素的透明质酸衍生物6。
[0292] 通过同时使ICG-炔烃和PEG-炔烃与具有叠氮基的透明质酸类似物3结合，能够 各自得到各自具有ICG和PEG的高分子量透明质酸衍生物6(图24B和表7)。以下对典型 的合成例进行说明。在氮气氛下，将23mg的衍生物3 (MW(HA-Na) =25K，50 μ mol，以最小 单元计，叠氮化效率：>99% )装入25-ml Schlenk烧瓶中，然后溶解于2ml的无水DMF中。 将17mg(25ymol)的ICG-炔烃和0· 15g(75ymol)的PEG-炔烃已添加到该溶液中后，将 2. 9mg(15 μπιο?)的CuI和2. 3mg(15 μπιο?)的DBU添加到该混合物中，然后将整体在60°C 下搅拌一夜。将2毫升的水添加到该溶液中，然后用具有25K的分子量截止的透析膜对该 混合物相对于水进行透析24小时。用过滤器（孔直径：0. 45 μm)对得到的水溶液进行过 滤，然后冷冻干燥以提供42mg(35% )的作为深绿色固体的具有ICG和PEG的透明质酸衍生 物6。通过1!1-匪1?(1!1-匪1?(4001抱，0 20,25°(：)3/??111;1.71-2.13(111，3!1)，3.22-4.00(111，390 H)，4. 30-4. 53 (m, 2H)，7. 93 (br s, 0· 99H))进行其鉴别。
[0293] 该反应的再现性差。此外，相对于使用的ICG的量的低导入量是特征所在。
[0294] 应指出地是，基于通过1H-NMR在3-叠氮基-1-丙基胺的2-位的2H(1. 67ppm)的 减少率，计算环化反应的转化率。如下确定ICG部分的导入率：测定具有ICG和PEG的透明 质酸衍生物的DMF溶液的UV光谱，然后通过使用ICG-炔烃作为标准物质，基于在其最大吸 收波长（790nm左右）下的吸光率确定该比率。由叠氮基的转化率和ICG部分的导入率计 算PEG部分的导入率。此外，用基于ICG和PEG部分的导入率计算的分子量确定收率。
[0295] 透明质酸衍生物6a和6b的cac分别为14和18 (X 10 4g/L)。
[0296] 表7.具有近红外色素的高分子量透明质酸衍生物6的合成
[0297]
[0298] a由基于ICG和PEG部分的导入率的分子量计算。
[0299] b由UV-可见测定中吸光率和1H-NMR的积分值计算。
[0300] 聚合物溶解在水中后通过动态光散射确定。
[0301] 4两种颗粒之间的散射强度比为1:2。
[0302] 1等聚合物溶解于DMF中；将该溶液与相同量的水混合；和通过透析将DMF除去后 通过光散射确定。
[0303] (实施例9 :通过荧光成像的肿瘤造影能力的评价）
[0304] 采用与上述实施例3相同的方法对上述实施例6-8中得到的化合物评价它们的肿 瘤造影能力。关于已将透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b给药的小鼠的全身焚光图像， 在给药后24小时，用IVIS(商标）Imaging System 200系列（XEN0GEN)获得小鼠的亮场图 像和荧光图像。注射剂量为50nmol每个小鼠，以色素量计，并且作为100 μ L的PBS溶液将 色素注入每个小鼠的尾部静脉。图25Α示出给药后24小时小鼠的荧光图像。在所有样品 中观察到图25Α中用白色箭头表示的肿瘤位置处的荧光信号。结果显示本发明的透明质酸 衍生物能够对肿瘤造影并且作为肿瘤的光学成像用造影剂显示其有效性。
[0305] 图25Β中，由图25Α中所示的荧光成像数据得到肿瘤位置（测定区域： 0.5X0. 5cm)的荧光强度与腿根部（作为正常位置选择，测定区域：0.5X0.5cm)的荧光强 度之比，然后作为信噪比（SNR)转化为数值。即，SNR为显示各个化合物的肿瘤可视力的参 数并且随着SNR增大，该化合物作为肿瘤的光学成像用造影剂变得更有效。由图25B显示， 所有化合物的SNR为1. 5以上，并且由于它们特别高的SNR，因此衍生物4b和6b是具有优 异的肿瘤造影能力的化合物。
[0306] (实施例10 :肿瘤积累性和血液中色素残留率的评价）
[0307] 通过确定实施例9中进行的肿瘤造影实验的小鼠的肿瘤中色素的量和其血液中 色素的量来对透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b评价它们的肿瘤积累性和血液中色素 残留率。采用与实施例4相同的方法评价肿瘤积累性。采用与实施例2相同的方法评价血 液中色素残留率。图26A示出结果。在已经将根据本发明的透明质酸衍生物给药的肿瘤中 检测到色素，因此确认了在肿瘤中积累。肿瘤积累性在1. 7% -18. 5%的范围内并且衍生物 6b显示最高的肿瘤积累性，8卩，18. 5% ID/g。尽管其在血液中的色素残留率低的事实，但由 于其肿瘤积累性较高，因此发现具有ICG-S和PEG的透明质酸衍生物4是具有高肿瘤选择 性的化合物。观察到下述倾向：随着ICG含量增加，肿瘤积累性降低。在具有ICG和PEG-5K 的透明质酸衍生物5中，与具有2K的PEG分子量的化合物（例如衍生物Ii)相比，肿瘤积 累性降低，而血液中色素残留率增加。具有近红外色素的高分子量透明质酸衍生物6的肿 瘤积累性和血液中浓度高。可能由于其在血液中极高的保持性，肿瘤积累性改善。
[0308] (实施例11 :光声信号的测定）
[0309] 以与实施例5中相同的方式测定透明质酸衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b的光声信 号。作为比较例，同样地对ICG的水溶液进行测定。图26B表示相对于ICG的光声信号强 度的本发明的化合物的光声信号强度。由图26B可以看到，衍生物4a、4b、4c、5a、5b和6b 能够发出光声信号并且能够提供比ICG高的光声信号强度。具体地，具有ICG-S和PEG的 透明质酸衍生物4与ICG相比，显示光声信号强度增加1. 3-1. 4倍。信号强度增加的可能 的机理是例如，色素自身的热转换效率高于ICG，或者色素的分子强烈地聚集并且将色素与 作为介质的水屏蔽，因此捕集热。本实施例的结果已确认本发明的化合物作为光声造影剂 发挥功能。
[0310] (实施例12 :从患有癌症的小鼠的肿瘤位置的光声信号的强度测定）
[0311] 如下所述测定从患有癌症的小鼠的肿瘤位置的光声信号的强度。使用可商购的光 声成像装置（Nexus 128,由Endra Inc.制造）。将光的波长设定为790nm。在本发明的化 合物的给药前和给药后24小测定来自肿瘤位置的光声信号，然后对每个信号获得三维重 组数据。用得到的三维重组数据和软件（GEHC MICROVIEW，GE Healthcare)定作为关注区 域（ROI)的整个测定区域（2cmX2cmX2cm)的光声强度。将实施例3中所述的小鼠用作患 有癌症的小鼠。将根据本发明的实例的化合物1&、1(3、112(3、28、4 &和413和作为对照的生 理盐水药。对于注射剂量的每种化合物，将50nmol的ICG给药于小鼠。
[0312] 表8表示给药前和给药后24小时来自肿瘤位置的光声信号之比在全部化合物中， 发现与参照相比，给药后光声信号增大。结果已明本发明的化合物能够进行肿瘤的光声成 像。
[0313]
[0314] (实施例13 :具有ICG、PEG和R⑶的透明质酸衍生物7的合成）
[0315] 通过将环状R⑶肽导入相对于透明质酸衍生物3 (表1，项目No. 3)未反应的HA的 羧基部分，其中已将3-叠氮基-1-丙基胺部分地导入HA，其在实施例1 (4)中得到，从而合 成具有叠氮基和RGD的透明质酸衍生物，然后进行ICG和PEG与衍生物的结合（图27)。以 下对具体实施例进行说明。
[0316] 通过使12mg的在表1的项目No. 3的条件下得到的其90%的基团已结合有3-叠 氮基-1-丙基胺的透明质酸衍生物（Mff(HA-Na) =8K，30 μ mol，以最小单元计）进行实施 例1(2)中所述的反应，从而进行阳离子交换。随后，在氮气氛下，将9. 7mg的得到的白色 固体（20 μ mol，以最小单元计）装入25-mL Schlenk烧瓶中，然后溶解于0. 50ml的无水 DMSO中。将9. 5毫克（18 μ mol)的PyBOP和2. 4mg (18 μ mol)的HOBt添加到该溶液中。然 后，将Ilmg (18 μ mol)的环状R⑶肽（RGD-NH2)的I. Iml的DMSO溶液添加到该混合物中， 然后在室温下将整体搅拌18小时。将水添加到该溶液中，用CH2CV冼涤水层，并且用具 有3. 5K的分子量截止的透析膜对水层进行透析24小时。以两阶段将产物冷冻干燥以提 供6. 5mg(43% )的作为白色固体的透明质酸衍生物，其中叠氮基的导入效率和R⑶的导入 效率分别为90%和10%。通过1H-NMR进行其鉴别。应指出地是，由透明质酸中N-乙酰基 (Ac)的3H(1.87ppm)与R⑶的苯基丙氨酸中苯基（Ph)的5H(7.05-7.28ppm)之比，计算RGD 的导入效率。结果如下：111-匪1?(4001抱，020,25°(：)6/??111 ;1.69(8，1.8!1)，1.88(8,3!1)，3· 00-3. 85 (m, 14H)，4. 39 (m, 2H)，7. 05-7. 28 (m, 0· 50H)。
[0317] 接下来，使ICG-炔烃和PEG-炔烃作用于在与实施例1 (5)的那些相同的反应条件 下在上述得到的具有叠氮基和R⑶的透明质酸衍生物以以53%的收率提供具有ICG、PEG和 R⑶的透明质酸衍生物7(图27)。ICG、PEG和RGD之间的导入率为17:73:10。通过1H-NM R (1H-NMR (400MHz, D2O, 25°〇 δ /ppm ；1. 70-2. 15 (m, 3H), 3. 10-4. 00 (m, 261H), 4. 25-4. 50 (m, 2H)，7.94(br s，0.89H))进行其鉴别。应指出地是，通过本申请说明书的[0079]中记载的 方法确定环化反应的转化率。水中自组装形成的所得化合物具有94±68nm的颗粒直径和 4. OX 10 4g/l的临界凝聚浓度。
[0318] 本发明的有利效果
[0319] 本发明人首次发现，通过同时使ICG衍生物和PEG与透明质酸结合，能够增加透明 质酸衍生物的ICG含量，并且成功地开发了具有高ICG含量的透明质酸衍生物。如单独地 将ICG对活体给药的情形相比，根据本发明的透明质酸衍生物具有高的血液中的保持性或 者高的肿瘤中的积累性，并且从血液或肿瘤中发出的光声信号的强度大。此外，由于高ICG 含量，因此单位透明质酸的光声信号的强度大。
[0320] 尽管已参照例示实施方案对本发明进行了说明，但应理解本发明并不限于所公开 的例示实施方案。下述权利要求的范围应给予最宽泛的解释以包括所有这样的变形以及等 同的结构和功能。
[0321] 本申请要求于2013年2月22日提交的日本专利申请No. 2013-033633的权益，由 此通过引用将其全文并入本文。
【主权项】
1. 化合物，包括由各自由下述通式（1)表示的单元形成的聚合物，其中： Ri在通式（1)中的单元与单元之间彼此独立；和 该聚合物含有至少一个具有下述通式（2)和下述通式（25)中的一者作为通式（1)中 的Ri的单元和至少一个具有下述通式（3)作为通式（1)中的Ri的单元：条件是：通式（2)、通式（3)和通式（25)中，L表示单元与单元之间彼此独立的连接基， 和*表示与通式（1)中N的结合位置讯通式（3)中，R2表示H、0H、OMe、NH2和COOH的任 一个，和k表示20-200的整数。2. 根据权利要求1的化合物，其中聚合物中的各自具有通式（2)和通式（25)中的一者 作为Ri的单元数用X表示并且聚合物中的全部单元数用N表示时，X和N满足由下式（1) 表示的关系： 0. 13<x/N《0. 78 式（1)。3. 化合物，包括由各自由下述通式（1)表示的单元形成的聚合物，其中： Ri在通式（1)中的单元与单元之间彼此独立； Ri选自由下述通式（2)-巧）、下述通式（25)和下述通式（29)组成的组；和 该聚合物含有至少一个具有通式（2)和通式（25)中的一者作为Ri的单元和至少一个 具有通式（3)作为Ri的单元： 通式巧）大-l^-R3条件是：通式（2)-巧）、通式（25)和通式（29)中，L表示单元与单元之间彼此独立的连 接基，和*表示与通式（1)中N的结合位置；和通式（3)中，R2表示H、0H、OMe、畑2和COOH 的任一个，和k表示20-200的整数；和通式巧）中，R3表示N3、H、邸3、畑2、甜和C00H的任 一个。4. 根据权利要求3的化合物，其中聚合物中的各自具有通式（2)和通式（25)中的一者 作为Ri的单元数用X表示，聚合物中的各自具有通式（3)作为R1的单元数用y表示，并且 聚合物中的各自具有通式（4)和通式（29)中的一者作为Ri的单元数用Z表示时，x、y和Z 满足由下式似表示的关系： 0. 13<x/(x+y+z)《0. 78 式（2)。5. 根据权利要求3或4的化合物，其中该聚合物含有至少一个具有通式（4)和通式 (29)中的一者作为Ri的单元。6. 化合物，包括由各自由下述通式化)-巧）、下述通式（28)和下述通式（30)的任一个 表示的单元形成的聚合物，其中该聚合物含有至少一个由通式（6)和通式（28)中的一者表 示的单元和至少一个由通式（7)表示的单元，7. 根据权利要求6的化合物，其中该聚合物中各自由通式（6)和通式（28)中的一者表 示的单元数用X表示，该聚合物中各自由通式（7)表示的单元数用y表示，并且该聚合物中 各自由通式（8)、（9)和（30)中的一者表示的单元数用Z表示时，x、y和Z满足由下式（2) 表示的关系： 0. 13<x/ (x+y+z)《0. 78 式（2)。8. 化合物，包括由各自由通式（1)表示的单元形成的聚合物作为主链，其中： Ri在单元与单元之间彼此独立；和 该化合物结合有ICG类似物和两亲性分子中的一者作为Ri:条件是：各自具有ICG类似物作为Ri的单元数用X表示并且该聚合物中的全部单元数 用N表示时，X和N满足由下式（1)表示的关系： 0. 13<x/N《0. 78 式（1)。9. 颗粒，包括根据权利要求1-8的任一项的化合物。10. 光声成像用造影剂，包括： 根据权利要求1-8的任一项的化合物；和 分散介质。11. 根据权利要求9的颗粒，其中该颗粒具有10nm-180nm的平均颗粒直径。12. 光声成像用造影剂，包括： 根据权利要求9的颗粒；和 该颗粒的分散介质。13. 透明质酸衍生物的制备方法，包括在两亲性分子的存在下使ICG衍生物与透明质 酸彼此反应。14. 根据权利要求13的透明质酸衍生物的制备方法，其中该两亲性分子包括聚乙二 醇。
【专利摘要】本发明提供具有高ICG含量的化合物，其在肿瘤中具有高积累性并且具有大强度的从肿瘤中发出的光声信号，即使给药后经过一段时间。具体地，本发明提供使聚乙二醇和ICG衍生物与其结合的透明质酸衍生物。
【IPC分类】C08B37/08, A61B5/00
【公开号】CN105008402
【申请号】CN201480009911
【发明人】三木康嗣, 井上达广, 小林靖人, 中野克哉, 大江浩一, 山内文生, 矢野哲哉, 南昌人
【申请人】佳能株式会社
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年2月21日
【公告号】WO2014129674A1