用的淬灭剂是在接近荧光部分时吸收并因此降低荧光部分的可视强度(apparentintensity)的部分。在一些方面，根据一些实施实施方案使用的淬灭剂以不同光谱发射吸收的荧光。因此，在一些方面，一些实施方案的检测方法使用滤波器，以减少或移除由淬灭剂所发出的荧光。在某些方面，淬灭剂是没有天然荧光的暗淬灭剂，因此不占用发射带宽。这样的暗淬灭剂是吸收来自荧光团的激发能并且将能量作为热量消散的物质。暗淬灭剂的实例包括但不限于Dabcyl、BlackHoleQuenchers、Qxl淬灭剂、IowablackFQ、IowablackRQ和IRDyeQC-1。所公开方法的寡核苷酸和核苷酸可以用淬灭剂标记。淬灭可以包括动态淬灭(例如，通过FRET)、静态淬灭、或两者。合适的淬灭剂包括Dabcyl。合适的淬灭剂还可以包括暗淬灭剂，其可包括以商品名“BHQ”销售的黑洞淬灭剂(例如，BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2和BHQ-3，BiosearchTechnologies，Novato，CA)中。暗淬灭剂还可以包括以商品名“QXLTM”销售的淬灭剂(Anaspec，SanJose，CA)。暗淬灭剂还可以包括含2，4-二硝基苯基的DNP型非荧光团。实施例包括以下实施例以说明本发明的优选实施方案。本领域技术人员应理解，下文实施例中公开的技术代表本发明人发现的在本发明的实践中很好地起作用的技术，并且因此可以被认为构成了其实施的优选方式。然而，本领域的技术人员根据本公开内容的教导还应理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变并且依然获得相同或类似结果，而不脱离本发明的精神和范围。实施例1.使用二十二烷和Chill-outTM蜡作为冻干试剂饼的屏障进行研究以测试是否可以通过蜡密封来保护包含用于进行PCR之试剂的冻干饼，同时依然保持实现稳健和定量PCR的能力。冻干饼包含用于实时PCR扩增和检测甲型流感靶序列的所有试剂。这些试剂在50μL饼中一起干燥(dried-down)。然后用两种不同的蜡处理这些饼。在一种情况下，将60μL二十二烷蜡移液到冻干饼的上方，并使其在室温下固化。在第二测试情况下，将60μLChill-outTM蜡(Bio-RadLaboratories，Inc.)移液到冻干饼的上方，并放置在冷板上固化。以这种方式添加的Chill-outTM蜡吸收进冻干饼，并且只要饼保持在10℃以下就保持固体。再水化和模板添加后，在PCR测定中将二十二烷和Chill-outTM蜡试剂饼与不含蜡(但是在PCR过程中含有矿物油蒸发屏障)的“对照”冻干饼相比较。所有材料使用RT-PCR在热循环仪设备上一起测试(逆转录酶50℃15分钟，随后是在95℃2分钟的变性步骤，随后进行50个PCR循环(95℃/5秒-58℃/10秒-72℃30秒)，和60℃至95℃的解链步骤)。结果表明，二十二烷或Chill-outTM蜡与“无蜡冻干对照”之间的Ct和Tm值和解链偏差(meltdeflection)相当(参见，例如图1)，这表明蜡保护层(蜡浸渍)试剂饼保持稳健的酶活性并且能够实现与对照试剂饼相当的定量特征。实施例2-使用石蜡作为冻干饼的隔汽层在包含实时PCR试剂和用于甲型流感扩增的引物的卡扣式帽管(snapcaptube)中制备冻干试剂饼(25μL)。除非另有说明，否则根据本实施例产生的冻干试剂饼由25μL的起始湿试剂体积产生，并且包含5％海藻糖(重量/体积)、5％葡聚糖(重量/体积)和0.5mg/mlBSA。通过熔化冻干饼上的20μL石蜡团块将石蜡加入到一部分管中。蜡在70℃下的加热块上熔化1.5分钟。在实时热循环仪设备中进行测试，并且将结果与临测试前制备的湿对照相比较。湿对照包含PCR试剂主混合物的所有关键组分，但不包含冻干所需的糖。将蜡覆盖的冻干饼加热30秒，然后加入Tris缓冲剂。将团块再加热30秒，然后立即放入热循环仪设备中进行测试。或者，在设备外(off-instrument)的加热块上完成石蜡倒置混合。石蜡覆盖的饼和对照相比较的研究结果示出于下表1和图2(使用石蜡覆盖的饼的扩增结果标记为A2-A6和A8-A12，而对照标记为A1和A7)。这些研究表明，用石蜡浸渍的试剂饼可以成功实现定量扩增。表1：石蜡覆盖的试剂饼与对照相比的PCR结果实施例3.使用二十二烷团块作为冻干饼的隔汽层向25μL的甲型流感冻干饼再添加20μL二十二烷蜡团块。在孔内温度为50℃的加热块上熔化蜡3.5分钟。在实时热循环仪设备中进行测试，并且将结果与临测试前制备的湿对照相比较。湿对照包含主混合物的所有关键组分，但不包含冻干所需的糖。结果示出在表2和图3中(使用二十二烷覆盖的饼的扩增结果标记为A2-A6和A8-A12，而对照标记为A1和A7)。这些研究表明，用二十二烷蜡覆盖的试剂饼可以成功实现定量扩增。表2：二十二烷蜡覆盖的试剂饼与对照相比的PCR结果实施例4.使用熔融蜡(二十二烷)作为冻干饼的隔汽层制备甲型流感冻干饼(50μL饼)，并用60μL二十二烷蜡涂覆。将二十二烷蜡加热至100℃，然后将60μL移液到冻干饼上并允许其固化。在蜡涂覆的饼的熔化/倒置混合之后，在实时热循环仪设备上进行测试，将结果与临测试前制备的湿对照相比较。湿对照包含主混合物的所有关键组分，但不包含冻干所需的糖。这些研究的结果示出在图4中(使用二十二烷覆盖的饼的扩增结果标记为A1-A3，而对照标记为A4-A6)。这些研究表明，用熔融二十二烷蜡涂覆的试剂饼可以成功实现定量扩增。实施例5.RNA和DNA测试用管中冻干的小鼠肝炎病毒引物制备25μL冻干饼。将莫洛尼鼠白血病病毒(moloneymurineleukemiavirus，MMLV)逆转录酶加入到主混合物中以允许使用相同的冻干饼检测RNA和DNA内部对照靶标二者。在25％相对湿度(relativehumidity，RH)条件下，使用孔内温度为50℃的加热块熔化冻干饼上的二十二烷蜡(25μL)3.5分钟。在实时热循环仪设备上进行测试，在设备外进行蜡的倒置。为了进行设备外的倒置，将蜡覆盖饼在孔内温度为50℃的加热块上加热30秒。50℃的50μL靶标加入到管中，将管立即转移到热循环仪设备。相同的测试参数用于DNA和RNA二者。将蜡覆盖的冻干饼与没有蜡覆盖的相同冻干饼(冻干对照)和湿对照相比较。湿对照包含与冻干材料相同的所有组分，但是在临测试前制备。这些研究的结果表明，所有条件的Ct(表3和图5A)和Tm(表4和图5B)值相当。表3：与蜡覆盖的冻干团块相比使用对照反应的DNA和RNA的Ct值湿对照冻干对照具有蜡RNA34.633.634.8DNA33.933.933.7表4：与蜡覆盖的冻干团块相比使用对照反应的DNA和RNA的Tm值湿对照冻干对照具有蜡RNA81.080.281.0DNA81.480.081.0实施例6.蜡作为隔汽层和蜡的使用量在卡扣式帽管中制备甲型流感冻干饼(25μL)。将不同量的二十二烷蜡在冻干饼上熔化(20μL、15μL、10μL)并使其固化。然后将蜡覆盖的冻干饼置于35℃的烘箱中(比蜡的熔化温度低的温度，以确保蜡仍然是固体)，所述烘箱包含一锅水以产生高湿度环境。材料留在烘箱中直至未覆盖的冻干饼对照皱缩(约1小时)。在热循环仪设备上测试所得材料。这些研究的结果示出于图5C-D中，并且表明与湿对照(A5和A11)和无湿度冻干对照(A6)相比，经受高湿度的未覆盖的冻干材料(A4)导致Ct延迟。然而，当材料用更高量的蜡(20μL和15μL，分别标记为A1和A2)保护时，Ct值与对照相当，即使在暴露于高湿度后也是如此。当经受高湿度时，降低水平的蜡组分(10μL，A3)也导致Ct延迟。实施例7.冻干饼上方的球有助于蜡倒置制备包含在冻干饼中的25μL小鼠肝炎病毒特异性引物反应混合物，并在设定为55℃的真空烘箱中用25μL二十二烷蜡覆盖15分钟。在熔化前将陶瓷球置于蜡覆盖的饼的上方，这导致在熔化并重新凝固后陶瓷球嵌入蜡。使用小鼠肝炎病毒RNA作为靶标在在管中进行测试。在RT步骤的蜡熔化过程中发生蜡倒置，并且由陶瓷球辅助。陶瓷球在蜡熔化过程中通过重力下降到底部，因此打破了表面张力以及蜡与再悬缓冲液之间的界面，允许任何“陷入的(stuck)”蜡上升到上方。陶瓷球还释放已经陷入重悬缓冲液的任何气泡并允许管的底部的表面张力的断裂，防止在底部附近形成或剩余气泡。将测试与临测试前制备的湿对照相比较。虽然这种湿对照包含主混合物的所有关键组分，但是其不包含用于冻干的葡聚糖和海藻糖。示出在图6A-B(陶瓷球蜡覆盖的试剂饼以虚线表示；湿对照以实线表示)和表5中的研究结果的表明，在上方具有陶瓷球的蜡覆盖的冻干材料导致在扩增和解链二者中靶标的100％检测。表5：利用陶瓷球蜡覆盖试剂饼与湿对照相比的实时PCR条件CtSTDEV湿对照31.870.94陶瓷34.941.14实施例8.在饼底部具有不锈钢球的冻干饼和混合过程将铬钢磁球加入到PCR管中并且将25μLPCR试剂主混合物(诺如病毒扩增特异性的)添加到球的上方用于冻干。因此，磁性球定位在饼的下方，并且在蜡添加后没有添加额外的球。一部分诺如类病毒饼用25μL二十二烷蜡覆盖。蜡以团块加入然后在设定为50℃的真空烘箱中熔化5分钟。在热循环仪设备上进行测试，其中在逆转录酶(RT)步骤期间具有混合步骤。在逆转录酶步骤开始后90秒且蜡倒置后开始冻干主混合物的重构。使用金属球的磁性混合帮助蜡的倒置，其不能通过打破蜡-重悬缓冲液界面的表面张力自然倒置。金属球也降低了表面张力，这允许在重悬缓冲液中可能捕获的任何气泡释放并上升到上方。最后，磁混合用于混合重悬缓冲液和冻干饼，并确保主混合物组分的一致分布。在混合过程中，磁体朝向PCR管移动，其使金属球上升到紧邻液体/蜡界面之下，在此保持3秒。然后移走磁体并等待3秒，从而将球释放到底部。这持续90秒。将具有金属球的蜡覆盖的冻干团块的测试与“湿”主混合物相比较，后者在临测试前制备并且包含与主混合物相同的所有组分，但是使用矿物油隔汽层而不是蜡隔汽层。结果也与具有蜡覆盖但是未混合的以及未覆盖蜡且未混合、手工混合或磁性混合的相同冻干饼相比较。研究的结果示出于图7B和表6中。这些结果表明，缺少混合(曲线标记为#2和#5)导致了在循环开始时显著的荧光尖峰(spike)/噪声(“折线形(dogleg)”)，这可能会影响扩增的检测(如FAM通道中标记为#5的曲线所示例的)。在冻干饼底部，具有磁性不锈刚球的蜡覆盖的冻干材料中，实现了诺如病毒的100％检测。表6：使用不同冻干试剂饼和混合条件的诺如病毒靶标扩增的实时RT-PCR结果实施例9.用于混合过程的陶瓷球和金属球的比较制备对HSV检测特异性的冻干试剂饼(25μL)并且用25μL二十二烷蜡覆盖。蜡作为团块加入，然后在设定为50℃的真空烘箱中熔化5分钟。凝固后，将陶瓷球或金属球放置在饼的上方。在热循环仪设备中进行PCR，在逆转录酶(RT)步骤期间具有混合步骤。在RT步骤开始90秒后开始混合步骤，这允许发生蜡倒置。在蜡熔化过程中，放置在上方的金属球通过重力下降到底部。一旦处于底部，将磁体朝PCR管移动，其使金属球上升到紧邻液体/蜡界面之下，在此保持3秒。然后移走磁体并等待3秒，从而将球释放到底部。这持续90秒。陶瓷球也放在上方并且在蜡熔化过程中通过重力下降到底部，但是由于材料不是磁性的，其不经历进一步混合。将测试与“湿”主混合物相比较，后者在临测试前制备并且包含与主混合物相同的所有组分，但是其使用矿物油隔汽层而不是蜡隔汽层。这些研究的结果示出于表7和图8(标记为#2的曲线表示用不锈钢球混合；#3表示用陶瓷球的反应；以及#1表示“湿”试剂对照)。这些研究的结果表明，在计算的Ct和的Tm值方面，湿、陶瓷和金属球条件之间没有显著的功能差异。然而，与陶瓷相比，增加利用不锈钢球的混合导致降低的“折线形”或产生更平坦的荧光基线，这很有可能是提高的混合的影响。表7.使用不同混合条件和不同球组成的反应的Tm和Ct结果实例10.蜡制剂和配制方法配制另外的蜡组合物用于制备稳定的冻干试剂饼。在第一示例方案中，配制含有30％二十二烷和70％PDMS油的蜡。首先，使用热循环仪将1.5毫升管的100％二十二烷蜡在65℃下加热。将700μL的PDMS油加入到一个新的1.5mL管中，并且也加热至65℃。然后将300μL熔化的100％二十二烷蜡加入到1.5mL小瓶中的700μLPDMS中。将混合物在65℃下继续加热并利用P1000移液管通过抽吸/分配来混合。一旦蜡组合物充分混合，将蜡混合物的25μL等分试样在箔覆盖的冷块上制成团块。使团块冷却并在一分钟内形成固体蜡。重复制成团块直至产生期望数量的团块。团块可进一步熔化或作为固体沉淀用于涂覆冻干试剂饼。构造另一种蜡制剂，其包含15％二十二烷、15％石蜡和70％PDMS油。对于该制剂，将100％二十二烷蜡在1.5mL管于65℃熔化。同样地，将100％石蜡在1.5mL管中于65℃熔化。接着，500μL的100％二十二烷蜡加入到新的1.5毫升瓶中的500μL的100％石蜡中。混合物在65℃持续加热，并通过利用P1000移液管通过抽吸/分配来混合。另外，将700μL的PDMS油加入到另一个新的1.5mL管中，并加热至65℃。接着，将300μL二十二烷/石蜡混合物加入到新的1.5mL瓶中的700μLPDMS中。最终的蜡混合物在65℃继续加热并利用P1000移液管通过抽吸/分配来混合。一旦完全混合，将蜡混合物的25μL等分试样在箔覆盖的冷块上制成团块。使所得团块冷却并在一分钟内形成的固体蜡。重复制成团块直至产生期望数量的团块。团块可进一步熔化或作为固体沉淀用于涂覆冻干试剂饼。实施例11.使用两层蜡作为冻干饼的隔汽层在包含用于诺如病毒RNA扩增的实时PCR试剂和引物的卡扣式帽管中制备冻干试剂饼(25μL)。冻干的PCR试剂饼用25μL二十二烷蜡覆盖或在二十二烷蜡覆盖后接着15μLChilloutTM蜡或在二十二烷蜡覆盖后接着15μL矿物油。将二十二烷蜡饼和双层蜡饼贮存在80％相对湿度室中或在密封干燥室(对照)中3天。在实时热循环仪设备上进行测试，并且将结果与对照相比较。结果示出于图9中。结果表明，二十二烷蜡或chillout蜡覆盖的二十二烷或矿物油覆盖的二十二烷提供了有效的隔汽层。实例12.使用蜡的组合作为冻干饼的隔汽层在包含用于诺如病毒RNA扩增的实时PCR试剂和引物的卡扣式帽管中制备冻干试剂饼(25μL)。冻干的PCR试剂饼用30μL二十二烷蜡覆盖或在二十二烷蜡覆盖后接着15μL矿物油或将冻干的PCR试剂饼用30μL蜡的共混物(体积∶体积∶体积比例为30∶40∶30的石蜡：二十二烷蜡：矿物油)覆盖或将冻干RCR试剂饼用30μL石蜡覆盖。二十二烷蜡饼和蜡分层的冻干饼储存在干燥箱中(T1对照)，或储存在周围环境下(T1环境)，或储存在80％相对湿度室中(T180％)一个月。在实时热循环仪设备上进行测试，并且将结果与对照(T1对照)相比较。结果示出在图10中。结果表明蜡的组合提供了更有效的隔汽层。根据本公开内容的教导，可以做出和实施本文公开和要求保护的所有方法而不需要过多实验。虽然本发明的组合物和方法已在优选的实施方案方面进行了描述，但是对本领域的技术人员来说很明显各种变化可以应用于本文所述方法以及方法的步骤或方法之步骤的顺序，而不脱离本发明的理念、精神和范围。更具体地，与化学和生理学两者相关的某些试剂可以替换本文所述的试剂，并且取得相同或类似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这些类似替换和修改被认为在由所附权利要求限定的本发明的精神、范围和理念中。参考文献以下参考文献，至其为本文所阐述的那些提供补充的示例性程序或其他细节的程度，通过引用明确地并入本文。美国专利No.5,432,272美国专利No.5,965,364美国专利No.6,001,983美国专利No.6,037,120美国专利No.6,140,496美国专利No.6,977,161美国专利No.7,422,850Crowe，etal.Biochem.J.242：1-10(1987).“Thetrehalosemythrevisited：Introductiontoasymposiumonstabilizationofcellsinthedrystate”，Cryobiology43，89-105(2001).McMinnetal.，J.Am.Chem.Soc.1999，121：11585Ren，etal.，J.Am.Chem.Soc.1996，118：1671当前第1页1 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