含有透明质酸的阴道润滑剂的制作方法

专利名称：含有透明质酸的阴道润滑剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及身体润滑剂，而尤其是涉及基于天然粘弹性生物聚合物，透明质酸 (HA)的阴道润滑剂。这种阴道润滑剂一般包含具有指定分子量分布的HA。这种HA有利地 是由微生物枯草杆菌生产。
背景技术：
透明质酸(也称为玻尿酸或透明质酸钠)缩写为HA，是一种非硫酸化的糖胺聚糖， 广泛地分布于结缔组织、上皮组织和神经组织中。透明质酸是胞外基质的主要组分之一，而 显著地有助于细胞增殖和迁移。HA也可以参与一些恶性肿瘤的发展。平均70kg的人在其 体内大致含有15g的HA，其中每天三分之一发生降解和合成。关节润滑剂HA是滑液的主要组分，而据发现HA是提高滑液的粘度。连同滑液一起，HA是滑液 主要润滑组分之一。HA是关节软骨的一种重要组分，其中，其涂覆每一细胞(软骨细胞)。 当在连接蛋白存在下聚集蛋白聚糖单体结合至HA时，就会形成巨大的高度带负电的聚集 体。这些聚集体吸收水分并负责软骨的弹性(其耐压缩性)。在软骨中HA的分子量(尺 寸)随着年龄增长而降低，然而，在软骨中HA的含量却随着年龄增加而增加。皮肤组织修复的生物基质组分HA是皮肤的主要组分，在皮肤中HA参与组织修复。当皮肤过度暴露于UVB射线 时，HA在皮肤中起到自由基清除剂作用，以吸收自由基。皮肤红肿(晒伤)而在真皮中的 细胞就会停止生产正常量的HA。其降解速率也发生增加。暴露于UV之后，HA降解产物也 会在皮肤中累积。当HA在胞外基质中充足之时，但是HA也有助于组织流体动力学，细胞的迁移和增 殖，并参与许多细胞表面受体的相互作用，值得注意的是，这些包含了其主要的受体，⑶44。 CD44自身的上调，广泛地作为淋巴细胞中细胞活化的标记而被接受。HA对肿瘤生长的贡献 可以是由于其与CD44的相互作用。CD44参与了肿瘤细胞所需的细胞粘附作用。尽管HA结 合至CD44，但是有证据表明，HA降解产物通过Toll样受体2 (TLR2)，TLR4或TLR2和TLR4 二者在巨噬细胞和树突细胞中转换器发炎信号。TLR和HA在先天免疫中都起到了作用。HA的结构和合成HA的结构已经被充分表征。HA由D-葡糖醛酸和D_N_乙酰葡糖胺的二糖重复单 元构成，经由交替的β_1，4和β-1，3葡糖苷键连接在一起。HA在长度上典型地具有高达 25，000个二糖单元。HA分子量能够在体内处于5，000至20，000，000的范围。在人体滑液 中的平均分子量为3至4百万，而由人体脐带纯化的HA典型地为3，140，OOODa0HA通过一类称之为HA合成酶的整联膜蛋白合成，其中脊椎动物具有三类HAS1， HAS2和HAS3。随着HA延长通过细胞膜进入胞外域，这些酶通过重复地将葡糖醛酸和N-乙 酰葡糖胺加到初生多糖而增长HA。商业上，HA能够产自动物源，例如，来自公鸡鸡冠，脐带 以及来自关节软骨。可替代地，HA可以通过发酵获得。HA的平均分子量根据其所获得的来源而不同。一般而言，HA的分子量为60，000至14，000, 000。商购可获得的HA—般产自动物源或来自细菌源。一般而言，HA通过发酵工艺方 法而获自细菌源。发酵工艺方法涉及许多步骤，包括HA合成，分离和纯化。HA纯度取决于 其获得来源，具体而言，取决于所使用的细菌以及工艺方法技术。HA的纯度对其稳定性具有 显著的影响。HA的生物相容性和医疗应用HA是无毒的，非免疫源性的和可生物降解的。HA通过一类称之为透明质酸酶的酶 进行降解。在人体内，存在至少7种类型的类透明质酸酶的酶，其中几种是肿瘤抑制剂。HA 降解产物，寡糖和分子量非常低的HA表现出促血管新生性能。另外，近来的研究已经证明， HA碎片，而不是高分子量HA组分，能够诱导组织受损中和皮肤移植排异中巨噬细胞和树突 细胞中的发炎响应。第一 HA生物医药产品，喜朗(Healon)，在20世纪70年代和20世纪80年代中开 发出来而 批准用于眼科手术(即，角膜移植，白内障手术，青光眼手术和手术修复视网膜脱 落)。其它生物医疗公司也生产了各种牌子的眼科手术HA。HA也用于治疗膝盖的骨性关节炎。这种治疗，称之为关节上腔粘弹补充疗法，是按 照向膝关节注射一定疗程而进行实施的，而据信能够补充关节流体的粘度，由此润滑关节， 缓冲关节并产生镇痛效应。也有人提出，HA对软骨细胞具有积极的生物化学效应。分子量 在750，000至2百万范围内变化，而在一些制剂中HA是高度交联的。然而，一些安慰剂对 照研究对HA注射产生了质疑，而HA主要推荐用作手术的无奈之选。HA 口服用途最近也被 提出，但是效能仍待证实。一些初步的临床研究表明，口服给药HA对骨关节炎具有积极效 应。由于其高度的生物相容性和其在组织胞外基质中的共存，HA正在组织工程研究中 作为生物材料支架而获得知名度。在一些癌症中，HA水平与恶性和差预后良好相关。HA因此经常用作前列腺和乳癌 的肿瘤标记。其也可以用于监控这些疾病的发展。HA也可以用于手术后诱导组织愈合，尤其更适合于白内障手术后。伤愈的当前模 型认为，HA更大的聚合物看起来是在愈合的早期阶段物理地为调节免疫响应的白血细胞制 造空间。个人润滑剂天然酸性润滑流体通常存在于阴道中，而在性欲期间，生产的流体量就会增加。产 生足够的阴道润滑作用的功能或许会受到损害，导致由于包括更年期期间或在卵巢手术摘 除之后和放射疗法之后的雌性激素水平降低的诸多问题而使阴道组织干涩和发炎。这或许 会在性交期间产生疼痛和/或性交期间出血。口服避孕药和某些药物疗法如抗组胺剂，抗 抑郁剂，血压和心脏药物也能够有助于阴道干燥。另外，心理状态包括压抑，疲惫和焦虑，也 可以妨碍天然润滑剂的产生。激素和心理因素的组合作用在分娩之后尤其是如果在母乳喂 养之后会导致暂时性的干燥。对于那些在IVF治疗受孕之下的夫妇的压力是另一个具体的 实例。 常见的个人润滑剂如硅树脂和那些以商标Marks K-Y Jelly and Vaseline 销售 的那些，主要是基于合成物质如硅树脂，石油。含有甘油的商业可获得的润滑剂是杀精的而妨碍精子运动。甚至低浓度成分如甘油，都与这种杀精效应有关。因此，这种商业可获得的阴道润滑剂并不是推荐用于寻求怀孕的妇女。含有HA作为润滑组分的个人润滑剂已知用于治疗和缓解阴道干燥。HA据发现适用于IVF治疗。HA是哺乳动物，卵泡，输卵管和子宫流体的正常组分 (Lee and Ax 1984，Suchanek et al 1994, Rodriguez-Martinez et all998)。在这些流体 中透明质酸的生理学浓度，例如，为0. 04至1. 83mg/mL,占所有糖胺聚糖的16至39% (Kano et al 1998)，这由此提供了输卵管和子宫内高度粘性的环境。在体内，透明质酸支持排卵 并辅助受孕过程期间的精子选择，是已知的。商业上可获得的HA是天然的可生物降解聚合物。在极端条件如高温，高PH或低 PH(碱性和酸性条件)下，或在自由基或自由基前体存在下，是尤其不稳定的。在这种条件 下，具有相对高分子量例如1至3百万的HA，倾向于降解成小的HA碎片。另外，杂质，如痕 量的重金属如Fe2+，Fe3+，Cr3+，Cu2+，Al3+等的存在，将会加速这个降解过程。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种润湿和润滑阴道的天然生物相容性的个人润滑剂。本发明另一目的是提供一种阴道润滑剂，所具有的粘度适用于在pH3. 8至4. 5 (通 常与阴道环境有关)下增强阴道的润滑性。尽管含有HA的阴道润滑剂是已知的，但是它们与如上详细描述的几个缺点有关。 尤其是在已知的阴道活动的持续期间，HA润滑剂是受限的而无法预料。另外，已知的阴道 HA润滑剂储存时的稳定性是不可预测的。阴道环境是酸性的一般所具有的pH为约3. 8至4. 5。已知的商业可获得的HA在 这种酸性环境中会发生显著降解，尤其是在体温(约37°C)下更易发生。这种降解导致HA 分子量显著降低而其粘度也对应降低。因此，已知的HA阴道润滑剂的润滑效应一般较短， 而已知HA阴道润滑剂的润滑效应的持续期一般是不可预知的。另外，已知的HA阴道润滑 剂在储存期间会发生降解，而由此在施用时无效。已知的HA阴道润滑剂的货架寿命或许较 短并且已知的HA阴道润滑剂的货架寿命一般也是不可预测的。商业可获得的HA是不稳定的，而在高温或酸性或碱性条件下就会降解。在这种条 件下，商业可获得的HA就会降解成小的HA碎片。由于阴道环境的酸性本质，其中pH —般 为约3. 8至4. 5，商业可获得的HA将会显著降解而导致分子量降低和相关的粘度降低。同 样，已知HA阴道润滑剂的润滑效应与有限的持续期有关。然而，HA在这种润滑剂中的浓度 增加导致相关的精子运动降低。因此，已知的阴道HA润滑剂不应该应用于寻求怀孕的妇 女。另外，已知的阴道HA润滑剂在储存时可以发生降解而导致货架寿命有限和不可预知。根据本发明，不同分子量HA组分的组合用于优化本发明阴道润滑剂的润滑效应 的持续期并维持和/或增加与该阴道润滑剂接触的精子的迁移。另外，相比于较弱的精子， 本发明的润滑剂尤其增加或维持了强健精子的游动性，由此提高了受孕机率。令人惊讶的 是，高低分子量的HA组分的组合降低了 HA的降解，意味着本发明的阴道润滑剂货架寿命最 大化而本发明的阴道润滑剂稳定性在储存之时是可预知的。在本发明的阴道润滑剂中HA 的降解降低，也导致即使在暴露于酸性PH如与阴道环境有关的那些pH时其润滑效应持续 期最大化。
本发明的另一目的是提供一种增加或维持与之接触的精子游动性的阴道润滑剂。 寻求怀孕的妇女，而尤其是那些进行IVF治疗的妇女，可以使用这类型的阴道润滑剂。这种 润滑剂的使用可以增加IVF治疗的成功率。本发明还有的一个目的是提供非杀精而不会妨碍精子运动 的阴道润滑剂。根据本发明的第一方面，提供了一种含有分子量为750，000至3，000, 000的高分 子量HA和分子量为1，000至500，000的低分子量组分的阴道润滑剂，其中高分子量HA比 低分子量组分的比率为9 lw/w至1 9w/w。典型地，高分子量HA可以具有750，000至2，000, 000的分子量，合适地为750，000 至1，400, 000的分子量。高分子量组分可以具有800，000至1，200, 000的分子量。一般而言，低分子量组分的分子量为10，000至750，000 ；合适地为10，000至 500，000，合适地为150,000至250,000。可替代地，低分子量组分的分子量为25，000至 60，000。高分子量HA的平均分子量合适地为800，000至1，200, 000，一般为约1，000, 000。 低分子量组分的平均分子量合适地为25，000至60，000 ；典型地为40，000至60，000 ；一般 为约 50，000。低分子量组分可以是HA，壳多糖或任何其它含氨基的分子(天然的或合成的)，在 本文中并未特殊排除。低分子量组分可以是含氨基的多糖或氨基酸。低分子量组分分子能 够与HA有关，在分子水平上涂层HA而稳定HA。一般而言，低分子量组分是壳多糖或HA。有 利的是低分子量组分是HA。高分子量HA比壳多糖的比率，合适地为3 lw/w至1 3w/w。高低分子量组分的 精切比率取决于阴道润滑剂所需的性质。如果是有利于提供高生物活性性质的润滑剂(尤 其是高度自由基清除性质)，则高低分子量组分的比率应该相对较低，例如，1 5至2 5。 如果是有利于具有高粘度的润滑剂，则高低分子量组分的比率应该相对较高，例如，5 1 至5 2。尤其有益的比率可以根据润滑剂所需性质进行实验确定。根据一个实施方式，这种阴道润滑剂含有以重量计0. 至的高分子量HA。典 型地该阴道润滑剂含有以重量计0. 至的低分子量组分。高分子量HA据信能调节阴道润滑剂的粘度，并由于其粘度而起到低质量精子的 阻隔作用，而同时低分子量组分据信能够起到生物活性分子的作用。低分子量组分据信有 助于精子运动并起到自由基清除剂的作用。同样，本发明的润滑剂促进高质量精子的选择，而由此提高了受孕机率。本发明的阴道润滑剂一般具有100至1，000, OOOmPa. s的粘度；优选具有1，000至 500，OOOmPa. s 的粘度。根据一个实施方式，这种阴道润滑剂含有0. 1 %至1 % HA而具有2至1，OOOmPa. s 的粘度。本发明的阴道润滑剂可以具有的pH为2. 4至7. 8 ；合适地为5. 8至7. 4 ；典型地为 6. 0至7. 8 ；更合适地为6. 5至7. 4。本发明的阴道润滑剂可以含有磷酸盐缓冲的溶液而确保和维持具体的pH范围。典型地，本发明的润滑剂的HA获自动物源或获自生物工艺过程，包括经由细菌或 酶合成。合适地，本发明润滑剂的HA获自发酵或酶合成。
本发明的阴道润滑剂优选含有由微生物枯草杆菌生产的HA。合适地，本发明阴道 润滑剂的所有HA都产自微生物枯草杆菌。HA的纯度部分或整体上取决于其来源和其生产方法。用于已知阴道润滑剂中的 HA的纯度是受限的，典型地这种HA的纯度低于85%，典型地低于70%。相反，产于微生物 枯草杆菌的HA的纯度一般超过85%，一般为90%或更高。典型地，产于微生物枯草杆菌的 HA所具有的水分含量为约10%至15%。具体而言，在本发明的润滑剂中所用的HA合适地 含有的重金属杂质水平低于lOppm ；有利的是低于5ppm。枯草杆菌是通常在土壤中发现的革兰氏-阳性的过氧化氢酶阳性细菌。由枯草杆 菌生产HA在本领域内是已知的。然而，由枯草杆菌生产的HA以前还并未应用于阴道润滑 剂中。高低分子量组分的组合和所用HA的纯度意味着本发明的阴道润滑剂相比于已知 的HA阴道润滑剂是非常稳定的。具体而言，本发明的润滑剂在暴露于极端温度和极端pH， 如升高的温度和酸或碱性条件时是稳定的。本发明的润滑剂的HA在暴露于这些pH值，如与酸性阴道环境有关的pH时并不发 生任何显著程度的水解。同样，本发明的润滑剂在施用本发明的个人润滑剂之时或之后并 不发生任何显著程度的水解。一般而言，本发明的润滑剂一旦接触通常与阴道环境有关的 pH为3. 8至4. 5而温度大约为35至37°C的条件6至12h，并未发生显著的降解。典型地， 本发明的润滑剂在这种接触之时降解不到10 %至25 %，一般10 %至20 %，合适地10 %至 15%。相反，已知的HA阴道润滑剂在这种接触之时，已知的HA阴道润滑剂一般显著地发生 降解，典型地超过了 25%，一般为30%至40%。这种阴道润滑剂的粘度在接触通常与阴道环境有关的条件时一般维持至少6h。根据一个实施方式，本发明的阴道润滑剂含有酸处理的HA。典型地，一定比例的高 分子量HA用进行了酸处理。可替代地，补充低分子量组分的一定比例的HA进行了酸处理。出乎预料的是，向这种阴道润滑剂中加入一些酸处理的HA就能够改进其中所含 的HA的稳定性，尤其是在pH约3. 8至4. 5和/或在升高的温度下时稳定性更加得到改进。 酸处理一般通过在酸，如硝酸中HA的脱乙酰化而产生游离氨基进行实施，这在酸性条件下 将会进一步稳定化HA。本发明的润滑剂合适地含有高分子量的HA组分，低分子量组分和酸处理的HA。根据一个实施方式，低分子量HA可以补充本发明的阴道润滑剂的低分子量组分。 另外，这种阴道润滑剂可以含有低分子量的壳多糖(LMW壳多糖)。在低分子量组分含有低 分子量的HA的情况下，加入LMW壳多糖，出乎意料地提高可本发明阴道润滑剂的稳定性。本发明的润滑剂合适地含有高分子量的HA组分，低分子量的HA组分和壳多糖。典型地，加入壳多糖改进了这种阴道润滑剂在pH约3. 8至4. 5下的稳定性。具体 而言，加入壳多糖，改进了这种阴道润滑剂的水稳定性。壳多糖相比于本发明的个人润滑剂 的高分子量HA组分具有先对较低的分子量。这种壳多糖合适地具有1，000至750，000的分子量。一般而言，壳多糖的分子量 为1，000至500，000 ；合适地壳多糖的分子量为10，000至500，000 ；典型地壳多糖的分子量 为10，000至100，000。合适地这种壳多糖具有的平均分子量为30，000至70，000，更合适 地为40，000至60，000 ；有利地约为50，000。典型地壳多糖的表观粘度为20至200mPa. s。
典型地，这种阴道润滑剂含有0. 1衬％至的壳多糖。更合适地，这种阴道润 滑剂含有0. Iwt %至的高分子量HA。阴道润滑剂一般含有0. Iwt %至Iwt %的低分子 量HA。
LMW壳多糖类似于含有氨基的脱乙酰HA。LMW壳多糖是水溶性的，而将与HA形成 离子络合物而对HA抗酸降解。本发明的阴道润滑剂可以含有其它官能部分如DNA和/或一种或多种抗氧化化合 物或组合物。可替代地或另外地，这种阴道润滑剂可以含有氮氧化物释放前体，如氮氧化物 合成酶，精氨酸和瓜氨酸和天门冬氨酸中的一种或多种。具体而言，本发明的阴道润滑剂可 以含有高度聚合的DNA，如获自法国HTL的高度聚合的DNA。典型地，这种DNA浓度为0. 1% 至5%，合适地为0. 至1%。这种官能部分典型地提高了与跟发明阴道润滑剂有关的抗氧化效应和/或增强 了精子的游动性。然而，如上所提及的是，LMW HA是一种良好的自由基清除剂，而因此其它抗氧化化 合物并非是必需的。根据本发明的一个方面，本发明的阴道润滑剂并不含有抗氧化化合物 或组合物。本发明的阴道润滑剂可以含有医药，例如适用于治疗性传播疾病(STD)的治疗的 医药。合适的医药包括抗细菌或抗微生物物质，如苄索氯铵。在本发明另一优选的实施方式中，凝胶可以含有释放氮氧化物的添加剂如天然的 氮氧化物前体如氨基酸，例如，L-精氨酸，瓜氨酸和天门冬氨酸。这种添加剂可以在将这种 润滑剂适用于阴道时产生温暖效应，由此提高尤其是性交期间的阴道感觉。另外，氮氧化物 的释放可以具有维持或增强精子运动的作用。同样地，包含氮氧化物释放化合物可以提高 或最大化怀孕的机率。这种阴道润滑剂典型地含有0. 至10%的天然氨基酸。典型地，这种阴道润滑剂可以含有防腐剂，尤其是为了确保低微生物含量的情况。一般而言，本发明的阴道润滑剂可以含有其它药用佐剂或赋形剂。例如，生物粘结 剂如天然聚合物例如纤维素和，海藻酸盐或合成水溶性聚合物如PVA，PVP，聚环氧乙烷和聚 丙烯酸。本发明的阴道润滑剂可以是凝胶、泡沫、软膏、液体或喷雾的形式。在一个实施方式中，润滑剂，而尤其是低分子量组分，并不含有羟乙基纤维素，羟 丙基纤维素，羧甲基纤维素，葡聚糖，粘液素，卵磷脂或角叉菜胶。根据本发明的另一方面，提供一种含有以上所描述的阴道润滑剂的产品。这种产 品可以合适地是以注射器、胶囊或可喷雾的容器形式。具体而言，一次性注射器或包含一次 性喷嘴的可喷雾容器最小化或避免了较差污染的危险。有利地，本发明的产品是一次性的注射器或一次性可喷雾的容器形式。这种阴道 润滑剂由于高分子量HA和低分子量组分组合的独特剪切稀化的流变学性质而成为可喷雾 的。典型地，这种产品是具有体积为ImL至IOmL ；典型地为2mL至5mL的一次性注射
器形式。可替代地，这种产品是含有喷雾喷嘴，尤其是一次性喷雾喷嘴的挤压喷雾瓶的形式。本发明的阴道润滑剂可以易于从其中进行施用。有利地是本发明的阴道润滑剂在无菌条件下生产，而含有本发明阴道润滑剂的产 品在无菌条件下生产。根据本发明还有的一方面，提供了一种提供阴道润滑作用的方法，包括向需要其 的患者阴道施 用上述的阴道润滑剂的步骤。根据本发明的还有的一方面，提供了适用于治疗的如以上描述的阴道润滑剂。根据本发明还有的一方面，提供了适用于提供阴道润滑作用的如上所述的阴道润滑剂。优选提供阴道润滑作用的方法或用途包括增加或维持精子游动性的步骤。根据本发明还有的一方面，提供了一种促进怀孕的方法，包括向需要其的患者阴 道施用上述的阴道润滑剂的步骤。根据本发明还有的一方面，提供了适用于促进怀孕(受精)的如上所述的阴道润滑剂。根据本发明还有的一方面，提供了递送药物性或营养性组合物或类似物的方法， 包括向需要其的患者阴道施用上述的阴道润滑剂的步骤。根据本发明还有的一方面，提供了 一种适用于递送药物性或营养性组合物或类似 物的如本文中所述的阴道润滑剂。提供阴道润滑作用增加了怀孕的机率。然而，如上所提及的是，已知的阴道润滑剂 起到可杀精作用或大大降低了与之接触的精子的游动性。因此，已知的阴道润滑剂降低了 怀孕的可能性。相反，本发明的阴道润滑剂提供阴道润滑作用的同时维持或促进了精子运 动。因此，本发明的阴道润滑剂提高了怀孕的可能性。这种怀孕可能性的增加或许是由于 本发明的润滑剂的润滑作用，以及HA的生物活性所致。另外，由于组合了其组分的分子量， 则本发明的阴道润滑剂的润滑性能相比于已知的润滑剂能够维持相对较长的持续时间，而 且本发明的阴道润滑剂在暴露于一般与阴道环境相关的条件时是稳定的。根据本发明还有的一方面，提供了一种生产本发明阴道润滑剂的方法，包括以下 步骤组合具有分子量为750，000至3，000，000的高分子量和具有分子量为1，000至 500，000的低分子量组分，其中高分子量HA比低分子量组分的所述比率为9 lw/w至 1 ； 9w/w。合适地高分子量组分的分子量为750，000至1，400，000。典型地高分子量组分的 分子量为800，000至1，200, 000。合适地低分子量组分的分子量为10，000至500，000 ；典 型地低分子量组分的分子量为150，000至250，000。典型地低分子量组分具有20mPa. s至 200mPa. s的粘度。典型地，本发明的方法在温度为2至25°C下继续实施。合适地本发明的方法在无菌条件下或在表示第生物负荷的非常洁净的条件下实 施。本发明现在将参照附

图1仅仅通过举例的方式进行描述，而在图1中显示了制剂 R0012 对频率的动态和复态粘度(dynamic and complex viscosities)。
具体实施例方式实施例实施例1称出以下详细的成分并在无菌条件下混合而配制成pH为6. 5至7. 5的HA凝胶。 HA凝胶随后在无菌条件下加入到注射器中而形成一次性注射器。注意，如磷酸钠的缓冲剂 能够用于这种制剂的制备中。所用的HMW HA是滴眼级别的或医疗器械级别的，具有800，000至1，200，000 的分子量，而获自 Novozymes A/S(Novozymes A/S, Krogshoejvej 36,2880 Bagsvaerd, Denmarko LMW HA是以商标名Resilin-200 进行销售的，其分子量为150，000至250，000， 而获自 Kyowa Hakko Bio Co. , Ltd(KyowaHakko Europe GmbH, Am ffehrhahn 50, D-40211 Diisseldorf)。所制备的各个制剂如下表1所示。 表1安全和精子运动测试如以下对样品B10至B14而采用获自几个捐献者的人体精子 进行实施。精子-制剂接触分析进行实施。每一制剂采用来自20个不同捐献者的精子进行 分析。精子样品子啊37°C下培养30min而容许其液化。精子浓度采用CER0S计算机辅助 精子分析仪(CASA，Hamilt0n Thorne)进行测定，而采用设计用于支持雄性和雌性配子的制 剂和体外受精的介质的G-IVF PLUS (Vitrolife)稀释至25 X 106个精子/mL。其含有支持 受精事件所需的碳水化合物和氨基酸。大约25X 106个精子/mL的精子用10% (v/v) ‘制 剂，或缓冲剂对照(90 u L精子和10 uL 100%制剂/G-IVF PLUS)在37°C下培养30min, 而游动性随后采用CASA进行评价。选用的制剂10%的浓度表示在性交之后与子宫粘液和 精液混合之后潜在地存在的润滑剂浓度。对于游动性评价，活动性精子和渐进活动性的百分数进行测定。对于每一复制品， 评价最少200个精子。任何移动超过5 u m/s的精子就认为是活动性的，而任何平均通道速 度(VAP) > 25 y m/s而直线性(STR，按照[直线速度(VSL)/VAP] xlOO计算)> 80%的活 动性的精子，都认为是渐进活动性的。对于20个捐献者的每一个，分析按照4组进行(对 于每个精液/精子制剂培养测定四个等分试样)。四个等分试样(约800个分析的细胞)提供强健性分析。为了测定是否制剂对精子运动具有任何影响，结果与G-IVF PLUS和Pre 进行对 比。Pre 是一种阴道润滑剂，其能够在复制再生过程如宫腔内人工授精和胚胎移植期间进 行使用。G-IVF PLUS和Pre 二者都是商业可获得的产品，而在实验的描述中他们提供了 对照数据。一旦获得数据，游动性降低或增强都可以进行计算。为了确定游动性变化是否 是统计显著性的，实施Marm-Whitney-Wilcoxon双尾分析，其中p值为0. 05或更低，表明差 异在95%的置信区间内而因此具有统计意义。为了评价制剂对低、中或高质量的精子的任何细微差别影响，捐献者根据其原始 百分数游动性进行分组。在他们的精子中具有<25%，25%至60%和>60%的活动性精子 的那些分别被认为是低、中和高游动性的。游动性的平均变化对于在每一游动性组中的每 一制剂进行计算，而数据与G-IVF PLUS对照采用Marm-Whitney-Wilcoxon双尾分析进行 对比。毒性评价采用DNA破坏的TUNEL分析法进行实施。TUNEL分析法 (Fluorescein-FragEL试剂盒，VWR)对于一个捐献者(D053)，在独立的精子-制剂接触分 析之后立即进行实施。简而言之，对于每一制剂，约1 X 106个精子在聚-L-赖氨酸涂片上 涂片，空气干燥，并用甲醇固定。细胞用蛋白激酶K渗透化处理，而FITC-标记的核苷酸采 用TdT酶加入到DNA断裂(DNA breaks)中。未结合核苷酸在用荧光素-FragEL封固剂介 质盖玻片封固之前冲洗掉。200个精子细胞对于每一制剂培养的DNA破坏(荧光)进行评 分。作为阳性对照，在另一涂片(用G-IVF PLUS培养的约IX 106个精子涂片)上在加入 TdT酶之前通过用脱氧核糖核酸酶培养20min而诱导DNA破坏。以下表2显示了在各种润滑剂中精子的游动性，并显示了在润滑剂B10至B14和 Pre 中精子的游动性相比于对照润滑剂G-IVF PLUS的差异。
制剂对精子游动性的影响: 单个和总平均 “制剂”
捐献者参数G-IVFB10BllB12B13B14Pre游动性(％)55.456.856.258.653.058.052.1D017S.D.(%)1.57.55.55.27.84.44.7A游动性(％)1.40.83.2-2.42.6-3.3游动性(％)41.454.550.545.443.571.437.3D019S.D.(%)8.510.524.25.911.010.78.7A游动性(％)13.19.14.02.130.0-4.1游动性54.255.761.052.757.853.858.6D022S.D.(%)9.09.05.43.57.33.39.7A游动性1.56.8-1.53.4-0.44.4
12 为了确定对制剂的响应对于质量差的精子相比于质量好的精子是否是不同的，则 将捐献者分组成低、中和高游动性组而比较游动性的平均变化(参见下表3)。 表3在独立精子的低游动性组中，由于用三种制剂B11，B12和B13进行培养而 游动性显著增加，这三种制剂分别显著地提高了游动性7. 6 士 1.4%，10. 3 士 2. 4%和 13. 0士4. 4%。进一步的测试进行实施而确定制剂是否对精子具有毒性。采用TUNEL分析法评价 独立精子-制剂接触分析之后具有DNA破坏的精子百分数。加入到用G-IVF PLUS培养的 独立精子中的含有脱氧核糖核酸酶的对照涂片表明，分析是可靠的，而99%的精子表现出 DNA破坏的信号。相反，来自任何独立的精子-制剂接触分析的精子中不到2%，含有破坏 的DNA，而且看起来G-IVF PLUS对照与没有脱氧核糖核酸酶没有差别。精子运动测试表明，本制剂相比于商业可获得的产品，Pr6，并未对精子产生的更 多有害作用。当与精液混合或独立的精子混合时，该制剂并没有显著降低精子运动或渐进性游动性。实际上，制剂B11，B12和B13，都含有HMWHA和LMW HA的组合，对低精子运动的 样品提供了游动性增强作用。改进稳定性的其它样品根据表1中组成并包含酸处理的HA进行制备。其它制剂采用HMW HA和壳多糖制备。所用HMW HA是滴眼液级别的或医疗器械 级的，所具有的分子量为 800, 000 至 1，200，000，而获自 NovozymesA/S(Novozymes A/S， Krogshoejvej 36,2880 Bagsvaerd，Denmark。壳多糖所具有的估计分子量为 10，000 至 500，000，而获自 FMC BioPolymer (FMCBioPolymer, 1735 Market Street, Philadelphia, PA 19103，USA)。粘度为20至200mPa. s的壳多糖也能够使用。通过将HA和壳多糖在干净的250mL烧杯中混合而获得20. 2g制剂进行制备。如 此形成的混合物在置于无菌标记容器中之前搅拌lh。制备的制剂如下表4中所示。 M4经过实验而测定制剂R0010至R0019的稳定性。流变学性质采用频率扫描剪切试 验进行测试。样品的扫频鉴于双同心圆筒流变计，以500 y m的隙，17. 95 u Nm/s2的几何惯 量在25°C进行实施。7mL膜围绕内筒制成而频率按照0. 6至250rad/s进行变化。5mL的样 品保持在37°C的水浴中2h，而剪切试验再次实施。剪切试验对每一样品重复3次。剪切测试实验的结果表明，随着频率在0. 6至250rad/S内增加而动态粘度降低。 这表明剪切稀化是制剂的主要行为。参照图1，显示了举例说明制剂R0012动态和复态粘度随着频率升高而降低的曲 线图。
15
表 5 由表5能够看出，热处理显著降低了 R0019的粘度(其未含有壳多糖(即，没有 LMW组分)，而加入壳多糖有助于维持实际含有壳多糖的制剂R0010至R0018的粘弹性。在另外的实施例中，以上描述的制剂按照用量0. 至1衬％提供DNA。在另一实施例中，以上描述的制剂按照用量23%至38衬％提供苄索氯铵。而且，稳定性改进的其它样品根据表4中的组成并包含LMW HA组分进行制备。另外的样品采用分子量为2，000，000至3，000，000而获自 HTLBiotechnology (HTL, Z1 de I' Aumaillerie, 35133 Javene, France)的高分子量 HA 进 行制备。而且，另外的样品采用分子量为750，000至1，400, 000且可获自NovozymesA/S或 类似的供应商的高分子量HA进行制备。还有的样品采用获自Kyowa的分子量为25，000至60，000而平均分子量为50，000
的低分子量组分低分子量HA进行制备。还有的样品采用由高分子量的HA发酵，热降解，自由基降解和/或微波处理而制 备的低分子量组分低分子量HA进行制备。例如，平均分子量为约2，000，000的HA，通过采 用Fenton氏实际(H202/Fe2+)进行自由基解聚而降解成低分子量HA，而形成分子量为5，000 至200，000的低分子量HA。用于由高分子量HA制备低分子量HA的另一方法涉及将高分子量HA暴露于100 °C的干热下15min，这能够提供HA分子量约2比2和半倍降低。通过调节加热时间，就能生成 不同的分子量范围。还有的样品能够采用分子量为1，000至750，000而能够获自FMCBioPolymer的壳 多糖进行制备。本申请的发明提供了一种提高抗剪切力的润滑剂，而因此其能够作为更长时间的 润滑剂。而且，本发明的润滑剂能够提高精子的游动性，而尤其是能够用于提高低游动性精 子的游动性。因此本发明具有的应用是作为改进，辅助或增强自然或人工受精的机率的润 滑剂，而尤其是适用于体外受精治疗。对于本发明，按照本文中的描述可以作出其它修改和改进，而不会偏离预定的范围。
权利要求
一种包括分子量为750,000至3,000,000的高分子量HA和分子量为1,000至500,000的低分子量组分的阴道润滑剂，其中高分子量HA与所述低分子量组分的比率为9∶1w/w至1∶9w/w。
2.根据权利要求1所述的润滑剂，其中所述高分子量组分的分子量为750,000至 1，400，000。
3.根据权利要求1和2中任一项所述的润滑剂，其中所述高分子量组分的分子量为 800，000 至 1，200，000。
4.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，其中所述低分子量组分的分子量为10，000 至 500，000。
5.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，其中所述低分子量组分的分子量为150,000 至 250，000。
6.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，其中所述低分子量组分是HA或壳多糖。
7.根据权利要求6所述的润滑剂，其中当所述低分子量组分是HA时，高分子量HA与低 分子量组分的比率为3 lw/w至1 3w/w。
8.根据权利要求6所述的润滑剂，其中当所述低分子量组分是壳多糖时，所述低分子 量组分的表观粘度为20mPa. s至200mPa. s。
9.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，具有2mPa.s至1，OOOmPa. s的粘度。
10.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，具有6.5至7. 4的pH值。
11.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，含有由微生物枯草杆菌生产的HA。
12.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，含有所述高分子量HA，所述低分子量组分 和酸处理的HA。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的润滑剂，含有所述高分子量HA，所述低分子量组分和壳多糖。
14.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，含有浓度为以重量计0.至的DNA。
15.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，其中所述润滑剂并不含有抗氧化化合物或 组合物。
16.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，含有适用于治疗性传播疾病(STD)的药物。
17.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，其形式为凝胶、泡沫、软膏、液体或喷雾。
18.根据前述任一权利要求所述的润滑剂，其中所述润滑剂并不含有羟乙基纤维素，羟 丙基纤维素，羧甲基纤维素，葡聚糖，粘液素，卵磷脂或角叉菜胶。
19.一种提供阴道润滑的方法，包括向需要其的患者的阴道施用根据前述任一权利要 求所述的阴道润滑剂的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中接触所述阴道润滑剂的精子的游动性维持不变 或提高。
21.根据权利要求1至18中任一项所述的阴道润滑剂，用于治疗。
22.根据权利要求1至18中任一项所述的阴道润滑剂，用于提供阴道润滑作用。
23.一种促进受精的方法，包括向需要其的患者的阴道施用根据权利要求1至18中任 一项所述的阴道润滑剂的步骤。
24.根据权利要求1至18中任一项所述的阴道润滑剂，用于促进受精。
25.—种递送药物性或营养性组合物或类似物的方法，包括向需要其的患者的阴道施 用根据权利要求1至18中任一项所述的阴道润滑剂的步骤。
26.根据权利要求1至18中任一项所述的阴道润滑剂，用于递送药物性或营养性组合 物或类似物。
27.—种生产根据权利要求1至18中任一项所述的阴道润滑剂的方法，包括以下步骤组合分子量为750，000至3，000, 000的高分子量HA和分子量为1，000至500，000的 低分子量组分，其中所述高分子量HA与所述低分子量组分的比率为9 lw/w至1 9w/w。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述高分子量组分的分子量为750，000至 1，400，000。
29.根据权利要求27和28中任一项所述的方法，其中所述高分子量组分的分子量为 800，000 至 1，200，000。
30.根据权利要求27至29所述的方法，其中所述低分子量组分的分子量为10，000至 500，000。
31.根据权利要求27至30所述的方法，其中所述低分子量组分的分子量为150，000至 250，000。
32.根据权利要求27至31所述的方法，其中所述低分子量组分是HA或壳多糖。
33.根据权利要求32所述的方法，其中当所述低分子量组分是壳多糖时，所述低分子 量组分的表观粘度为20mPa. s至200mPa. s。
34.根据权利要求26至33所述的方法，其中形成了根据权利要求1至17中任一项所 述的阴道润滑剂。
35.一种含有根据权利要求1至18中任一项所述的润滑剂的产品。
36.根据权利要求35所述的产品的形式为一次性使用的预填充注射器或具有一次性 喷嘴的喷雾容器。
全文摘要
一种包含结合低分子量透明质酸和/或壳多糖的高分子量透明质酸的阴道润滑剂，改进了稳定性并适用于，例如，维持和/或促进精子运动。
文档编号A61P15/08GK101861154SQ200880116597
公开日2010年10月13日 申请日期2008年11月19日 优先权日2007年11月19日
发明者凯文·亚历山大·伯德, 赵晓斌 申请人:博迪卡生物有限公司