一种具有协同抗肿瘤特性的透明质酸修饰的金‑碳纳米球及其制备方法与应用与流程

技术领域

本发明涉及生物医学材料领域，具体涉及一种空心金-碳纳米球的制备、表面修饰、搭载抗肿瘤药物及在肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

近年来，恶性肿瘤发病率不断升高，已成为人类健康的最大危害之一。基于纳米药物的肿瘤光热治疗及光动力学治疗在研究中被证明具有极佳的效果，是一种极具潜力的肿瘤治疗方法。光热治疗是通过将具有光热转化效能的纳米药物富集到肿瘤部位，在特定光源照射下产生热量使肿瘤坏死消融的方法。光动力学治疗是利用光敏剂在特定波长光源照射下产生活性氧杀伤肿瘤细胞的方法。碳纳米球作为一种生物安全性极佳的新型纳米材料，具有光-热转化能力、光催化能力、极大的比表面积及极强的吸附能力。其作为一种优秀的光敏剂，可在近红外光照射的情况下产生热量及活性氧，可有效对肿瘤细胞进行杀伤。因此，碳纳米球非常适合于肿瘤的光热及光动力学治疗。然而碳纳米球的光热转化效率有限，限制了光热治疗的效率，如何提高其光热转化效率是目前的研究重点之一。

金纳米粒是纳米级的单质金粒子，其易于合成，具有很高的化学稳定性，表面易于修饰，且细胞毒性低、生物相容性高，被广泛的应用于生物医药领域。金纳米粒子对700-1100 nm的近红外光具有极高的吸收，可将吸收的光能转化为热能。因此，在碳纳米球表面点缀上金纳米粒子，可以有机结合两种纳米材料制备具有更高的光热转化效率的纳米粒子。目前，没有任何文章及专利使用金纳米粒子与碳纳米球联用来制备具有高光热转化效能的纳米药物，并且搭载化疗药物应用于肿瘤的联合治疗。

靶向治疗是一种新的治疗手段，其可将药物特异性输注至肿瘤细胞内，减少在正常组织中的蓄积，从而增强疗效，降低副作用。细胞表面跨膜糖蛋白CD44是一种重要的肿瘤标志物，其与肿瘤的侵袭与转移有关，并在多种肿瘤细胞中高表达。透明质酸是与CD44具有高度亲和性的特异性配体，可通过CD44介导的细胞内吞进入肿瘤细胞内。因此，将透明质酸或其衍生物引入到纳米药物中，可实现肿瘤靶向性的诊断与治疗作用。

本发明采用聚多巴胺作为碳源合成碳纳米球，并在利用聚多巴胺还原氯金酸钾得到单质金纳米颗粒点缀于碳纳米球表面获得金-碳纳米球，之后将透明质酸修饰于金-碳纳米球表面，成功地制备了具有良好生物相容性、高载药量、兼具pH、酶及近红外等多重响应性的靶向多功能智能治疗体系，可有效用于肿瘤治疗，并且对耐药性肿瘤亦有极佳杀伤能力。

技术实现要素：

本发明旨在使用生物质碳源提供一种透明质酸包裹的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球药物载体及其制备方法和应用。该方法制备的透明质酸包裹的表面点缀金纳米粒的碳纳米球具有良好的生物相容性，高载药量，兼具pH、透明质酸酶及近红外等多重响应性的特点，且可特异性的靶向CD44高表达的肿瘤细胞，并利用光热治疗、光动力学治疗及化疗的联合治疗有效的杀伤肿瘤细胞，并且有效降低抗肿瘤药物的毒副作用。

本发明解决上述问题的技术方案是，一种透明质酸包裹的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球药物载体及其制备方法和应用。该透明质酸包裹的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球药物载体由肿瘤靶向分子、金-碳纳米球和药物三部分构成。其中，肿瘤靶向分子为透明质酸；金-碳纳米球为表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球；药物可以是激素或抗生素或抗癌药物等。

所述透明质酸包裹的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球药物载体由下法制得：

（1）利用正硅酸四乙酯在碱性环境中的水解合成直径为80-450 nm的实心二氧化硅纳米球；

（2）将步骤（1）中所得到的二氧化硅纳米球分散于碱性溶液中，加入多巴胺盐酸盐，利用多巴胺在碱性溶液中的聚合获得聚多巴胺并包裹于二氧化硅模板上，形成聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物；

（3）将步骤（2）中所得到的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物分散于双蒸水中，加入适量氯金酸钾，由于聚多巴胺具有强还原性，可将氯化金钾中的金还原为0价态并在其表面原结晶为纳米粒子，得到表面点缀有金纳米粒子的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物；

（4）将步骤（3）中得到的表面点缀有金的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物在无氧条件下进行煅烧，使聚多巴胺碳化，得到表面点缀有金纳米粒子的碳-二氧化硅复合物；

（5）将步骤（4）中得到的表面点缀有金纳米粒子的碳-二氧化硅复合物分散于氢氟酸溶液中，溶解除去二氧化硅模板，得到表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球，简称为金-碳纳米球；

（6）使用透明质酸的羧基与多巴胺的胺基反应，合成得到多巴胺修饰的透明质酸；

（7）将步骤（5）中的金-碳纳米球与药物在溶剂中搅拌混合，即可得到负载药物的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球；

（8）将步骤（6）得到的多巴胺修饰的透明质酸与负载药物的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球在磷酸盐缓冲液（PBS）中反应，即可得透明质酸包裹的负载药物的金-碳纳米球。

所述步骤（1）中的实心球型二氧化硅模板是以正硅酸四乙酯为有机硅前体，氨水为催化剂所制得的。具体地，量取100-1000 ml乙醇置于烧瓶中，加入1.5-15 mL 双蒸水和5-50 mL氨水（25~28%），搅拌均匀；之后逐滴加入1.5-15 mL正硅酸四乙酯，室温搅拌反应4小时。反应完毕后，10000转/分钟离心15分钟收集二氧化硅球，并使用无水乙醇洗涤至上清呈中性。所述步骤（2）中的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物是利用多巴胺单体在碱性的三羟甲基氨基甲烷缓冲液发生聚合并包裹于二氧化硅模板上所制得。具体地，将步骤（1）所获得的二氧化硅球分散于pH 8.5的10 mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液中（质量体积比为1 g : 300 mL），加入盐酸多巴胺（二氧化硅模板质量的90%）搅拌反应48小时，得到褐色的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物悬浊液，真空抽滤收集产物并用双蒸水进行洗涤，冻干后得到纯净的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物。

所述步骤（3）中使用氯金酸钾实现对聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物的金点缀。具体地，将步骤（2）中得到的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物分散于双蒸水中（质量/体积比为1 g : 300 mL），加入氯金酸钾（聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物复合物质量的25%），在冰浴中搅拌反应30分钟；反应完成后，抽滤收集反应产物，使用双蒸水洗涤后冻干，即可得到表面点缀有金纳米粒子的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物。

所述步骤（4）是通过在无氧环境下煅烧产物来实现聚多巴胺的碳化。具体地，将表面点缀有金的聚多巴胺-二氧化硅纳米复合物在氩气保护下，500℃煅烧3小时。

所述步骤（5）中选用氢氟酸溶解去除二氧化硅模板。具体地，将碳化之后的含有二氧化硅模板的产物置于100 mL4%氢氟酸中，搅拌反应1小时以溶解二氧化硅模板，最终得到金-碳纳米球。

所述步骤（6）中选用透明质酸与盐酸多巴胺反应得到多巴胺修饰的透明质酸。具体地，称取100~1000 mg透明质酸钠盐溶解于50~500 mL 除氧的PBS中。之后加入碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺并搅拌至完全溶解。其中，透明质酸单元：碳二亚胺：N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1 : 1 : 1。称取50~500 mg盐酸多巴胺，加入到上述混合液中，待多巴胺完全溶解后将溶液的pH调整至4~6并搅拌反应9小时。在反应过程中，每小时检测一次反应液的pH值并实时调整，使pH值始终保持在4~6。反应完毕后，将反应液转移至截留分子量为8000~14000道尔顿的透析袋中，在20 mM的PBS中透析24小时（每六小时换液一次），之后换为双蒸水透析24小时（每六小时换液一次）。冻干后即可得到多巴胺修饰的透明质酸。

所述步骤（7）中所选用的药物可以是常用抗癌药物（如盐酸阿霉素，顺铂，紫杉醇，喜树碱等）的一种或几种。进一步地，其他功效的药物（如激素，抗生素等）同样适用于本发明。优选地，本步骤将适量盐酸阿霉素溶于PBS（pH 7.4）中，而后加金-碳纳米球，室温避光搅拌24小时，即可得到负载药物的金-碳纳米球。

所述步骤（8）中是使用多巴胺修饰的透明质酸包裹负载药物的金-碳纳米球。具体地，将包载药物的金-碳纳米球分散于PBS中，而后加入多巴胺修饰的透明质酸（质量比1:1），继续避光搅拌反应24小时；反应完成后，12000转/分钟离心15分钟收集沉淀，并使用双蒸水洗涤三次，即可得到透明质酸包裹的负载药物的金-碳纳米球。

本发明的有益效果在于：

（1）该方法操作简单，原料获得方式简便，成本低廉，普遍适用，无需特殊复杂设备等。

（2）使用该方法制备的纳米复合体系，同时拥有外层透明质酸和内层金-碳纳米球的特性，具有高光热转换效率、高载药量、高生物相容性等特点。其具备pH/透明质酸酶/近红外多重响应性的药物释放特征，可靶向性抑制肿瘤细胞，尤其是以光热/光动力学/化学的联合治疗对耐药性肿瘤有优异的杀伤抑制能力，在肿瘤诊疗领域特别是在解决肿瘤的多重耐药性方面具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为代表性的所制备的金-碳纳米球的透射电子显微镜图。

图2为代表性的所制备的多巴胺修饰的透明质酸的紫外-可见吸收光谱。

图3为代表性的所制备的金-碳纳米球、多巴胺修饰的透明质酸、透明质酸包裹的金-碳纳米球的热重损失图。

图4为代表性的所制备的金-碳纳米球及透明质酸包裹的金-碳纳米球的细胞相容性图。

图5为代表性的所制备的金-碳纳米球和透明质酸包裹的金-碳纳米球的溶血实验图。

图6为代表性的所制备的金-碳纳米球在近红外激光照射下的温度变化图。

图7为代表性的所制备的负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球在不同pH及酶环境中的药物释放图。

图8为代表性的所制备的负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球在近红外激光照射下的药物释放图。

图9为代表性的所制备的负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球对肿瘤细胞的细胞毒性图。

图10为代表性的所制备的负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球对耐药的MCF-7/ADR细胞的光热、光动力学、化疗联合治疗效果图。

图11为代表性的所制备的负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球对荷瘤小鼠肿瘤抑制效果图。

具体实施方式

实施例1：本发明提供的使用多巴胺作为碳源所制备的透明质酸包裹的表面点缀有金纳米粒的空心碳纳米球药物载体

（1）直径约为80 nm的二氧化硅球（模板）的合成

量取100 mL无水乙醇，置于150 mL烧杯中，加入1.5 mL 双蒸水和5 mL 25-28%的氨水，同时用磁力搅拌器搅拌；之后，逐滴加入1.5 mL正硅酸四乙酯，室温搅拌4小时。反应完成后，12000转/分钟离心15分钟沉淀二氧化硅球，无水乙醇洗涤三次，得到纯化的二氧化硅球。

（2）合成聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米球

称取200 mg 步骤（1）所得的二氧化硅球，分散到60 mL pH 8.5的10 mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液中；之后，称取180 mg盐酸多巴胺，加入到上述反应体系中，接着在室温下搅拌反应48小时；反应完成后，抽滤收集产物并使用双蒸水洗涤，之后置于冷冻干燥机中冻干，得到聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米球。

（3）合成表面点缀有金的聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米球

称取200 mg 步骤（2）中所得的产物，分散至50 mL双蒸水中，之后称取50 mg 氯化金钾，加入到上述的分散液中，在冰浴中快速搅拌约30分钟；反应完成后，抽滤收集反应产物，并使用双蒸水洗涤后冻干，得到表面点缀有金的聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米球。

（4）合成金-碳纳米球

将步骤（3）所得的表面点缀着金的聚多巴胺包裹的二氧化硅纳米球在500℃、氩气保护下碳化。碳化之后将获得的含有二氧化硅模板的碳球置于一塑料反应杯中，加入浓度约为4%的氢氟酸，搅拌反应1小时溶解二氧化硅模板，得到点缀有金纳米粒的金-碳纳米球。如图1所示：通过该方法合成的金-碳纳米球直径为100 nm左右，其表面均匀点缀有金颗粒。

（5）多巴胺修饰的透明质酸的合成

称取100 mg透明质酸钠盐置于一100 mL圆底烧瓶中，加入50 mL 除氧后的PBS并搅拌直到透明质酸完全溶解。之后，分别称取50 mg碳二亚胺和30 mg N-羟基琥珀酰亚胺加入到透明质酸溶液中，搅拌约30分钟使碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺完全溶解。接着，称取50 mg盐酸多巴胺，加入到上述的混合液中，待多巴胺完全溶解后将溶液的pH调整至4-6，搅拌反应9小时。反应的过程中每小时检测一次反应液pH并实时调整，使pH值保持在4-6。之后将反应液转移至截留分子量为8000-14000道尔顿的透析袋中，在20 mM的PBS中透析24小时（每六小时换液一次），之后再置于双蒸水中透析24小时（每六小时换液一次），冻干后得到多巴胺修饰的透明质酸。如图2所示：检测多巴胺在280 nm处的紫外吸收，并与多巴胺标准品溶液的吸收值进行比对，算得平均每100个透明质酸单元接有9.4个多巴胺残基。

（6）合成透明质酸包裹的金-碳纳米球

将步骤（4）得到的金-碳纳米球（100 mg）分散于10 mM的PBS中，加入100 mg 多巴胺修饰的透明质酸，避光搅拌反应24小时；反应完成后，将混合液12000转/分钟离心15分钟并使用双蒸水洗涤沉淀三次，得到透明质酸包裹的金-碳纳米球。如图3所示：当温度提高到790℃时，碳-金纳米球、透明质酸包裹的金-碳纳米球、多巴胺修饰的透明质酸的重量损失分别为13.5%、35.0%、73.4%，说明透明质酸被成功修饰于碳-金纳米球上，其质量百分数约为34.6%。

实验例1：研究金-碳纳米球的生物相容性

1、将空载的碳-金纳米球及透明质酸包裹的金-碳纳米球与多种肿瘤细胞共孵育48小时后，CCK8法检测细胞活力，如图4所示：当复合体系没有搭载任何药物时，对细胞的活力没有明显的影响。

2、将空载的金-碳纳米球及透明质酸包裹的金-碳纳米球与人红细胞在37℃下共同孵育2小时，来模拟体内的溶血情况。如图5A所示：红细胞与金-碳纳米球或透明质酸包裹的金-碳纳米球共孵育并离心后上清均基本澄清，表明未发生明显溶血。通过检测血红蛋白在585 nm处的吸收峰，并与阳性对照1% Triton X-100和阴性对照PBS相比较，可计算出溶血比率。如图5B所示：与金-碳纳米球相比，透明质酸包裹的金-碳纳米球在各浓度下溶血率均未超过0.5%，这表明透明质酸的修饰使得金-碳纳米球对红细胞的影响极小。综上所述，金-碳纳米球及透明质酸包裹的金-碳纳米球具有非常好的红细胞相容性，在体内循环中不会造成明显的溶血。

实验例2：研究金-碳纳米球的光-热转化效率

使用808 nm的近红外激光在2 W/cm²的功率下照射金-碳纳米球分散液，并使用热成像仪对分散液的温度进行观察。如图6所示，在近红外激光的照射下，金-碳纳米球分散液的温度快速上升，十分钟后达到约73℃。该结果表明，该金-碳纳米球具有很好的光-热转换效率，这种优异的光热转换效率不仅能够有效的通过过热来杀伤肿瘤细胞，还可能促进所包载的药物的释放。此外，由于光热转换效率较高，金-碳纳米球可在较低功率的激光照射下达到较高的温度，从而避免了使用高功率激光所造成的非病变部位的损伤。

实验例3：研究透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系的pH/透明质酸酶/近红外激光多重响应性释药行为

1、制备负载抗肿瘤药物的pH/透明质酸酶/近红外激光多重响应的药物控释体系

（1）本研究使用广谱抗肿瘤药物阿霉素。将100 mg阿霉素溶于200 mL PBS（pH 7.4）中，加入100 mg金-碳纳米球，室温避光搅拌24 小时。

（2）将100 mg多巴胺修饰的透明质酸加入到步骤（1）的混合液中，室温避光反应24小时后，离心收集产物，使用双蒸水洗涤产物至上清无色，之后将所得产物冻干即可获得粉末状的透明质酸包裹的金-碳纳米球载药纳米颗粒，通过计算载药前后上清中DOX含量可测得载药量约为35.5%。

3、检测透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系在不同pH及酶条件下的释药曲线

将2 mg负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球分装在4个2 mL 离心管中（0.5 mg每管），分别加入1.5 mL pH 5.0、7.4以及含有透明质酸酶的pH 5.0和7.4的PBS，避光置于37℃震荡，在设定的时间点收取上清液，用紫外分光光度计测定480 nm处的吸光值，根据标准曲线计算释放的阿霉素量及比率，绘制释放曲线。如图7所示：24小时后在pH 5.0的环境下有44%的药物释放出来，在加入透明质酸酶后，有70%的药物从体系中释放出来，证实该释药系统对pH以及透明质酸酶双重敏感。

3、检测透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系在近红外照射下的释药曲线

将2 mg负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球分装在4个2 mL 离心管中（0.5 mg每管），分别加入1.5 mL pH 7.4的缓冲液，避光置于37℃震荡，在设定的时间点使用808 nm近红外激光以2 W/cm²的功率照射5分钟，并在下一时间点收取上清液，用紫外分光光度计测定480 nm处的吸光值，根据标准曲线计算释放的阿霉素量及比率，绘制释放曲线。如图8所示：24小时后在pH 7.4的环境下有34%的药物释放出来，远高于无近红外激光照射组，证实该释药系统对近红外激光照射敏感。

实验例 4：研究负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系对于药物敏感型肿瘤细胞以及多重耐药型肿瘤细胞的化疗杀伤作用

将负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球与药物敏感型人肝癌细胞（HepG2细胞），人宫颈癌细胞（HeLa细胞），人乳腺癌细胞（MCF-7细胞）,以及多重耐药型人乳腺癌细胞（MCF-7/ADR细胞）共孵育48小时，用CCK8法检测细胞活力。如图9所示：将药物敏感型肿瘤细胞用游离的盐酸阿霉素处理后，大部分的肿瘤细胞出现了死亡；类似地，透明质酸包裹的金-碳纳米球也能有效地诱导肿瘤细胞死亡，但在低浓度时对肿瘤细胞的杀伤作用弱于游离阿霉素，因为阿霉素是小分子水溶性药物，易通过扩散方式被肿瘤细胞摄取而及时发挥抗肿瘤效应。而相反地，当将多重耐药型乳腺癌细胞与游离阿霉素处理后，细胞活力明显高于用透明质酸包裹的金-碳纳米球处理后的肿瘤细胞，因为多重耐药型肿瘤细胞存在大量的药物泵，当游离阿霉素透过细胞膜进入细胞质后被很快地被泵出了细胞外，因而肿瘤杀伤力明显下降；而透明质酸包裹的金-碳纳米球通过CD44介导的细胞内吞进入细胞内，可避开药物泵作用，同时，溶酶体的酸性及富含透明质酸酶的环境使药物被大量地释放出来扩散至细胞核，因而在多重耐药型肿瘤细胞中发挥了较强的细胞杀伤效应。

实验例5：研究负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系对于多重耐药型肿瘤细胞的化疗-光热治疗-光动力学治疗联合杀伤作用

将负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球与多重耐药型人乳腺癌细胞（MCF-7/ADR细胞）共孵育4小时（阿霉素浓度为10μg/mL），之后使用1.5 W/cm² 808 nm近红外激光照射0-5分钟，继续孵育24小时后使用CCK8法检测细胞活力。如图10所示：在相同的近红外照射时间下，负载阿霉素组细胞毒性显著大于未负载阿霉素组，表明阿霉素与金-碳纳米球起到了联合治疗的效果，对耐药的MCF-7/ADR细胞造成了明显的杀伤。

实验例6：研究负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系对于小鼠多重耐药型肿瘤的化疗-热疗杀伤作用

待小鼠多重耐药型肿瘤平均体积达到70 mm³时，将小鼠随机分为6组，每组5只，分别静脉注射PBS、阿霉素、阿霉素/金-碳纳米球、阿霉素/透明质酸/金-碳纳米球各200 μL。24小时后，使用1 W/cm²的808 nm近红外激光照射各组小鼠肿瘤部位15分钟（除PBS组），之后观察记录小鼠肿瘤大小。如图11A及图11B所示：治单纯近红外照射无法抑制肿瘤生长，游离阿霉素组及阿霉素/金-碳纳米球组也仅显示出有限的抗肿瘤能力。阿霉素/透明质酸/金-碳纳米球组中，肿瘤大小显著的降低，仅有1只小鼠仍有肿瘤存在。透明质酸/金-碳纳米球组肿瘤生长被抑制，但由于其不含阿霉素，难以有效清除肿瘤，仍有4只小鼠存在肿瘤。这表明，负载阿霉素的透明质酸包裹的金-碳纳米球载药体系可以有效的富集到肿瘤部位，并通过近红外照射下的光热-光动力学-化学联合治疗对肿瘤进行有效的消融与杀伤。