T-29和DLD-1)和 一个肝细胞癌细胞系（HepG2)中SMAD7和β-肌动蛋白的表达水平，以及来自于同一印迹 的SMAD7蛋白免疫印迹信号的密度测量分析（右栏）。
[0019] 图2㈧是一系列点图，其描绘了细胞总数并标明了用未标记的SMAD7正义寡 核苷酸或用不断增加剂量的FITC偶联的SMAD7反义寡核苷酸GED-0301 (FITC-偶联的 GED-0301)转染的碘化丙啶（PI)-和荧光（FITC)-阳性的HCT-116细胞的百分率；图2(B) 是蛋白免疫印迹，其示出了在用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后，HCT-116细胞中 的SMAD7和β-肌动蛋白水平；图2(C)描绘了图表，其示出了在未处理（Untr)或用SMAD7 正义或GED-0301寡核苷酸转染后增殖的HCT-116 (黑色条）或DLD-I (白色条）细胞的百 分数（左侧），以及柱状图，其示出了在用SMAD7正义（顶部）或GED-0301 (底部）寡核苷 酸转染后增殖的HCT-116细胞的百分数；图2(D)的图示出了在未处理（Untr)或用SMAD7 正义或GED-0301寡核苷酸转染后，处于不同细胞周期阶段的HCT-116细胞的百分数；并且 图2(E)示出了用SMAD7正义（S)或反义（AS)寡核苷酸转染并不加以处理或暴露于过量 TGF-β蛋白（TGF-β)或TGF-β抗体（抗TGF-β)的HCT-116细胞的增殖百分数。
[0020] 图3 (A)示出了图表，其描绘了在未处理（Untr)或用SMAD7正义或GED-0301寡核 苷酸转染后24(顶部）或48小时（底部）时HCT-116细胞死亡的百分数，以及点图（底部）， 其示出了在SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后的PI和膜联蛋白V (AV)染色；图4 (B) 示出了一系列点图，其定量了未处理（Untr)或SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染后不 同时间点时HCT-116细胞中的活性半胱天冬酶-3 ;图4(C)是示出了在未处理或用SMAD7正 义或GED-0301寡核苷酸转染后暴露于N- (2-喹啉基）缬氨酰基-天冬氨酰基-(2, 6-二氟 苯氧基）甲基酮（Q-VD-OPH)和活性半胱天冬酶-3的细胞的百分数的图表；图4(D)是示出 了在暴露于Q-VD-OPH然后未进行处理或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的细胞中 细胞死亡的百分数的图表；并且图4(E)是示出了暴露于Q-VD-OPH然后未处理或用SMAD7 正义或GED-0301寡核苷酸转染的增殖细胞的百分数的图表。
[0021] 图4(A)示出了来自于未转染（Untr)或用SMAD7正义（S)或反义（AS)寡核苷酸 转染并探测磷酸化的⑶K2 (P-⑶K2 (Thr-14/Tyr-15))、⑶K2、周期蛋白A和β -肌动蛋白 的HCT-116细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(B)示出了来自于未转染（Untr)或用 3嫩07正义（3)或反义仏3)寡核苷酸转染并探测〇^25六、〇^258和〇^25(：的!1(：1'-116细胞 的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(C)示出了在用SMAD7正义（S)或反义（AS)寡核苷酸转 染的HCT-116细胞中，在不同时间点时CDC25A mRNA表达的定量；图4(D)示出了来自于用 SMAD7正义（S)或反义（AS)寡核苷酸转染并在暴露于蛋白酶体抑制剂MG115和MG132后探 测CDC25A或β-肌动蛋白的细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(E)是来自于用SMAD7 正义（S)或反义（AS)寡核苷酸转染并在不同时间点探测磷酸化的EiF2a (p-EiF2a (Ser 51))、总EiF2a、CDC25A、周期蛋白A和β-肌动蛋白的细胞的细胞提取物的蛋白免疫印 迹；图4 (F)示出了在暴露于二甲亚砜（DMSO)或salubrinal后探测p-EiF2 a (Ser 51)、 EiF2 a XDC25A和β-肌动蛋白的HCT-116细胞提取物的蛋白免疫印迹；图4(G)示出了从 用SMAD7抗体免疫沉淀并用蛋白质磷酸酶1 (顶栏）、EiF2 a (中栏）或SMAD7抗体探测的 HCT-116细胞提取物（左栏）或原代结肠直肠癌细胞（右栏）制作的蛋白免疫印迹；并且 图4 (H)示出了来自于用SMAD7正义（S)或反义（AS)寡核苷酸转染，经历PPl或EiF2 a抗 体免疫沉淀，并用相反抗体探测的HCT-116细胞的细胞提取物的蛋白免疫印迹。
[0022] 图5㈧示出了来自于氧化偶氮甲烷和葡聚糖硫酸钠（A0M+DSS)处理后的小鼠的 非肿瘤或肿瘤组织中的SMAD7免疫染色，并且图5 (B)是示出了来自于A0M+DSS处理后的小 鼠的非肿瘤和肿瘤组织中的相对SMAD7mRNA表达的图。
[0023] 图6 (A)示出了用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的结肠直肠癌组织外植 体的苏木精和伊红（H&E)染色和增殖细胞核抗原（PCNA)免疫染色；并且图6(B)示出了用 SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染的人类结肠直肠癌组织外植体的SMAD7、PCNA、周期蛋 白 A、p-EiF2a (Ser 51)和 CDC25A 免疫染色。
[0024] 图7(A)示出了在注射到HCT-116定植（colonize)的Ragl /小鼠中之后，暴露于 PBS (CTR)或FITC偶联的GED-0301单次注射的源自HCT-116的异体移植物中FITC信号的 分布；图7(B)是蛋白免疫印迹，其示出了在暴露于SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸的源 自HCT-116的异体移植物的蛋白质提取物中的SMAD7和β -肌动蛋白表达；图7(C)是定量 了源自于用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸处理的小鼠的异体移植物的肿瘤体积的图表 (左侧）和来自于相同实验的异体移植物的代表性照片；并且图7(D)示出了用SMAD7正义 或GED-0301寡核苷酸处理的异体移植物的SMAD7、PCNA和周期蛋白A免疫染色。
[0025] 图8(A)示出了来自暴露于AOM并随后用SMAD7正义或反义寡核苷酸处理的 Apc (Min/+)小鼠的内窥镜图像（左栏），以及肿瘤数量和肿瘤评分的内窥镜分析（图表，右 侦D和来自于Apc(Min/+)小鼠的结肠切片的H&E染色（中栏）；图8⑶-(F)示出了来自 于用SMAD7正义（S)或反义（AS)寡核苷酸处理的小鼠，并分别对SMAD7、PCNA、周期蛋白A、 ⑶C25A和p-EiF2a (Ser 51)免疫染色的肿瘤（T)和非肿瘤（NT)组织切片；并且图8 (G)示 出了在Apc (Min/+)小鼠中FITC偶联的反义寡核苷酸向肠组织的定位。
【具体实施方式】
[0026] 结肠直肠癌
[0027] 本发明提供了用于治疗结肠直肠癌的方法。当在本文中使用时，"结肠直肠癌"是 指以大肠的细胞、包括结肠或直肠的细胞的未加抑制的增殖为特征的疾病。结肠直肠癌通 常起源于大肠的上皮细胞，并且肠腺干细胞是可能的细胞起源。引起癌变的遗传突变包括 诸如0-链蛋白、厶卩(：、厶父預1、厶父預2、1^71^和疆〇1的術^信号通路的成员、诸如了6卩-0 1 和SMAD家族成员的TGF- β细胞信号通路的成员、诸如TP53的调控细胞增殖与细胞死亡之 间的平衡的蛋白和诸如DCC的其他蛋白例的突变。携带一个或多个病因性突变的上皮细胞 的增殖，可以导致进入肌肉层中并通过肠壁的侵入性生长。结肠直肠癌的症状通常包括直 肠出血、贫血、便秘、便血、体重减轻、发烧、食欲不振和恶心或呕吐。绝大部分结肠直肠癌肿 瘤可以被分类为腺癌，但在较小部分病例中也观察到淋巴瘤和鳞状细胞癌。因此，当在本文 中使用时，术语"结肠直肠肿瘤"是指与起源于大肠或结肠直肠癌症病理的细胞相关的任何 异常的组织恶性生长。
[0028] 当在本文中使用时，术语"结肠直肠癌细胞"是指引起结肠直肠癌或结肠直肠肿瘤 的任何细胞来源，与结肠直肠肿瘤的肿瘤发生、生长、演化、维持或支持相关的细胞，或与结 肠直肠癌的病理表现相关的任何其他细胞。当在本文中使用时，"结肠直肠癌细胞的生长" 是指与结肠直肠癌细胞起源相关的细胞、结肠直肠肿瘤细胞或与结肠直肠癌病理表现相关 的任何细胞的未加抑制的或异常的增殖。结肠直肠癌细胞的生长可能是异常细胞周期活 性、诱导细胞周期检查点的失败、诱导凋亡的失败、或其他肿瘤抑制活性的丧失的结果。
[0029] 治疗和评估
[0030] 当在本文中使用时，术语"治疗（treat) "、"治疗（treatment) "和"治疗 (treating) "等一般意味着获得所需的药理和/或生理效果。所述效果以完全或部分阻止 疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或以部分或完全治愈疾病和/或归因于疾病的负 面效应而言可以是治疗性的。当在本文中使用时，术语"治疗（treatment)"包括哺乳动物 中、特别是人类的疾病的任何治疗，并包括：(a)在可能易感疾病但尚未被诊断为患有该疾 病的对象中阻止疾病发生；(b)抑制疾病，即制止它的发展；或（c)缓解疾病，即引起疾病减 退。
[0031] 治疗效能可以利用与结肠直肠癌相关的总体症状的评估、组织的组织学分析、生 物化学测定法、诸如磁共振成像的成像方法或其他已知方法来评估。例如，可以通过在将 SMAD7抑制剂给药于结肠直肠癌患者后分析贫血状态、直肠出血、肿瘤尺寸或与结肠直肠癌 相关的总体病理的其他方面，来评估治疗效能。还可以在组织或细胞水平上评估治疗效能， 例如通过获得组织或肿瘤活检样品并评估组织或细胞总体形态或染色性质的方法。检查 蛋白质或RNA表达的生物化学测定法也可以用于评估治疗效能。例如，人们可以通过免疫 细胞化学、免疫组织化学或蛋白免疫印迹方法，在解离的细胞或未解离的组织中评估PCNA、 P-CDK2 (Thr-14/Tyr-15)或指示细胞增殖或细胞死亡活性的其他蛋白的水平。人们还可以 评估存在于血浆或肿瘤或非肿瘤组织中的有用生物标志物的存在或表达水平，以评估癌症 进展和治疗效能。
[0032] 在治疗效能的评估中，可以选择适合的对照来确保有效评估。例如，人们可以将 在给药SMAD7抑制剂之后在患有结肠直肠癌的患者中评估的症状，与治疗之前在同一患者 中或在未被诊断患有结肠直肠癌的另一位患者中的症状进行比较。或者，人们可以将给药 SMAD7抑制剂后肿瘤组织的生物化学或组织学分析的结果，与来自于同一患者或来自于未 被诊断为患有结肠直肠癌的个体或来自于同一患者的给药SMAD7抑制剂之前的非肿瘤组 织的结果进行比较。
[0033] SMAD7抑制的验证可以通过直接或间接评估SMAD7的表达水平或活性来判定。例 如，可以使用测量SMAD7蛋白或RNA表达的生物化学测定法来评估总体SMAD7抑制。例如， 人们可以通过蛋白免疫印迹法（Western blot)来测量肿瘤组织中的SMAD7蛋白水平，以评 估总体SMAD7水平。人们还可以利用RNA印迹法（Northern blot)或定量聚合酶链式反应 来测量SMAD7mRNA水平，以确定总体SMAD7抑制。人们还可以通过免疫细胞化学或免疫组 织化学方法在解离的细胞或未解离的组织中评估SMAD7蛋白水平或指示SMAD7活性的其他 蛋白质的水平。也可以通过测量诸如细胞周期阶段分布的参数，用诸如膜联蛋白V或半胱 天冬酶III的细胞死亡的标志物染色，或测量与SMAD7活性的改变相关联的其他参数的变 化，来间接评估SMAD7抑制。例如，人们可以测量用SMAD7抑制剂治疗的肿瘤的细胞中活性 半胱天冬酶-3的水平，作为所述细胞中SMAD7活性的指示。人们也可以评估存在于血浆或 肿瘤或非肿瘤组织中的有用生物标志物的存在或表达水平，来评估SMAD7抑制的效能。
[0034] 在SMAD7抑制（knockdown)效能的评估中，可以选择适合的对照来确保有效评估。 例如，人们可以将给药SMAD7抑制剂后肿瘤组织的生物化学或组织学分析的结果，与来自 于同一患者或来自于未被诊断为患有结肠直肠癌的个体或来自于同一患者的给药SMAD7 抑制剂之前的非肿瘤组织的结果进行比较。
[0035] 当在本文中使用时，"患者"是指有结肠直肠癌风险或患有结肠直肠癌的动物，包 括但不限于哺乳动物、灵长类动物和人类。例如，患者可以是被诊断为具有发生结肠直肠癌 的高风险的个体或已被诊断为患有结肠直肠癌的个体。在某些实施方式中，患者可以是非 人类哺乳动物，例如猫、狗或马。
[0036] SMAD7的抑制剂
[0037] 在某些实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸可以靶向人类SMAD7mRNA的403、233、 294、295、296、298、299 和 / 或 533 位点（即分别为 403、233、294、295、296、298、299 和 533 位核苷酸）。在示例性实施方式中，抗SMAD7反义寡核苷酸靶向人类SMAD7mRNA的403-423