20 %至约40 %的微晶体 纤维素，或以重量计约10%至约30%的微晶体纤维素。例如，本公开的片剂可以包括颗粒 内相，其包含以重量计约30%至约60%例如约45%至约65%、或者可替代地以重量计约5 至约10 %的GED-0301，以重量计约30 %至约50%、或者可替代地约5 %至约15 %的甘露糖 醇，约5%至约15%的微晶体纤维素，约0%至约4%或约1 %至约7%的羟丙基甲基纤维 素，以及以重量计约0%至约4%例如约2%至约4%的羟基乙酸淀粉钠。
[0076] 在另一种实施方式中，针对SMAD7的反义寡核苷酸的用于口服给药的药物片剂制 剂包含颗粒内相，其中所述颗粒内相包含诸如GED-0301的反义寡核苷酸或其可药用盐（例 如钠盐）和可药用添加剂，并且所述制剂还可以包含颗粒外相，其可以包含诸如崩解剂的 可药用赋形剂。颗粒外相可以包含选自微晶体纤维素、硬脂酸镁及其混合物的组分。药物 组合物还可以包含以片剂的重量计约12%至16%的肠溶包衣。例如，用于口服使用的可药 用片剂可以包含以重量计约〇. 5%至10%的反义寡核苷酸，例如GED-0301或其可药用盐， 以重量计约30 %至50 %的甘露糖醇，以重量计约10 %至30 %的微晶体纤维素，以及包含丙 烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物的肠溶包衣。
[0077] 在另一个实施例中，用于口服使用的可药用片剂可以包含：颗粒内相，其包含以重 量计约5至约10%的反义寡核苷酸，例如GED-0301或其可药用盐，约40重量％的甘露糖 醇，约8重量％的微晶体纤维素，约5重量％的羟丙基甲基纤维素和约2重量％的羟基乙酸 淀粉钠；颗粒外相，其包含约17重量％的微晶体纤维素，约2重量％的羟基乙酸淀粉钠，约 0. 4重量％的硬脂酸镁；以及片剂上的肠溶包衣，其包含丙烯酸乙酯-甲基丙烯酸共聚物。
[0078] 在某些实施方式中，药物组合物可以包含肠溶包衣，其包含以重量计约13 %或约 15%、16%、17%或18%的例如AcydEZE⑩(参见例如PCT公布号W02010/054826,其全部 内容通过参考并入本文）。
[0079] 包衣溶解并且活性成分释放时的速率，是它的溶出度。在一种实施方式中，当例如 在USP/EP 2型装置（桨叶式）中，在IOOrpm和37°C下并在pH为7. 2的磷酸盐缓冲液中 试验时，所设想的片剂在约120分钟至约240分钟后，例如在180分钟后，具有约50%至约 100%的寡核苷酸释放的溶出曲线。在另一种实施方式中，当例如在USP/EP 2型装置（桨 叶式）中，在IOOrpm和37°C下并在pH为I. 0的稀HCl中试验时，所设想的片剂在120分钟 后具有寡核苷酸基本上不释放的溶出曲线。在另一种实施方式中，当例如在USP/EP 2型装 置（桨叶式）中，在IOOrpm和37°C下并在pH为6. 6的磷酸盐缓冲液中试验时，所设想的片 剂在30分钟后可能具有约10%至约30%或不超过约50%的寡核苷酸释放的溶出曲线。
[0080] 在某些实施方式中，本公开的制剂例如片剂，在口服给药于患者时，可以在患者中 产生极低的寡核苷酸血浆浓度。在另一种实施方式中，本公开的制剂在口服给药于患者时， 局部递送到患者的结肠或直肠，例如递送到患者的受影响或患病的位点。
[0081] 在某些实施方式中，本文中提供的方法还可以包括给药涉及本文中公开的疾病和 障碍的治疗的至少一种其他药剂。在一种实施方式中，所设想的其他药剂可以共同给药 (例如依次地或同时地）。
[0082] 所设想的药剂包括免疫抑制剂，其包括糖皮质激素、细胞抑制剂、抗体、作用于免 疫亲和素的药剂、干扰素、阿片受体、TNF结合蛋白、麦考酚酯和小生物药剂。例如，所设想 的免疫抑制剂包括但不限于：他克莫司、环孢霉素、吡美莫司、西罗莫司、依维莫司、麦考酚 酸、芬戈莫德、地塞米松、氟达拉滨、环磷酰胺、氨甲喋呤、咪唑硫嘌呤、来氟米特、特立氟胺、 阿那白滞素、抗胸腺细胞球蛋白、抗淋巴细胞球蛋白、莫罗莫那（muromonab) -CD3、阿夫土 珠单抗（afutuzumab)、利妥昔单抗（rituximab)、特普力珠单抗（teplizumab)、伊法利珠 单抗（efalizumab)、达利珠单抗（daclizumab)、巴利昔单抗（basiliximab)、阿达木单抗 (adalimumab)、英夫利昔单抗（infiximab)和依那西普。
[0083] 给药剂量和频率
[0084] 示例性制剂包括包含约35mg至约500mg针对SMAD7的反义寡核苷酸或基本上由 其构成的剂型。例如，本文中设想了包含约35mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、 llOmg、120mg、130mg、140mg、150mg、160mg、170mg、180mg、190mg、200mg 或 250mg 针对 SMAD7 的反义寡核苷酸的制剂。在一种实施方式中，制剂可以包含约40mg、80mg或160mg针对 SMAD7的反义寡核苷酸。在某些实施方式中，制剂可以包含至少100 μ g针对SMAD7的反义 寡核苷酸。例如，制剂可以包含约 〇· lmg、0. 2mg、0. 3mg、0. 4mg、0. 5mg、lmg、5mg、10mg、15mg、 20mg或25mg针对SMAD7的反义寡核苷酸。给药量取决于多种变量，诸如待治疗的疾病或适 应症的类型和程度、患者的总体健康和身体尺寸、反义寡核苷酸的体内效能、药物制剂和给 药途径。初始剂量可以被增加到超过上限水平，以便快速达到所需的血液水平或组织水平。 可任选地，初始剂量可以小于最适值，并且可以在治疗过程中逐渐提高剂量。人类的剂量可 以在例如被设计为从40mg至160mg运行的常规I期剂量递增研究中进行优化。给药频率 可以随着各种因素而变，诸如给药途径、剂量和待治疗的疾病。示例性的给药频率为每天一 次、每周一次和每两周一次。在某些实施方式中，连续7天每天给药一次。
[0085] 实施例
[0086] 通过下面的实施例对本发明进行进一步说明。提供实施例仅仅是出于说明的目 的，并且不应被解释为以任何方式限制本发明的范围或内容。
[0087] 实施例1 :结肠直肠癌细胞中的SMAD7蛋白表达水平
[0088] 在从由于结肠直肠癌而经历结肠切除术的6位患者获取的成对的结肠直肠癌肿 瘤和非肿瘤结肠粘膜样本中，评估SMAD7蛋白表达水平。肿瘤（T)和非肿瘤（NT)组织的 SMAD7免疫染色揭示出当与非肿瘤组织相比时，肿瘤组织中的SMAD7蛋白显著积累，而在将 结肠直肠癌切片与IgG同种型对照（同种型；图1A，代表性的三个分开的实验，其中对患有 结肠直肠癌的6位患者进行分析）温育时，没有观察到染色。此外，通过蛋白免疫印迹法对 来自于结肠直肠癌患者的14对匹配的肿瘤（T)和相邻的非肿瘤（NT)组织中的SMAD7蛋白 水平进行评估。细胞提取物的蛋白免疫印迹证实，与非肿瘤组织相比，在肿瘤组织中的可观 察到的更高的SMAD7水平（图1B，示出了来自于两个代表性患者样品的提取物的蛋白免疫 印迹）。使用β-肌动蛋白作为载样对照。通过密度测量分析对同样的印迹中SMAD7的表 达水平进行的定量证实，与来自于相同患者的非肿瘤粘膜相比，结肠直肠癌样品中的SMAD7 水平显著增加（图1Β)。
[0089] 还在结肠直肠癌细胞系中研究了 SMAD7蛋白表达。从结肠直肠癌细胞系DLD-I和 HCT-116的细胞以及正常结肠上皮细胞（IEC)收集总蛋白提取物，并通过蛋白免疫印迹法 评估SMAD7表达（图1C)。IEC从由于偶发性结肠直肠癌而经历结肠切除术的患者的宏观 和微观上未受影响的粘膜中分离。蛋白免疫印迹揭示出与IEC相比，在DLD-I和HCT-116 细胞中SMAD7蛋白的表达明显更高。SMAD7抗体信号的特异性，通过用FITC偶联的SMAD7 抗体（SMAD7)或IgG同种型对照（同种型；图1D)标记的HCT-116和DLD-I细胞的FACS分 析来验证。此外，在从一系列结肠直肠癌细胞系包括HCT-116、HT-115、HT-29和DLD-I收集 的提取物中SMAD7蛋白水平的蛋白免疫印迹检测和密度测量分析，揭示出高水平的SMAD7 表达（图1E)。在同一实验中，在一种已知表达高水平SMAD7蛋白的肝细胞癌细胞系!fepG2 细胞中评估了 SMAD7表达。使用β-肌动蛋白在两套蛋白免疫印迹实验中作为载样对照， 并且作为用于图IE中示出的条带密度测量分析的归一化标准。
[0090] 实施例2 :通过SMAD7反义寡核苷酸抑制结肠直肠癌细胞的SMAD7蛋白水平
[0091] 在HCT-116细胞系的细胞中评估用SMAD7反义寡核苷酸GED-0301对癌细胞的转 染。将HCT-116细胞用未标记的正义（SMAD7正义）寡核苷酸或用剂量逐渐增加（0. 5yg/ ml、1 μ g/ml或2 μ g/ml)的FITC偶联的GED-0301转染6小时。图2A示出了定量PI-阳性 和FITC-阳性的被转染的HCT-116细胞的百分率的代表性点图。正如通过PI和FITC染色 所评估的，获得了高的转染效率和非常低的细胞死亡水平。在图2A中示出了获得相似结果 的两个代表性实验之一。
[0092] 也在HCT-116细胞中评估了在用不同量GED-0301转染后SMAD7蛋白水平的抑制。 将HCT-116细胞用SMAD7正义寡核苷酸（以2μg/ml)或GED-0301(以0·5μg/ml、lμg/ ml或2 μ g/ml)转染12小时。随后将细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS)清洗，用新鲜培养基培 养6小时，再次用PBS清洗，并培养另外24小时。然后通过蛋白免疫印迹法分析SMAD7和 β -肌动蛋白水平。图2B示出了三个代表性实验之一，证实了与用SMAD7正义寡核苷酸转 染的细胞相比，在用量逐渐增加的GED-0301转染的细胞中，SMAD7蛋白水平的可观察到的 抑制。这些结果证实，SMAD7反义寡核苷酸（GED-0301)可以被转染到结肠直肠癌细胞中并 能诱导SMAD7蛋白水平的稳健抑制。
[0093] 实施例3 :SMAD7反义寡核苷酸给药影响结肠直肠癌细胞中的细胞周期动力学
[0094] 在SMAD7正义和GED-0301寡核苷酸给药后，评估了 HCT-116和DLD-I细胞中的细 胞增殖。将HCT-116和DLD-I细胞不转染（Untr)或用1 μ g/ml的SMAD7正义或GED-0301 寡核苷酸转染。转染后12小时，将细胞用PBS清洗，再培养6小时，用PBS重新清洗，并用 羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺酯（CFSE)标记30分钟。然后将标记的细胞用PBS清洗， 并在新鲜培养基中重新培养另外24小时。通过流式细胞术评估增殖细胞的百分率。与用 SMAD7正义寡核苷酸转染的细胞相比，在用GED-0301转染的DLD-I (白色条）和HCT-116 (黑 色条）细胞两者中观察到细胞增殖的显著降低（图2C ;HCT-116 :SMAD7正义转染的细胞相 比于GED-0301转染的细胞，*P〈0. 001 ;DLD-1 :SMAD7正义转染的细胞相比于GED-0301转 染的细胞，t P〈〇. 001)。图中的数据描绘了三个实验的平均值土标准偏差（SD)。图2C中 的柱状图描绘了来自于单个实验的用SMAD7正义（82% )或GED-0301 (47% )寡核苷酸转 染的HCT-116细胞中，细胞增殖的总百分数。因此，在结肠直肠癌细胞系HCT-116和DLD-I 中，SMAD7AS寡核苷酸的给药导致细胞增殖显著降低。
[0095] 还在GED-0301转染后，在HCT-116细胞中分析了细胞在不同细胞周期阶段中的分 布。将HCT-116细胞不转染（Untr)或用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染。将HCT-116 细胞用1 μ g/ml的SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染。转染后12小时，将细胞用PBS 清洗并在新鲜培养基中培养另外24小时。然后通过流式细胞术评估处于细胞周期不同阶 段的细胞的百分率。与对照相比，在用GED-0301转染的细胞中观察到存在于S期中的细胞 的百分率统计学上显著地增加，并伴随着构成G0/G1群体的细胞的百分率统计学上显著地 降低（图2D ;GED-0301转染的细胞相比于SMAD7正义转染的细胞，对于S期来说，**P = 0.0 Ol ;对于G0/G1期来说，*P = 0. 01)。示出了获得相似结果的三个代表性实验之一。这 些结果证实，由SMAD7反义寡核苷酸GED-0301的给药促进的SMAD7蛋白的抑制，引起结肠 直肠癌细胞中细胞周期阶段群体数分布的改变。
[0096] 结肠直肠癌细胞通常在介导TGF-β 1信号传导的基因中携带突变，使它们对 TGF-β 1活性的变化没有反应。因此，在人类结肠直肠癌细胞系HCT-116和DLD-I中研究 了观察到的由SMAD7活性的变化引起的