来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种透明质酸酶抑制剂，特别是涉及一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂及其于口服组合物、皮肤外用组合物以及医药组合物的应用。

背景技术：

透明质酸酶(hyaluronidase；haase)亦称扩散因子，是一群水解透明质酸(hyaluronicacid；ha)糖苷酶的总称，主要存在于动物组织(例如皮肤、关节、韧带、眼睛等)、动物毒液及微生物中。透明质酸酶主要作用在透明质酸的n-乙酰胺基葡糖和d-葡糖醛酸之间的β-1,3、β-1,4糖苷键，将其解聚合并水解成相对低分子质量(mr)的ha或寡糖。透明质酸广泛地存在于动物的各种组织中，在机体内显示出多种重要的生理功能，如润滑关节、调节蛋白质的运转、促进创伤愈合等。更为重要的是，它具有良好的保湿作用，在保湿的同时，又是良好的透皮吸收促进剂。含透明质酸的化妆品目前在国际上被公认为「仿生化妆品」、「第四代化妆品」。

透明质酸酶依据最适反应ph值、氨基酸序列同源性及来源、结构和作用机制，可概分成三类，分别是内切-β-n-乙酰胺基葡萄糖苷酶、内切-β-葡萄糖醛酸苷酶、透明质酸裂解酶。

透明质酸酶是i型过敏反应和肿瘤细胞增殖的参与者，它与发炎、过敏有强相关性。可使结缔组织的间质分解，组织水肿，血管通透性增加，炎症加剧。这些作用与细菌及其产物的穿透和炎症迅速扩散有关。因此，抑制透明质酸酶的活性，既能使透明质酸不被分解以维持其正常的生理功能，又能达到抗炎、抗过敏、抗肿瘤的功效。透明质酸酶也能暂时降低细胞间质的黏性，使皮下注射输液、局部累积的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，更可舒缓退化性关节炎的症状。因此，透明质酸酶也可作为药物扩散剂以及治疗退化性关节炎等应用。另外，在含有透明质酸的制剂(特别地，如美容增强剂和组织填充剂)中加入抑制透明质酸酶活性的添加剂，能够增强制剂作用的持久性，避免规律性地重复给药。所以，抑制透明质酸酶活性的添加剂的开发在制药、保健品、化妆品行业具有重要意义。

透明质酸被分解会造成许多疾病，例如过敏、发炎、退化性关节炎等。目前已知有一些透明质酸酶抑制剂，例如多磺酸基粘多糖等，可抑制透明质酸酶的酵素活性，使透明质酸不被分解以维持其正常的生理功能，又能达到抗发炎、抗过敏、减缓退化性关节炎等功效。

目前已知天然来源产物中，列当科管花肉苁蓉、七叶树科天师栗的果实娑罗子、迷迭香等提取物，具有抑制透明质酸酶活性的活性。然而，上述具有抑制透明质酸酶的天然来源产物对于透明质酸酶的抑制效果有限。

有鉴于此，亟需开发一种天然来源产物，以提供具有抑制透明质酸酶活性的产品。

技术实现要素：

本发明的一方面是提供一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其包含共生发酵生成物，且此共生发酵生成物为于植物性培养基中以多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得。

本发明的另一方面是提供一种皮肤外用组合物，包含上述的透明质酸酶抑制剂，其中透明质酸酶抑制剂作为有效成分。

本发明的又一方面是提供一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物，其是以上述透明质酸酶抑制剂作为有效成分。

本发明的再一方面是提供一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制透明质酸酶的医药组合物，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。

根据本发明的上述方面，提出一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其于植物性培养基中以多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得，其中前述共生发酵步骤是于37℃下进行70小时至100小时，且前述发酵菌株选自于由多种乳酸菌菌株以及至少一非乳杆菌属菌株所组成组中的至少8者。

依据本发明一实施例，上述乳酸菌菌株包括多种双歧杆菌属(bifidobacteriumspp.)菌株和/或乳杆菌属(lactobacillusspp.)菌株。

依据本发明一实施例，上述双歧杆菌属选自于由青春双歧杆菌(b.adolescentis；bcrc14606或atcc15703、bcrc14607或atcc15704、bcrc14608或atcc15705、bcrc14658或dsm20087、和/或bcrc80247或atcc15706)、两叉双歧杆菌(b.bifidum；bcrc11844或dsm20082、bcrc11845或atcc29521、bcrc14613或atcc11863、bcrc14614或atcc15696、bcrc14615或atcc29521、bcrc14630或atcc35914、和/或bcrc14670或dsm20215)、短双歧杆菌(b.breve；bcrc11846或atcc15700、bcrc12584或cscc1900、bcrc14601或atcc15698、和/或bcrc14612或ncdo1456)、长双歧杆菌(b.longum；bcrc11847或atcc15707、bcrc12585或cscc1901、bcrc14602或atcc15697、bcrc14634或atcc15708、和/或bcrc14664或dsm20097)及上述的任意组合所组成的。

依据本发明一实施例，上述乳杆菌属菌株选自于由德氏乳杆菌保加利亚亚种(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus；bcrc10696或atcc15703、bcrc12297或ncdo970、bcrc14007或ncdo2074、bcrc14008或ncdo2394、bcrc14010或ncdo2487、bcrc14069或cscc2505、和/或bcrc14071)、瑞士乳杆菌(l.helveticus；bcrc11052或iam12090、bcrc12258或atcc10386、bcrc12259或atcc12046、bcrc12296或ncdo1844、bcrc12936或atcc15009、bcrc14021或ifo3809、bcrc14026或atcc521)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus；bcrc10940或atcc7469、bcrc11673或atcc9595、bcrc12249或cscc2602、bcrc14027或atcc14957、bcrc14029或atcc21052、bcrc14068或cscc2608、bcrc16000或atcc53103、和/或bcrc16095或ncimb8824)、乳杆菌副干酪亚种(l.paracaseisubsp.paracasei；bcrc12188或atcc27216、bcrc12193或atcc25598、bcrc12248或atcc25302、bcrc14001或atcc335、bcrc14023或atcc27092、bcrc16100或atcc11582、bcrc17002或atcc334、bcrc17005或atcc11578、和/或bcrc17475或iam10074)、短乳杆菌(l.brevis；bcrc10361或atcc8287、bcrc11196或nrrl1834、bcrc12187或atcc14869、bcrc12310或atcc367、和/或bcrc14060或dsm1268)、干酪乳杆菌(l.casei；bcrc10358或iam1045、bcrc10697或atcc393、bcrc11197或nrrl1445、bcrc12272或cscc2607、和/或bcrc14025或atcc27139)、乳杆菌属(lactobacillussp.；bcrc12945、bcrc14018或ifo14511、bcrc14031或atcc33222、bcrc14040或atcc27305、bcrc14044或ifo3914、bcrc14045或atcc27306、bcrc14061或atcc8291、和/或bcrc17003或atcc14435)及上述的任意组合所组成的。

依据本发明一实施例，上述至少一非乳杆菌属菌株包括链球菌属(streptococcusspp.)菌株和/或酵母菌属(saccharomycesspp.)菌株。

依据本发明一实施例，上述链球菌属菌株包括嗜热链球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus；bcrc12257或cscc2012、bcrc12268或cscc2002、bcrc12307或ncdo1409、bcrc13869或atcc19258、bcrc14017或atcc14485、bcrc14308和/或bcrc14085)。

依据本发明一实施例，上述酵母菌属菌株包括啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae；bcrc20262、bcrc20263、bcrc20270或atcc2345、bcrc20271或atcc26602、bcrc20405或atcc26603、bcrc20496或atcc28683、bcrc20497或atcc28684、bcrc20498或atcc28685、和/或bcrc21680或cbs5816)。

依据本发明一实施例，上述发酵菌株于植物性培养基的接种量可例如为3重量百分比至5重量百分比。

依据本发明一实施例，上述植物性培养基包含大豆、芝麻、薏苡、蔗糖、氯化钠及水。

依据本发明一实施例，上述植物性培养基包含1.0至10.0重量百分比的大豆、1.0至5.0重量百分比的芝麻、1.0至5.0重量百分比的薏苡、1.0至5.0重量百分比的蔗糖以及0.1至2.0重量百分比的氯化钠。

依据本发明一实施例，上述植物性培养基包含1.0至6.0重量百分比的大豆、1.0至3.0重量百分比的芝麻、1.0至3.0重量百分比的薏苡、2至5重量百分比的蔗糖以及0.2至1.0重量百分比的氯化钠。

根据本发明的另一方面，提出一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。

根据本发明的又一方面，提出一种皮肤外用组合物，其包含上述的透明质酸酶抑制剂，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。

根据本发明的再一方面，提出一种透明质酸酶抑制剂用于制备具有抑制透明质酸酶的医药组合物，其是以上述的透明质酸酶抑制剂作为有效成分。

应用本发明的透明质酸酶抑制剂，其包含来源于共生发酵生成物，且此来源于共生发酵生成物为于植物性培养基利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得，所得的透明质酸酶抑制剂具有抑制透明质酸酶的活性，可应用于皮肤外用组合物、制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物或医药组合物。

附图说明

为使本发明的上述和其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，提供附图，所述附图的详细说明如下：

图1绘示根据本发明实施例1的实验例、比较例1及比较例2所得的共生发酵生成物的hplc图谱。

图2a至图2c示出根据本发明浓度1.0～10％的实施例1的实验例(图2a)、比较例1(图2b)及比较例2(图2c)的共生发酵生成物与3t3纤维母细胞共培养后，透明质酸酶的透明质酸酶谱胶体照片。

具体实施方式

承前所述，本发明提供一种来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，其包含来源于共生发酵生成物，且此共生发酵生成物为于植物性培养基利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得。

展开讲，本发明此处所称的「共生发酵生成物」是指在体外将各种不同菌株，培养于发酵基质中进行共生发酵，再经固液分离等处理所得的生成物，其中包含菌体残留成分、代谢物质等。

在一实施例中，前述共生发酵生成物可例如于植物性培养基，以多种发酵菌株接种后，经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得。在此说明的是，并非共生发酵生成物当然就具有抑制透明质酸酶活性，需经实验证实才能确认。

在一实施例中，上述植物性培养基可包含例如大豆、芝麻、薏苡、蔗糖、氯化钠及水。在一例示中，上述植物性培养基可包含1.0至10.0重量百分比的大豆、1.0至5.0重量百分比的芝麻、1.0至5.0重量百分比的薏苡、1.0至5.0重量百分比的蔗糖以及0.1至2.0重量百分比的氯化钠，其余量为水。在另一例示中，上述植物性培养基可包含1.0至6.0重量百分比的大豆、1.0至3.0重量百分比的芝麻、1.0至3.0重量百分比的薏苡、2至5重量百分比的蔗糖以及0.2至1.0重量百分比的氯化钠，其余量为水。

在此说明的是，倘若植物性培养基的各成分的使用量在上述范围之外，则未经实验证实，无法预期能获得具有抑制透明质酸酶活性的共生发酵生成物。

在一实施例中，上述发酵菌株选自于由多种乳酸菌菌株以及至少一非乳杆菌属菌株所组成的组中的至少8者。在一例示中，上述发酵菌株于植物性培养基的接种量可例如为3重量百分比至5重量百分比。

依据本发明一实施例，上述乳酸菌菌株可包括但不限于多种双歧杆菌属(bifidobacteriumspp.)菌株和/或乳杆菌属(lactobacillusspp.)菌株。

在上述实施例中，双歧杆菌属可例如选自于由青春双歧杆菌(b.adolescentis；bcrc14606或atcc15703、bcrc14607或atcc15704、bcrc14608或atcc15705、bcrc14658或dsm20087、和/或bcrc80247或atcc15706)、两叉双歧杆菌(b.bifidum；bcrc11844或dsm20082、bcrc11845或atcc29521、bcrc14613或atcc11863、bcrc14614或atcc15696、bcrc14615或atcc29521、bcrc14630或atcc35914、和/或bcrc14670或dsm20215)、短双歧杆菌(b.breve；bcrc11846或atcc15700、bcrc12584或cscc1900、bcrc14601或atcc15698、和/或bcrc14612或ncdo1456)、长双歧杆菌(b.longum；bcrc11847或atcc15707、bcrc12585或cscc1901、bcrc14602或atcc15697、bcrc14634或atcc15708、和/或bcrc14664或dsm20097)及上述的任意组合所组成的。

在上述实施例中，乳杆菌属菌株可例如选自于由德氏乳杆菌保加利亚亚种(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus；bcrc10696或atcc15703、bcrc12297或ncdo970、bcrc14007或ncdo2074、bcrc14008或ncdo2394、bcrc14010或ncdo2487、bcrc14069或cscc2505、和/或bcrc14071)、瑞士乳杆菌(l.helveticus；bcrc11052或iam12090、bcrc12258或atcc10386、bcrc12259或atcc12046、bcrc12296或ncdo1844、bcrc12936或atcc15009、bcrc14021或ifo3809、bcrc14026或atcc521)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus；bcrc10940或atcc7469、bcrc11673或atcc9595、bcrc12249或cscc2602、bcrc14027或atcc14957、bcrc14029或atcc21052、bcrc14068或cscc2608、bcrc16000或atcc53103、和/或bcrc16095或ncimb8824)、乳杆菌副干酪亚种(l.paracaseisubsp.paracasei；bcrc12188或atcc27216、bcrc12193或atcc25598、bcrc12248或atcc25302、bcrc14001或atcc335、bcrc14023或atcc27092、bcrc16100或atcc11582、bcrc17002或atcc334、bcrc17005或atcc11578、和/或bcrc17475或iam10074)、短乳杆菌(l.brevis；bcrc10361或atcc8287、bcrc11196或nrrl1834、bcrc12187或atcc14869、bcrc12310或atcc367、和/或bcrc14060或dsm1268)、干酪乳杆菌(l.casei；bcrc10358或iam1045、bcrc10697或atcc393、bcrc11197或nrrl1445、bcrc12272或cscc2607、和/或bcrc14025或atcc27139)、乳杆菌属(lactobacillussp.；bcrc12945、bcrc14018或ifo14511、bcrc14031或atcc33222、bcrc14040或atcc27305、bcrc14044或ifo3914、bcrc14045或atcc27306、bcrc14061或atcc8291、和/或bcrc17003或atcc14435)及上述的任意组合所组成的。

在上述实施例中，至少一非乳杆菌属菌株可包括例如链球菌属(streptococcusspp.)菌株和/或酵母菌属(saccharomycesspp.)菌株。

在上述实施例中，链球菌属菌株包括嗜热链球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus；bcrc12257或cscc2012、bcrc12268或cscc2002、bcrc12307或ncdo1409、bcrc13869或atcc19258、bcrc14017或atcc14485、bcrc14308和/或bcrc14085)。

在上述实施例中，酵母菌属菌株包括啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae；bcrc20262、bcrc20263、bcrc20270或atcc2345、bcrc20271或atcc26602、bcrc20405或atcc26603、bcrc20496或atcc28683、bcrc20497或atcc28684、bcrc20498或atcc28685、和/或bcrc21680或cbs5816)。

上述atcc代表美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection；atcc)，bcrc代表中国台湾新竹食品工业发展研究所生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter；bcrc)，cbs代表荷兰皇家艺术与科学院真菌生物多样性中心(centraalbureauvoorschimmelcultures；cbs)，dsm代表德国微生物及细胞培养保藏中心(deutschesammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh；dsmz)，nrrl代表美国农业研究菌种保藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection；nrrl)。cscc、iam、ifo、ncdo、ncimb则为非国际寄存机构(internationaldepositaryauthority；ida)，其中cscc代表澳洲食品科学联邦科学与工业研究组织(commonwealthscientificandindustrialresearchorganisation；csiro)部的入门菌种保藏(starterculturecollection)中心，iam代表日本东京大学应用微生物研究所(instituteofappliedmicrobiology；iam)菌种保藏中心，ifo代表日本大阪酦酵研究所(instituteforfermentation；ifo)微生物保藏中心，ncdo代表荷兰国际合作及可持续发展国家委员会(nationalcommitteeforinternationalcooperationandsustainabledevelopment；ncdo)，ncimb代表英国苏德兰国立工业食品及海洋微生物保藏中心(nationalcollectionofindustrialandmarinebacteria；ncimb)，nrrl代表美国农业部国立农业利用研究中心(nationalcenterforagriculturalutilizationresearch)北方地区性研究实验室(northernregionalresearchlaboratory；现改名为农业研究服务保藏中心，agriculturalresearchservice(ars)culturecollection)。

在一实施例中，前述共生发酵步骤可例如于37℃下进行70小时至100小时，然以于37℃下进行72小时至96小时为较佳，以获得发酵产物。在另一例示中，固液分离步骤可例如过滤步骤或离心步骤，除去发酵产物的固形物，以获得共生发酵生成物。

在其他实施例中，上述共生发酵步骤以及固液分离步骤之间，更可选择性进行终止发酵步骤。在一例示中，前述终止发酵步骤可例如在90℃下进行15分钟。

在一实施例中，上述所得的共生发酵生成物可选择性进行公知的后处理步骤，例如浓缩步骤、脱色步骤和/或微生物检测步骤，端视实际需求而定。

上述所得的共生发酵生成物经体外活性试验评估后，证实具有抑制透明质酸酶活性，故可进一步应用于各种剂型的组合物。适合的组合物可包括但不限于口服组合物、皮肤外用组合物和/或医药组合物。在一实施例中，上述的共生发酵生成物的口服组合物、皮肤外用组合物和/或医药组合物是以共生发酵生成物为有效成分，使上述剂型的组合物具有抑制透明质酸酶的活性。在此说明的是，一般而言，目前已知天然来源产物中具有抑制透明质酸酶活性者，其抑制活性的程度都有剂量及时间依存(dose-andtime-dependent)相关性。然而，本发明上述所得的共生发酵生成物在作为透明质酸酶抑制剂时，具有良好的水溶性，不具有剂量依存相关的细胞毒性，更可于无剂量及时间依存表现下完全抑制透明质酸酶酶活性，因此可提供生物安全性高、稳定、生体吸收性佳且有效的透明质酸酶抑制剂。

以下利用数个实施例以说明本发明的应用，然其并非用以限定本发明，本发明技术领域中普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变。

实施例1：制备共生发酵生成物

1.配制植物性培养基

首先，根据表1配制实施例、比较例1至2的植物性培养基。

表1

在进行发酵前，表1所列的植物性培养基可先利用公知的高压蒸气灭菌法进行灭菌，其灭菌的工艺条件可例如在121℃下进行40分钟。然后，将至少8种不同的发酵菌株分别接种至于表1的植物性培养基中，其中发酵菌株于植物性培养基的总接种量可为3％(w/v)至5％(w/v)。

在此实施例中，前述发酵菌株包括青春双歧杆菌(b.adolescentis；bcrc14606或atcc15703、和/或bcrc14658或dsm20087)、两叉双歧杆菌(b.bifidum；bcrc11845或atcc29521、和/或bcrc14615或atcc29521)、短双歧杆菌(b.breve；bcrc11846或atcc15700、和/或bcrc14612或ncdo1456)、长双歧杆菌(b.longum；bcrc12585或cscc1901、和/或bcrc14602或atcc15697)、德氏乳杆菌保加利亚亚种(l.delbrueckiisubsp.bulgaricus；bcrc10696或atcc15703、和/或bcrc14008或ncdo2394)、瑞士乳杆菌(l.helveticus；bcrc12936或atcc15009、和/或bcrc14026或atcc521)、鼠李糖乳杆菌(l.rhamnosus；bcrc14068或cscc2608、和/或bcrc16000)、乳杆菌副干酪亚种(l.paracaseisubsp.paracasei；bcrc14023或atcc27092、和/或bcrc17475或iam10074)、短乳杆菌(l.brevis；bcrc11196或nrrl1834、和/或bcrc12187或atcc14869)、干酪乳杆菌(l.casei；bcrc10697或atcc393、和/或bcrc11197或nrrl1445)、乳杆菌属(lactobacillussp.；bcrc14061或atcc8291、和/或bcrc17003或atcc14435)、嗜热链球菌(streptococcussalivariussubsp.thermophilus；bcrc12257或cscc2012、和/或bcrc13869或atcc19258)以及啤酒酵母菌(saccharomycescerevisiae；bcrc20262和/或bcrc21680或cbs5816)。上述同种但不同保藏编号的菌株，各选择一种菌株与其他不同种的菌株混合使用。

接下来，上述接种后的植物性培养基进行共生发酵步骤，其是于37℃下进行72小时至96小时。所得的共生发酵生成物在终止发酵步骤以及固液分离步骤后，即获得所得的共生发酵生成物并进行后续评估。

实施例2：利用高效液相层析评估共生发酵生成物

1.共生发酵生成物的分析产物萃取

实施例1的实验例、比较例1及比较例2所得的共生发酵生成物先分别以50％乙酸乙酯萃取，再以多层(例如6层)纱布过滤后的滤液，于45℃下烘干6小时，以获得共生发酵生成物测试样品的萃取产物，取1mg样品，以2mldmso回溶，以进行高效液相层析(hplc)分析。

2.共生发酵生成物测试样品萃取产物的分析方法

hplc分析条件如下，其结果如图1所示：

(i)分析管柱：cosmosilc18；

(ii)uv-vis检测器：hitachil-7420；

(iii)检测波长：243nm；

(iv)移动相：洗提液a：甲醇/醋酸(100/0.5)；

(v)洗提液b：甲醇/水/醋酸(80/20/0.5)；

(vi)梯度洗提的条件：甲醇浓度在0至15分钟内从80％线性递增至84％，在15至30分钟内再递增至86％，在30至40分钟内再递增至88％，在0至50分钟内再递增至94％，在50至70分钟内再递增至100％；

(vii)流速：0.7ml/min。

参阅图1，其绘示实施例1的实验例、比较例1及比较例2所得的共生发酵生成物的hplc图谱。由图1的结果可知，不同的植物性培养基经共生发酵等步骤处理后，其峰值分布(peakpattern)亦有所不同。实验组1的共生发酵生成物出现的峰值分布(peakpattern)可作为参考，并作为未来生产共生发酵生成物的品管标准。

实施例3：评估共生发酵生成物抑制透明质酸酶的活性(即抗过敏活性分析)

1.细胞培养

首先，将老鼠3t3纤维母细胞(mouse3t3fibroblasts；bcrc60071)培养于含10％胎牛血清(fetalcalfserum,hyclone)及2.5％小牛血清(bovinecalfserum,hyclone)的dulbecco’smodifiedeagle’smedium(dmem)培养基并加入3.7％(w/v)的碳酸氢钠，0.03％(w/v)的谷氨酸(l-glutamine)，每毫升含100单位的青霉素(penicillin)及100毫克的链霉素(streptomycin)等抗生素，在37℃、10％co2培养箱培养，一般以1×10⁶个细胞的细胞密度接种于75cm²的培养皿，每三至四天进行继代培养并换以新鲜培养基。之后，取约第十代的3t3细胞，进行不同浓度的共生发酵生成物的细胞实验。

2.透明质酸酶活性抑制分析方法(透明质酸酶谱分析；hyaluronan-basedzymography)

将3t3老鼠纤维母细胞(mouse3t3fibroblasts；bcrc60071)与实施例1的实验例、比较例1至2的共生发酵生成物共培养，或不与前述共生发酵生成物(对照组)共培养。培养1或2天(24或48小时)后，取各组的细胞培养液，配制含有玻尿酸的电泳胶片(包括stackinggel及separatinggel)，再进行蛋白质电泳分析，其中蛋白质电泳的条件应为本发明所属技术领域中普通技术人员所熟知，在此不另赘述。待电泳结束后，将电泳槽中的胶片取出，浸泡于清洗缓冲溶液(washingbuffer)中，于室温震荡清洗1小时后，移除清洗缓冲溶液，再加入反应缓冲溶液(reactionbuffer)中，于37℃水浴中震荡反应16小时。反应完毕后，将胶片取出，浸泡于0.5％的阿尔辛蓝染液(alcianbluesolution)中震荡染色2小时后，再浸泡于褪染缓冲溶液(destainingbuffer)中，褪染约1至2小时至条带清晰可见为止。之后，再以玻璃纸封片固定于压克力板上，放置室温下自然风干，即完成共生发酵生成物测试样品萃取产物对于透明质酸酶活性影响的分析步骤，其结果如图2a至图2c。

参阅图2a至2c，其示出根据本发明浓度1.0～10％的实施例1的实验例(图2a)、比较例1(图2b)及比较例2(图2c)的共生发酵生成物与3t3纤维母细胞共培养后，透明质酸酶的透明质酸酶谱胶体照片。在图2a至2c中，第m道代表蛋白质标记，第c0、c24、c48道分别显示未经处理的3t3老鼠纤维母细胞经0、24、48小时培养后的透明质酸酶活性。

由图2a至图2c的结果可知，本发明实施例1的实验例(图2a)的共生发酵生成物在1.0～10％的浓度(处理24小时)对于玻尿酸酶活性均具有强大的抑制作用，而且无剂量依存关系。在此说明的是，图2a不仅显示实施例1的实验例的共生发酵生成物在体外以低剂量(1.0％)的实验例(图2a)的共生发酵生成物，于24小时内可完全抑制透明质酸酶活性，在1.0～10％的浓度皆可明显抑制对玻尿酸酶活性，且其抑制作用在1.0～10％的浓度之间不具有剂量相关性。相较于其他已知具有剂量及时间相关性的天然来源产物的透明质酸酶抑制剂，本发明实验例的共生发酵生成物对玻尿酸酶的抑制作用显然是更加有效的。至于比较例1(图2b)的共生发酵生成物在10％以内的浓度(处理48小时)对于透明质酸酶的酵素活性没有任何的抑制作用，不具有保护玻尿酸的作用。比较例2(图2c)的共生发酵生成物在10.0％的浓度(处理24小时)以及在1.0％的浓度(处理48小时)对于玻尿酸酶活性才具有较有效的抑制作用(甚至完全的活性抑制)，但抑制效果远不及实验例(图2a)。

由于实施例1的实验例的共生发酵生成物可明显抑制透明质酸酶的活性，具有保护玻尿酸的较佳作用，也就是具有推迟玻尿酸因老化因素而被透明质酸酶破坏的能力，可作为有效成分并应用于皮肤外用组合物，例如化妆品组合物。

其次，实施例1的实验例的共生发酵生成物根据中国台湾公告的健康食品安全性评估方法，以低剂量(3.5g/kg体重/天)、中剂量(7g/kg体重/天)及高剂量(11.67g/kg体重/天)的剂量，利用胃管经口投予试验动物(雄、雌大鼠，至少为三重复的数据)，进行28天亚慢性毒性试验，并未造成死亡现象以及不良临床征兆。每日体重增加量及饮水、饲料消耗量、形态、行为活动力及器官组织重量未产生与剂量相关的显著变化。血液分析及生化指针检测的结果显示喂食实施例1的实验例的共生发酵生成物与比较例或对照组间无明显差异，证实无明显亚慢性毒性，符合食品安全性的标准(图未绘示)，并推估实施例1的实验例的共生发酵生成物的未观察到不良影响反应剂量(no-observed-adverse-effect-level；noael)为11.67g/kg/天。

既然实施例1的实验例的共生发酵生成物能明显抑制透明质酸酶的活性，又符合食品安全性的标准，可作为有效成分，并应用于制备具有抑制透明质酸酶活性的口服组合物和/或医药组合物。

综言之，由上述数个实施例证实，本发明来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂，成功利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤制得，且所得的共生发酵生成物确实具有抑制透明质酸酶的活性，亦可进一步抑制过敏、发炎、退化性关节炎，可应用于皮肤外用组合物、制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物或医药组合物。

需补充的是，本发明虽以特定的工艺、特定的分析方法或特定仪器作为例示，说明本发明的具有抑制透明质酸酶活性的共生发酵生成物及其应用，惟本发明所属技术领域中任何普通技术人员可知，本发明并不限于此，在不脱离本发明的精神和范围内，本发明的具有抑制透明质酸酶活性的共生发酵生成物亦可使用其他工艺、其他的分析方法或其他仪器进行。

由上述实施例可知，本发明的来源于共生发酵生成物的透明质酸酶抑制剂及其应用，其优点在于利用多种发酵菌株经共生发酵步骤以及固液分离步骤而得，所得的共生发酵生成物具有抑制透明质酸酶的活性，可应用于皮肤外用组合物、制备具有抑制透明质酸酶的口服组合物或医药组合物。

虽然本发明已以数个实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明，在本发明所属技术领域中任何普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，可作各种修改与改变，因此本发明的保护范围视所附权利要求书所界定为准。