近红外色素结合的透明质酸衍生物和包括其的光学成像用造影剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及近红外色素结合的透明质酸衍生物和包括该透明质酸衍生物的光学 成像用造影剂。
【背景技术】
[0002] 作为一种用于将活体的内部的信息可视化的装置，已知光声断层照相（以下有时 简写为"PAT"）装置。包括使用该PAT装置的测定中，对用光照射待测定的物体时由在待测 定的物体中吸收光的物质（光吸收剂）发出的光声信号的强度和产生信号的时间点进行测 定，由此能够得到其中对待测定的物体中的物质分布进行操作的图像。
[0003] 只要光吸收剂在活体中吸收光以发出声波，能够将任何光吸收剂用作光吸收剂。 例如，人体中血管或恶性肿瘤能够用作光吸收剂。此外，能够将分子例如吲哚花青绿（以下 有时简写为"ICG"）给药于物体以用作造影剂。ICG能够适合用作PAT装置中的造影剂，原 因在于对人体给药时ICG具有小的影响，而且吸收对活体具有高透过性的近红外波长区域 中的光。应指出地是，本文中使用的术语"ICG"是指由下述结构表示的化合物。
[0004] 通式（10)
[0005]
[0006] 应指出地是，抗衡离子可不是Na+并且能够使用任意的抗衡离子例如H +或K +。
[0007] 此外，由于该化合物吸收近红外光以发出近红外荧光，因此ICG已用于荧光成像。 换言之，将ICG给药于待测定的物体，一段时间后，测定从外部用光照射该物体时由待测定 的物体中吸收光的ICG发出的荧光信号，由此能够将待测定的物体中的ICG分布成像。例 如，能够使前哨淋巴结可视化。
[0008] 但是，已知ICG在血液中的半衰期为约几分钟，这是极短的。
[0009] 鉴于上述内容，非专利文献1报道了如下实例，其中通过使上述的ICG的亲水性 衍生物（ICG-OSu)与作为天然多糖的具有40, 000的分子量的透明质酸结合以形成各自具 有188nm的平均颗粒直径的纳米颗粒来进行淋巴结或肿瘤的荧光体内成像。该报道显示与 ICG单独相比，该衍生物在血液中长时间残留并且在淋巴结或肿瘤中积累。
[0010] 专利文献1报道了如下实例，其中通过使作为亲水性近红外色素的IR783与透明 质酸结合来进行淋巴结的荧光体内成像。
[0011] 专利文献2报道了已使荧光素共价结合的透明质酸衍生物，并且该衍生物已用于 测定葡糖胺多糖降解酶的活性的方法。
[0012] 非专利文献2报道了通过使聚乙二醇（以下有时简写为"PEG"）与具有2, 500, 000 的分子量的疏水化透明质酸结合而得到的透明质酸衍生物的纳米颗粒。此外，该文献报道 了其中使PEG和亲水性近红外色素 Cy5. 5结合的疏水化透明质酸衍生物的纳米颗粒、通过 使近红外色素与上述纳米颗粒共价结合而得到的纳米颗粒，并且报道了荧光体内成像的实 例。
[0013] 引用列表
[0014] 专利文献
[0015] PTL I :US 专利申请公开 2008/0056999A
[0016] PTL 2 :日本专利申请公开No. 2006-25625
[0017] PTL 3 :日本专利申请公开 No. 2009-155486
[0018] 非专利文献
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[0023] NPL 5 :Μ· H. Oudshoorn，等，Polymer，48,第 1915 页（2007)
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[0028] NPL 10 :G. Testa，等，Int. J. Pharm.，378,第 86 页（2009)
【发明内容】
[0029] 技术问题
[0030] 为了可以将该化合物以高灵敏性用作光学成像用造影剂，需要化合物的ICG含量 高。化合物的ICG含量低时，被转运到目标组织的ICG的量减少并且造影灵敏性变得不足。 结果，产生对将大量的含有ICG的化合物给药的需要。已需要具有高ICG含量的含有ICG 的化合物以致病人不会承担过重的负担。此外，已希望含有ICG的化合物具有适度的在血 液中的保持性并且能够高效率地达到目标组织例如肿瘤。
[0031] 非专利文献1中公开的含有亲水性ICG衍生物的化合物的ICG含量低达约10%。 此外，专利文献1中公开的含有亲水性IR783的透明质酸衍生物中导入的色素的比例未知 并且未对该衍生物进行任何使用聚乙二醇的改性以使该衍生物在活体中稳定。专利文献2 中公开的已结合有荧光素的透明质酸衍生物的情况下，由于荧光素不是近红外色素，因此 难以高效地检测活体中存在的透明质酸衍生物。此外，相对于具有40, 000的分子量的透明 质酸，装载20当量的色素。因此，即使反应以100%进行，色素含量也至多为20%。
[0032] 此外，非专利文献2中公开的透明质酸衍生物的纳米颗粒已用聚乙二醇进行了改 性，但导入色素的比例未知并且该文献没有公开任何有关其最佳值的内容。上述现有技术 没有公开以高含量将近红外色素，例如ICG衍生物导入透明质酸的方法和分子设计以及用 于改善其在血液中的保持性和肿瘤积累性的分子设计。
[0033] 问题的解决方案
[0034] 本发明提供透明质酸衍生物，包括由各自由下述通式（1)表示的单元形成的聚合 物，其中=R 1在通式（1)中的单元与单元之间彼此独立；和该聚合物含有至少一个具有下述 通式（2)和下述通式（25)中的一者作为通式（1)中的R 1的单元，和/或至少一个具有下 述通式（3)作为通式（1)中的R1的单元：
[0035]通式（1)
[0036]
[0043] 条件是：通式（2)、通式⑶和通式（25)中，L表示在单元与单元之间彼此独立的 连接基，和*表示与通式（1)中的N的结合位置；和通式（3)中，R 2表示H、0H、OMe、NH 2和 COOH的任一个，和k表示20-200的整数。
[0044] 由以下参照附图对例示实施方案的说明，本发明进一步的特征将变得清楚。
【附图说明】
[0045] 图IA表示含有近红外色素的透明质酸衍生物的结构式，图IB表示发近红外光的 化合物ICG-炔烃的合成路线，和图IC表示ICG-炔烃的UV-可见-近红外吸收光谱。
[0046] 图2表示透明质酸四丁基铵盐HA-NBu4的合成路线。
[0047] 图3A表不具有置氣基的透明质酸衍生物3的合成路线和图3B表不将具有置氣基 的胺导入透明质酸的路线。
[0048] 图4A表示只具有ICG的透明质酸衍生物HA-ICG的合成路线，和图4B表示具有 ICG和PEG的透明质酸衍生物1的合成路线。
[0049] 图5A是表示颗粒直径与ICG含量之间的关系的坐标图，和图5B是表示颗粒直径 与透明质酸的分子量之间的关系的坐标图。
[0050] 图6表示具有ICG、PEG和GA的透明质酸衍生物2的合成路线。
[0051] 图7是表示相对于其对小鼠的注射剂量、色素的残留率的坐标图。
[0052] 图8A是表示给药后9小时和24小时每个样品的ICG含量与血液中的色素残留率 之间的关系的坐标图，和图8B是表示给药后9小时和24小时每个样品的PEG含量与血液 中的色素残留率之间的关系的坐标图。
[0053] 图 9 表示透明质酸衍生物 la、lb、lc、lh、li、lk、ll、2a(GA)、2as(GAs)、2b(GA2)、 2d(GA3)和2c (GA4)的给药后24小时小鼠的荧光图像。
[0054] 图IOA是表示给药后24小时小鼠肿瘤图像的SNR的坐标图和图IOB是表示肿瘤 积累性的坐标图。
[0055] 图11是表示每个样品的PEG含量和ICG含量与肿瘤积累性之间的关系的坐标图。
[0056] 图12表示衍生物3 (羧基的转化率大于99 % )的1H-NMR图。
[0057] 图13表示衍生物Ia的1H-NMR图。
[0058] 图14表示衍生物2a (GA)的1H-NMR图。
[0059] 图15表示透明质酸衍生物Ia的水溶液的浓度与散射光的强度之间的关系。
[0060] 图16A表示衍生物la、lb、Ic和2as (GAs)和用于比较的ICG的吸收光谱和图16B 表示在790nm的激光波长下衍生物Ia的光声信号（电压）的时间变化谱。
[0061] 图17是表示用它们的吸光度归一化的本发明的化合物和用于比较的ICG的光声 信号的强度的坐标图。
[0062] 图18表示本发明的化合物的透明质酸单元的表观分子量、与透明质酸结合的ICG 衍生物的数目、整个聚合物的分子量和790nm下透明质酸衍生物的吸收系数的汇总。
[0063] 图19A表示通过使用具有5K的分子量的透明质酸合成的透明质酸衍生物1和2 的每个中的cac与PEG含量之间的关系，和图19B表示通过使用具有8K的分子量的透明质 酸合成的透明质酸衍生物1和2的每个中的cac与PEG含量之间的关系。
[0064] 图20A表示基于TEM观察的透明质酸衍生物2b (GA2)的颗粒直径分布，图20B表 示透明质酸衍生物2b (GA2)的TEM观察图像，和图20C表示基于TEM观察的透明质酸衍生 物2e(GA5)的颗粒直径分布。
[0065] 图21A表示含有具有磺酰基的近红外色素的透明质酸衍生物4的结构式，图21B 表示近红外色素 ICG-S-炔烃的合成路线，和图21C表示ICG-S-炔烃的UV-可见-近红外 吸收光谱。
[0066] 图22表示具有ICG-S和PEG的透明质酸衍生物4的合成路线。
[0067] 图23A表示具有PEG-5K的含有近红外色素的透明质酸衍生物5的结构式和图23B 表示PEG-5K-炔烃的合成路线。
[0068] 图24A表示具有ICG和PEG-5K的透明质酸衍生物5的合成路线，和图24B表示具 有近红外色素的高分子量透明质酸衍生物6的合成路线。
[0069] 图25A表不给药后24小时已将透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b给药于其 的小鼠的荧光图像和图25B是表示给药后24小时已将透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和 6b给药于其的小鼠的小鼠肿瘤图像的SNR的坐标图。
[0070] 图26A是表示透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b的血液中色素残留率与肿瘤 积累性的坐标图，和图26B是表不透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b的光声信号的相 对强度的坐标图。
[0071] 图27表示具有ICG、PEG和R⑶的透明质酸衍生物7 (通式（31))的合成路线。
【具体实施方式】
[0072] 对本发明的实施方案进行说明。根据本实施方案的化合物具有下述结构，其中使 ICG衍生物与具有PEG的透明质酸结合，并且通过连接分子使PEG和ICG衍生物各自与透明 质酸的骨架的葡糖醛酸单元中存在的羧基结合。
[0073] 根据本发明的一个实施方案，提供透明质酸衍生物，包括由各自由下述通式（1) 的表示的单元形成的聚合物，其中=R 1在通式（1)中的单元与单元之间彼此独立；和该聚合 物含有至少一个具有下述通式（2)或下述通式（25)作为通式（1)中的R 1的单元，和至少 一个具有下述通式（3)作为通式（1)中的R1的单元：
[0074]通式（1)
[0075]
[0076] 通式（2)
[0077]
[0082] 条件是：通式（2)、通式（3)和通式（25)中，L表示在单元与单元之间彼此独立的 连接基，和*表示与通式（1)中的N的结合位置；和通式（3)中，R 2表示H、0H、OMe、NH 2和 COOH的任一个，和k表示20-200的整数。
[0083] 此外，通式（2)、（3)和（25)中的连接基L可彼此相同或不同。连接基L的实例 包括可被取代的具有1-10个碳原子的直链或支化烷基、和由下述通式（22)-(24)表示的结 构。烷基的取代基为例如具有1-3个碳原子的烷基、卤素原子、或氨基。
[0084] 通式（22)
[0085]
[0086] 通式（22)中，a、b和c各自独立地表示1-10的整数。
[0087] 通式（23)
[0088]
[0089] 通式（23)中，d和e各自独立地表示1-10的整数。
[0090] 通式（24)
[0091]
[0092] 通式（24)中，f和g各自独立地表示1-10的整数。
[0093] 各自具有通式（2)或（25)作为R1的单元数用X表示并且聚合物中的全部单元数 用N表示时，X和N优选地满足由下式（i)表示的关系。
[0094] 0· 13〈x/N 彡 0· 78 式⑴
[0095] 此外，各自具有通式（3)作为R1的单元数用y表示并且聚合物中的全部单元数用 N表示时，y和N优选地满足由下式（iii)表示的关系。
[0096] 0· 22〈y/N 彡 0· 99 式（iii)
[0097] 根据本发明的另一实施方案，提供透明质酸衍生物，包括由各自由通式（1)表示 的单元形成的聚合物，其中=R 1在通式（1)中的单元与单元之间彼此独立；R1选自由通式 (2)、（3)和（25)以及下述通式（4)、（5)和（29)组成的组；和该聚合物含有至少一个具有 通式（2)或（25)作为R 1的单元，和至少一个具有通式（3)作为R1的单元：
[0098]通式（4)
[0099]
[0100] 通式（5)
[0101] * -L-R3
[0102]通式（29)
[0103]
[0104] 条件是：通式（2)_(5)、（25)和（29)中，L表示单元与单元之间彼此独立的连接 基，和*表示与通式（1)中N的结合位置；和通式（3)中，R 2表示H、0H、0Me、NH 2和COOH的 任一个，和k表示20-200的整数；和通式（5)中，R3表示N 3、H、CH3、NH2、SH和COOH的任一 个。通式（2)-(5)、（25)和（29)中的连接基L可以彼此相同或不同。连接基L的实例包括 可被取代的具有1-10个碳原子的直链或支化烷基、和由通式（2