专利名称:凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法
技术领域：
本发明属于凹凸棒土的利用及β-葡萄糖苷酶固定化技术领域：
，具体涉及一种凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法。
背景技术：
酶是一类特殊的生物催化剂，具有催化效率高等优点，但酶本身具有的性质使其在多相反应中难以与产物或生成物分离，从而影响酶的反复利用。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近几年酶工程研究的重点。酶的固定化是用各种材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。葡萄糖苷酶属于纤维素酶类，该酶在自然界分布广泛，普遍存在于植物、动物和微生物中，可用于生物降解以及用多糖或其衍生物和醇类合成烷基和芳香族糖苷，β_葡萄糖苷酶可水解糖苷键，亦能够在微水环境下催化逆水解反应合成糖苷类化合物。
凹凸棒土晶体结构内部结构特点使得凹土的比表面积很大，拥有较强的吸附能力，海藻酸钠与凹土的复合时间会影响聚合物分子与硅酸盐表面分子的相互作用，得到结构稳定性不同的纳米复合材料。海藻酸钠能交换硅酸盐晶束间的无机阳离子(如Ca2+、Na+等)，以离子键的形式将聚合物引入硅酸盐的纤维中，得到纳米复合材料。海藻酸钠与凹土相结合程度不同，微球的密实程度就会不同，从而影响孔道的分布，对微球的释放会有显著性的影响，而颗粒表面的开放位点或微细孔道一定条件下允许反应物穿越，使颗粒的内表面也能够参与催化反应，增加了活性表面，当海藻酸钠与凹土相结合位点开始松散，孔道分布在微球外层，利于酶的固定化。
改性凹凸棒土作为生物催化剂酶的载体，在固定化酶的技术中也被广泛使用。公开号为CN1844382A的专利“一种固定化脂肪酶凹凸棒土的制备方法”，申请号为201110350307. O的专利“一种用于酯交换反应的凹凸棒土固定化酶的制备方法”，申请号为201010576488. 4的专利“一种同时纯化和固定化亚油酸异构酶的方法”等专利都公布了采用改性凹凸棒土固定不同酶，然而，凹土的处理方法不同，对于固定化后酶酶活、复用次数等都有着非常重要的影响
发明内容
本发明的目的是提供一种凹凸棒土负载海藻酸钠固定β_葡萄糖苷酶的制备方法，凹凸棒土固定化酶成本低廉、催化活性高、反复使用性能好。
本发明的技术解决方案是它是以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载海藻酸钠制备微球，然后微球采用吸附法对β -葡萄糖苷酶进行固定化。
该制备方法包括以下步骤
I)凹土纯化凹凸棒土与去离子水混合，凹凸棒土与去离子水的比例为1:5 (w/v)，常温下lOOr/min搅拌24h，静置沉降24h后，倒掉最下层杂质和上清液，再加入与上清液等量的去离子水，常温lOOr/min搅拌24h，静置24h，倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土；
2)酸改性凹土取纯化凹土，加入质量浓度为60%的硫酸溶液，纯化凹土与硫酸溶液的比例为1:5 (w/v),在常温下，以100r/min的转速搅拌24h,抽滤,水洗滤饼至水为中性,滤饼在105°C烘干；
3)改性凹凸棒土负载海藻酸钠的微球于40°C水浴，配制2%(w/v)海藻酸钠水溶液，搅拌使之呈均匀体系；称取酸改性凹土按1:10 (w/v)加入去离子水，置于回旋式振荡器上以100r/min转速震荡，分散24h，将分散的酸改性凹土加入2%(w/v)海藻酸钠水溶液中置于搅拌器内搅拌，酸改性凹土与2%(w/v)海藻酸钠水溶液比例为1:10 (w/v)，在40-60°C下复合2h ;将复合液体通过内径为O. 8mm的娃胶管由恒流泵以10 ml/min的速度滴到2% (w/v) CaCl2溶液中，复合液体与2%(w/v) CaCl2溶液的体积比为1: 1，持续搅拌交联固化12h，抽滤，并用去离子水冲洗，85°C干燥，冷却，研细过100目筛，得凹凸棒土负载海藻酸钠微球；
4)β_葡萄糖苷酶的固定将凹凸棒土负载海藻酸钠微球加入到装有浓度为10mg/ml的β -葡萄糖苷酶ΡΗ6. O柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的容器中，凹凸棒土负载海藻酸钠微球与β -葡萄糖苷酶的质量比例为30:1 40:1，温度40。。，150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼-40°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥18-20h，冻干后水分控制在4-5%，真空包装，得凹凸棒土负载海藻酸钠固定化葡萄糖苷酶。
本发明的有益效果是
I、凹凸棒土表面负载海藻酸钠形成新的网络结构，丰富了凹土的孔道，同时晶格内外的部分结晶水和吸附水被有机物取代，从而改善了凹凸棒土的疏水性，也增强了吸附能力，使改性凹土更利于酶的吸附固定化与活性保持。
2、采用凹凸棒土负载海藻酸钠制备微球，由微球对β-葡萄糖苷酶进行固定，提高β_葡萄糖苷酶性能、利用率和应用范围，扩大凹凸棒土的应用范围。
3、固定化β -葡萄糖苷酶对温度、pH的耐受性及适应性都较游离酶强，实现酶的重复使用，提高β_葡萄糖苷酶的利用率和应用范围。
图I游离酶与固定化酶的温度稳定性比较。
图2游离酶与固定化酶的pH值稳定性比较。
图3固定化酶的重复使用效果。
具体实施方式
以下通过结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但本发明的技术解决方案并不限于下述的实施例。
实施例I :
1)凹土纯化取20g凹凸棒土与IOOml去离子水混合,常温下100r/min搅拌24h,静置沉降24h后，倒掉最下层杂质和上清液，再加入与上清液等量的去离子水，常温lOOr/min搅拌24h后静置24h，倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土 ；
2)酸改性凹土取20g纯化凹土，加入质量浓度为60%的硫酸溶液100ml，在常温下，以lOOr/min的转速搅拌24h，抽滤，水洗滤饼至水为中性，滤饼在115°C烘干，得酸改性凹土 ；
3)改性凹凸棒土负载海藻酸钠微球40°C水浴配制2%(w/v)海藻酸钠水溶液，搅拌使之呈均匀体系；称取酸改性凹土 20g，加入200ml去离子水，置于回旋式振荡器上以IOOr/min转速震荡，分散24h，将分散的酸改性凹土加入200 ml 2%(w/v)海藻酸钠水溶液中置于搅拌器内搅拌，在60°C下复合2h ;将复合液体通过内径为O. 8mm的硅胶管由恒流泵以10mL/min的速度滴到的400ml 2%(w/v) CaCl2溶液中，持续搅拌交联固化12h，抽滤，并用去离子水冲洗，85°C干燥，冷却，过100目筛，得凹凸棒土负载海藻酸钠微球；
4)β_葡萄糖苷酶的固定取凹凸棒土负载海藻酸钠微球20g加入到装有67ml、pH6. O、浓度为10mg/ml的β -葡萄糖苷酶的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的容器中，温度40°C，150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼_40°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥 18h，冻干后水分控制在5%，真空包装，得凹凸棒土负载海藻酸钠固定化β -葡萄糖苷酶。
采用实施例I的固定化酶作温度稳定性试验，其与游离酶的温度稳定性比较如图I所示。
实施例2:
1)凹土纯化取IOOg凹凸棒土与500ml去离子水混合,常温下100r/min搅拌24h,静置沉降24h后，倒掉最下层杂质和上清液，再加入与上清液等量的去离子水，常温lOOr/min搅拌24h后静置24h，倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土 ；
2)酸改性凹土取IOOg纯化凹土，加入质量浓度为60%的硫酸溶液500ml，在常温下，以100r/min的转速搅拌24h，抽滤，水洗滤饼至水为中性，滤饼在105°C烘干，得酸改性凹土 ;
3)改性凹凸棒土负载海藻酸钠微球于40°C水浴，配制2%(w/v)海藻酸钠水溶液，搅拌使之呈均匀体系；称取酸改性凹土 100g，加入IOOOml去离子水，置于回旋式振荡器上以100r/min转速震荡，分散24h，将分散的酸改性凹土加入1000 ml 2% (w/v)海藻酸钠水溶液中置于搅拌器内搅拌，在40°C下复合2h ;将复合液体通过内径约为O. 8mm的硅胶管由恒流泵以10 ml/min的速度滴到的2000 ml 2% (w/v)CaCl2溶液中，持续搅拌交联固化12h，抽滤，并用去离子水冲洗，85°C干燥，冷却，过100目筛，得凹凸棒土负载海藻酸钠微球；
4)β -葡萄糖苷酶的固定取凹凸棒土负载海藻酸钠微球IOOg加入到装有250ml、pH6. O、浓度为10mg/ml的β -葡萄糖苷酶的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的容器中，温度40°C，150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼_40°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥19h，冻干后水分控制在4. 5%，真空包装，得凹凸棒土负载海藻酸钠固定化β-葡萄糖苷酶。
采用实施例2的固定化酶作pH值稳定性试验，其与游离酶的pH值稳定性比较如图2所示。
实施例3:
1)凹土纯化取500g凹凸棒土与2500ml去离子水混合,常温下100r/min搅拌24h,静置沉降24h后，倒掉最下层杂质和上清液，再加入与上清液等量的去离子水，常温lOOr/min搅拌24h后静置24h，倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土 ；
2)酸改性凹土取500g纯化凹土，加入质量浓度为60%的硫酸溶液2500ml，在常温下，以100r/min的转速搅拌24h，抽滤，水洗滤饼至水为中性，滤饼在105°C烘干，得酸改性凹土 ；3)改性凹凸棒土负载海藻酸钠微球于40°C水浴，配制2%(w/v)海藻酸钠水溶液，搅拌使之呈均匀体系；称取酸改性凹土 500g，加入5000 ml去离子水，置于回旋式振荡器上以100r/min转速震荡，分散24h，将分散的酸改性凹土加入5000 ml 2% (w/v)海藻酸钠水溶液中置于搅拌器内搅拌，在50°C下复合2h ;将复合液体通过内径约为O. 8mm的硅胶管由恒流泵以10 mL/min的速度滴到的10000ml 2% (w/v)CaCl2溶液中，持续搅拌交联固化12h，抽滤，并用去离子水冲洗，8 5°C干燥，冷却、过100目筛，得凹凸棒土负载海藻酸钠微球；
4)β -葡萄糖苷酶的固定取凹凸棒土负载海藻酸钠微球500g加入到装有1429ml、pH6. O、浓度为10mg/ml的β -葡萄糖苷酶的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的容器中，温度40°C，150 r/min振荡60min，抽滤、滤饼_40°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥20h，冻干后水分控制在4%，真空包装，得凹凸棒土负载海藻酸钠固定化β -葡萄糖苷酶。
采用实施例3的固定化酶作重复使用效果试验，其重复使用效果如图3所示。
权利要求
1.凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征是它是以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载海藻酸钠制备微球，然后微球采用吸附法对β-葡萄糖苷酶进行固定化。
2.根据权利要求
I所述的凹凸棒土负载海藻酸钠固定β_葡萄糖苷酶的制备方法，其特征是该制备方法包括以下步骤 1)凹土纯化凹凸棒土与去离子水混合，凹凸棒土与去离子水的比例为1:5(w/v)，常温下lOOr/min搅拌24h，静置沉降24h后，倒掉最下层杂质和上清液，再加入与上清液等量的去离子水，常温lOOr/min搅拌24h，静置24h，倒掉上清液和下层杂质，抽滤，105°C烘干，得纯化凹土； 2)酸改性凹土取纯化凹土，加入质量浓度为60%的硫酸溶液，纯化凹土与硫酸溶液的比例为1:5 (w/v),在常温下，以100r/min的转速搅拌24h,抽滤,水洗滤饼至水为中性,滤 饼在105°C烘干； 3)改性凹凸棒土负载海藻酸钠的微球于40°C水浴，配制2%(w/v)海藻酸钠水溶液，搅拌使之呈均匀体系；称取酸改性凹土按1:10 (w/v)加入去离子水，置于回旋式振荡器上以100r/min转速震荡，分散24h，将分散的酸改性凹土加入2%(w/v)海藻酸钠水溶液中置于搅拌器内搅拌，酸改性凹土与2%(w/v)海藻酸钠水溶液比例为1:10( 八)，在40-601下复合2h ;将复合液体通过内径为O. 8mm的娃胶管由恒流泵以10 ml/min的速度滴到2% (w/v)CaCl2溶液中，复合液体与2%(w/v) CaCl2溶液的体积比为1: 1，持续搅拌交联固化12h，抽滤，并用去离子水冲洗，85°C干燥，冷却，研细过100目筛，得凹凸棒土负载海藻酸钠微球； 4)β_葡萄糖苷酶的固定将凹凸棒土负载海藻酸钠微球加入到装有浓度为10mg/ml的β -葡萄糖苷酶ΡΗ6. O柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液的容器中，凹凸棒土负载海藻酸钠微球与葡萄糖苷酶的质量比例为30:1 40:1，温度40°C，150 r/min振荡60min，抽滤，滤饼-40°C预冻3h，再迅速移入冷冻干燥机冷冻干燥18-20h，冻干后水分控制在4-5%，真空包装，得凹凸棒土负载海藻酸钠固定化葡萄糖苷酶。
专利摘要
本发明公开了凹凸棒土负载海藻酸钠固定β-葡萄糖苷酶的制备方法，它是以凹凸棒土为原料，对凹凸棒土进行改性处理后负载海藻酸钠制备微球，然后微球采用吸附法对β-葡萄糖苷酶进行固定化。本发明采用凹凸棒土固定化酶，成本低廉、催化活性高、反复使用性能好，扩大凹凸棒土的应用范围。
文档编号C12N11/10GKCN102952792SQ201210449928
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月12日
发明者贾建波 申请人:淮阴工学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan