治疗结肠直肠癌的方法
【专利说明】
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请61/790, 488和2013年7月17 日提交的美国临时申请61/847, 287的利益，每个所述临时申请的整个内容通过参考并入 本文。
技术领域
[0003] 本发明总的来说涉及通过给药SMAD7抑制剂、特别是针对SMAD7的反义寡核苷酸 来治疗和/或预防结肠直肠癌和结肠直肠癌细胞生长的方法，以及用于治疗结肠直肠癌的 SMAD7抑制剂的药物组合物。
【背景技术】
[0004] 结肠直肠癌是一种以大肠的细胞、包括结肠或直肠的细胞的未加抑制的增殖为特 征的疾病。结肠直肠癌肿瘤被认为发源于正常粘膜。肿瘤发生与成簇的显示出增殖和生物 化学异常的扩大隐窝（crypt)的出现相关。携带一个或多个病因性突变的上皮细胞的增 殖，可以变成以高度异常增生为特征的早期肿瘤。进一步的生长可以导致进入肌肉层中并 通过肠壁的侵入性生长。如果不治疗，这些肿瘤可以扩散到局部淋巴结，然后转移到远端 位点，在所述位点处它们变得在很大程度上无法使用目前可用的技术治疗（Markowitz和 Bertagnolli (2009)N. EngL J. Med 361 (25) :2449-2460)。尽管肿瘤会重新产生，但证据表 明约60%的癌源自于先前存在的腺瘤（Soreide等，（2011)Discov. Med. 12(66) :393-404)。 因此，绝大部分结肠直肠癌肿瘤可以被分类为腺癌，但在较小部分病例中也观察到淋巴瘤 和鳞状细胞癌。引起癌变的遗传突变，包括Wnt信号通路的成员、诸如TGF-β 1和SMD家族 成员的TGF-β细胞信号通路的成员、诸如TP53的调控细胞增殖与细胞死亡之间的平衡的 蛋白以及诸如DCC的其他蛋白的突变（Reya和Clevers (2005) Nature 434(7035) :843-850 ; Baker 等，（1989)Science 244:217-221 ;Markowitz 和 Bertagnolli，同上）。异常的 PI3K/Akt激活和下游mTOR信号传导与结肠直肠癌肿瘤发生相关（Rychahou等，（2006) Ann. Surg. 243 (6) : 833-842)。也已在结肠癌细胞系中观察到高水平的EGFR表达，并 将其与结肠直肠癌肿瘤发展相关联（Ciardiello等，（199l)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (17) : 7792-7796)。除了家族和遗传因素之外，结肠直肠癌的风险因子可能包括低水平的 体力活动、饮酒、脂肪和肉类的高膳食摄入及纤维和蔬菜的低摄入。结肠直肠癌的症状通常 包括直肠出血、贫血、便秘、便血、体重减轻、发烧、食欲不振和恶心或呕吐。
[0005] 结肠直肠癌是美国男性和女性癌症幸存者中第二常见的癌症形式（Siegel等， (2012)CA Cancer J. Clin. 62(4) :220-41)。此外，结肠直肠癌在西方世界位于前三种最常 见的癌症死亡病因之列（Soreide等，（2011)Discov. Med. 12(66) :393-404)。更近些时候 许多亚洲国家向西方生活方式的改变，也在那些人群中引起结肠直肠癌的显著增加 （Yang 等，（2011) Dig. Surg. 28(5-6) :379-385)。在2012年，据估计在美国生活着120万以前诊 断为患有结肠直肠癌的个体。同一年，预测将有另外143, 460人被诊断为患有该病。诊断 为结肠直肠癌时的年龄中位数，对于男性来说为68岁，对于女性来说为72岁（Howlader 等，（2011)SEER Cancer Statistics Review, 1975_2008.Bethesda，MD:National Cancer Institute)。尽管结肠直肠癌的发病在老年人中并不罕见，但仅有59. I %的年龄超过50 岁的个体按照指导纲要接受了结肠直肠癌筛查（American Cancer Society(2012)Cancer Prevention&EarIy Detection Facts&Figures. Atlanta, GA:American Cancer Society)。 这种早期诊断的缺乏，导致只有39%的患者在癌症尚未进展到超过局部阶段时被诊断 (Howlader等，同上）。鉴于患有结肠直肠癌的患者数量的增加，对于开发稳健的治疗方法， 特别是用于没有通过早期筛查鉴定的大量患者的治疗方法，存在着需求。
[0006] 发明概述
[0007] 本文中描述的发明提供了利用SMAD7作为TGF-β信号通路的关键拮抗剂的作用、 通过抑制SMAD7来治疗结肠直肠癌的新方法。尽管已经提出了在结肠直肠癌中用于治疗性 干预的其他潜在靶点，但本发明提供了显示出阻止、迟滞、停止或逆转结肠直肠肿瘤细胞生 长的新疗法。
[0008] 本发明提供了一种通过抑制SMAD7来治疗结肠直肠癌的方法。具体来说，本发明 提供了一种在患者的结肠直肠肿瘤中抑制SMAD7的方法。本发明还提供了一种通过抑制 SMAD7来抑制结肠直肠癌细胞生长的方法。本发明还提供了一种通过给药有效量的SMAD7 抑制剂，来抑制SMAD7、治疗结肠直肠癌和/或抑制结肠直肠癌细胞生长的方法。例如， SMAD7的抑制剂（例如抗SMAD7反义疗法、即针对SMAD7的反义寡核苷酸，以及针对SMAD7 的抗体）。当在本文中使用时，"反义寡核苷酸"是指与编码靶蛋白（例如SMAD7)的信使 RNA(mRNA)互补的短的合成寡核苷酸序列。反义寡核苷酸序列与mRNA杂交产生双链杂交 体，其可以引起诸如RNase H的遍在催化酶的激活，所述酶降解DNA/RNA杂交体链，从而阻 止蛋白质翻译。
[0009] SMAD7抑制剂可以是SMAD7的特异性抑制剂，例如以高度特异性靶向SMAD7的反义 寡核苷酸或任何其他手段。SMAD7的反义寡核苷酸抑制剂可以选自但不限于本文中描述的 SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12。例如，SMAD7 的反义寡核苷酸 抑制剂可能包括SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :9,或者可能包括SEQ ID NO :6或SEQ ID NO: 10。本发明的示例性SMAD7反义寡核苷酸是由SEQ ID NO :6的一种形式所代表的序列，其 中所有磷酸酯键是硫代磷酸酯键（SEQ ID N0:10,在本文中被称为GED-0301)。
[0010] 当在本文中使用时，"抑制剂"是指能够通过与基因、基因的RNA产物或蛋白质产 物、或这些实体的任何过渡形式、或其活性或表达影响目标靶点的活性或表达的另一种分 子实体的直接或间接相互作用，降低基因或DNA序列的表达，阻止或抑制基因的RNA产物向 蛋白质的生产、活性或翻译，或阻止或抑制基因的蛋白质产物的活性的药剂。这样的抑制剂 可以包括但不限于例如抗体、结合于特定分子革G的小分子和革El向特定mRNA转录物的反义 寡核苷酸。因此，当在本文中使用时，"SMAD7的抑制剂"是指能够通过与SMAD7的基因 、RNA 产物或蛋白质产物或这些实体的任何过渡形式、或其活性或表达影响SMAD7的活性或表达 的另一种分子实体的直接或间接相互作用，降低SMAD7的表达，阻止或抑制SMAD7的RNA产 物向蛋白质的生产、活性或翻译，或阻止或抑制SMAD7的蛋白质产物的活性的药剂。
[0011] 本发明还提供了通过给药SMAD7的特异性抑制剂来治疗结肠直肠癌的方法。当在 本文中使用时，"特异性抑制剂"是指具有允许它专门地或以高度选择性作用于分子靶的结 构和/或功能性质的药剂。因此，SMAD7的特异性抑制剂具有专门地或以高度特异性靶向 SMAD7基因、它的RNA或蛋白质产物、或活性或表达影响SMAD7或其产物的活性或表达的另 一种分子实体的固有功能性质。在SMAD7的抗体抑制剂的情形中，可以通过包含已知以高 度特异性结合SMAD7蛋白的表位的蛋白质序列，将特异性工程化到抗体中。在SMAD7的小分 子抑制剂的情形中，可以将允许结合于SMAD7蛋白的特定特征的化学基团包含在小分子的 结构式中。可以对反义寡核苷酸进行设计，使得每个反义寡核苷酸的并入的核苷酸序列的 靶向部分完全或基本上完全地与SMAD7mRNA序列互补。这样的互补或近似互补的核苷酸序 列的并入，允许人们工程化制造对于给定靶具有高度特异性的反义寡核苷酸。可以通过诸 如解离常数的参数的测量、或诸如蛋白质或RNA表达水平的变化的其他标准、或测量SMAD7 活性或表达的其他测定法来评估特异性。
[0012] 特异性SMAD7抑制剂可以包括例如用于治疗结肠直肠癌和/或抑制结肠直肠癌 细胞生长的小的结合性分子，例如天然和合成的化合物、抗体、适体、内化体（intramer)、 RNAi (双链RNA、siRNA)和抗SMAD7反义分子。SMAD7抑制剂也可以包含干扰SMAD7活性、 结合配偶体或底物并因此抑制SMAD7功能的截短的和/或突变的SMAD7分子。
[0013] 当在本文中使用时，"有效量"是指当给药于患者时足以至少部分治疗病症的药剂 的量。治疗有效量将随着病症、组分的给药途径、被治疗患者的年龄、体重等而变化。因此， SMAD7的特异性抑制剂的有效量是在患者中治疗结肠直肠癌所必需的抑制剂的量，使得所 述药剂的给药阻止结肠直肠癌在对象中发生，阻止结肠直肠癌进展（例如阻止诸如肿瘤发 生、肿瘤生长或转移的事件发生），或者缓解或完全减轻结肠直肠癌的所有相关症状，即引 起疾病的消退。
[0014] 本发明还提供了一种通过给药包含针对SMAD7的反义寡核苷酸的药物组合物来 治疗结肠直肠癌的方法。另一方面，本发明提供了用于治疗结肠直肠癌的药物组合物。所 述药物组合物可以包含诸如靶向SMAD7的反义寡核苷酸的SMAD7抑制剂，以及可药用载体。 当在本文中使用时，术语"药物组合物"意味着例如在可药用载体中含有例如治疗有效量的 治疗性化合物的特定量的治疗性化合物，将要给药于例如人类的哺乳动物的混合物。在一 些实施方式中，本文中设想了包含所设想的针对SMAD7的反义寡核苷酸和可药用载体的药 物组合物。另一方面，本发明公开了将针对SMAD7的反义寡核苷酸在制造治疗结肠直肠癌 的药品中的应用。当在本文中使用时，"药品"具有与术语"药物组合物"基本上相同的意 义。
[0015] 当在本文中使用时，"可药用载体"意味着适合与人类和动物的组织相接触而没有 过度毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的利益/风险比相称的缓冲剂、 载体和赋形剂。在与制剂的其他成分相容并且对受体无害的意义上，载体应该是"可接受 的"。可药用载体包括与药物给药相容的缓冲剂、溶剂、分散介质、包衣、等渗和吸收延迟剂 等。这样的介质和药剂用于药物活性物质，在本领域中是已知的。在一个实施方式中，药物 组合物口服给药，并包括适用于调节被包封的物质在消化系统或肠内的吸收位点的肠溶包 衣。例如，肠溶包衣可以包括丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。
[0016] 在一个实施方式中，所设想的针对SMAD7的反义寡核苷酸及其任何药物组合物可 以通过一种或几种途径给药，包括口服、局部、肠胃外例如皮下注射、通过吸入喷剂或直肠 给药。当在本文中使用时，术语肠胃外包括皮下注射、胰腺内给药、静脉内、肌肉内、腹膜内、 胸骨内注射或输注技术。例如，可以将针对SMAD7的反义寡核苷酸皮下给药到对象。在另 一个实例中，可以将针对SMAD7的反义寡核苷酸口服给药到对象。在另一个实例中，可以将 针对SMAD7的反义寡核苷酸通过肠胃外给药直接给药到结肠直肠肿瘤或结肠直肠癌细胞。
[0017] 附图简述
[0018] 图UA)示出了 IgG同种型对照（同种型，左栏）和患有偶发性结肠直肠癌的患者 的非肿瘤（NT)和肿瘤⑴区域中的SMAD7免疫染色（分别为中栏和右栏）；图I(B)是蛋白 免疫印迹（Western blot)，示出了在来自于两位患有偶发性结肠直肠癌的患者的NT和T组 织中的SMAD7和β-肌动蛋白水平（左栏）以及SMAD7的蛋白免疫印迹信号的密度测量分 析（右栏）；图I(C)是蛋白免疫印迹，其示出了 IEC和DLD-I以及HCT-116细胞中的SMAD7 和β-肌动蛋白水平；图I(D)示出了在HCT-116(左侧）和DLD-I细胞（右侧）中FITC偶 联的IgG同种型对照（同种型）和SMAD7抗体信号的FACS分析；并且图I (E)是蛋白免疫 印迹（左栏），其示出了在四个结肠直肠癌细胞系（HCT-116、HCT-115、H