mRNA 表达，以判定体内结肠直肠癌的诱导是否与SMAD7水平提高相关。在本文中使用的模型中， 向C57BL/6J小鼠给药Α0Μ，然后重复摄入DSS (A0M+DSS)，引起结肠炎症和随后多个结肠肿 瘤的发生。在A0M+DSS处理后84天，将动物处死。通过从患有结肠炎相关的结肠直肠癌的 小鼠收集的组织的非肿瘤和肿瘤区域的免疫染色，来评估SMAD7蛋白水平。图5A示出了在 A0M+DSS处理的小鼠的肿瘤区域中，SMAD7免疫染色的明显增加。图像从进行的三个实验之 一获取。正如通过实时PCR所评估的，与A0M+DSS处理的小鼠的非肿瘤区域相比，在肿瘤区 域中SMAD7mRNA表达也有提高（图5B)。图5B中的值代表了平均值土 SEM，并且在每个组 中包含6只小鼠。因此，体内SMAD7mRNA以及尤其是蛋白表达的提高，与在肿瘤组织中专有 地诱导结肠直肠癌相关。
[0115] 实施例7 :SMAD7反义寡核苷酸给药引起组织外植体细胞增殖的降低
[0116] 为了评估SMAD7反义寡核苷酸促进的抑制对组织中细胞增殖的影响，在来自于离 体结肠直肠癌组织外植体的切片上进行H&E染色或PCNA免疫染色。将新鲜的组织外植体 用SMAD7正义或GED-0301寡核苷酸转染36小时，然后染色。图6A示出了来自于新鲜获得 的外植体的H&E-和PCNA-染色的切片的代表性图像。与用SMAD7正义寡核苷酸转染的外 植体相比，在用GED-0301转染的组织外植体中观察到H&E染色和PCNA免疫信号两者的明 显降低，证实了 GED-0301在转染的组织中高效地减少细胞增殖。示出了来自于两个代表性 实验之一的图像。
[0117] 类似地，向人类结肠直肠癌组织外植体的器官培养物加入SMAD7正义（S)或反义 (AS)寡核苷酸，并在24小时后分析细胞生长和细胞周期相关蛋白。结肠直肠癌组织外植体 的连续切片的免疫组织化学显示，SMAD7反义寡核苷酸降低了表达SMAD7、PCNA、周期蛋白 A和CDC25A的结肠直肠癌细胞的分数，并增加了对p-EiF2a (Ser51)阳性的细胞的百分率 (图6B)。图像示出了 5个代表性结果之一，同时将同种型对照染色（同种型）示出在左侧 列中。
[0118] 实施例8 :在异种移植物小鼠模型中SMAD7反义寡核苷酸给药降低体内结肠直肠 癌肿瘤生长和细胞增殖
[0119] 将HCT-116异种移植物模型用于评估GED-0301给药对结肠直肠癌肿瘤发育和结 肠直肠癌细胞增殖的影响。为此，将Rag-I /小鼠用HCT-116细胞接种（在500 μ 1基质胶中 5x10s个细胞）。接种后一周，小鼠接受PBS (图7A，CTR)或100 μ g FITC偶联的GED-0301 (图 7A，FITC偶联的GED-0301)的单次腹膜内注射。在注射药剂后24小时将小鼠处死，将肿瘤 切下，并通过免疫荧光信号评估FITC偶联的GED-0301的分布。FITC信号明显与来自于异 种移植物细胞的核信号共定位（图7A，Dapi/FITC栏）。
[0120] 也在来自于经历GED-0301给药的动物的异种移植物中评估了 SMAD7蛋白信号。将 HCT-116细胞接种到Rag-I /小鼠中，并将动物用SMAD7正义或GED-0301腹膜内处理。在 HCT-116注射后7天开始，以每天100 μ g/小鼠的量给药两种寡核苷酸。在HCT-116细胞接 种后21天将小鼠处死。来自于异种移植物组织的总蛋白提取物的蛋白免疫印迹揭示出在 来自于GED-0301处理的小鼠而不是SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠的样品中，SMAD7信号 水平的可观察到的降低（图7B)。将β-肌动蛋白用作载样对照。因此，GED-0301能够在 结肠直肠癌异种移植物细胞中体内抑制SMAD7蛋白水平。
[0121] 对从经历上面描述的相同流程的小鼠获取的异种移植物，在每个组中进行产生 的肿瘤的体积的分析。与用SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠相比，在用GED-0301处理的 HCT-116接种的小鼠中观察到肿瘤体积的显著减小（图7C)。图7C中的图表示出了用SMAD7 正义或GED-0301寡核苷酸处理的小鼠在21天时的平均肿瘤体积（图7C，左栏；SMAD7正 义相比于GED-0301，P〈0.001 ;两个独立实验的平均值，每组彡12只小鼠；条指示平均值 土 SD)。图7C (右栏）提供了在SMAD7正义寡核苷酸处理（顶部行）和GED-0301处理（底 部行）的小鼠中发育的异种移植物的代表性照片。结果清楚地证实，SMAD7的GED-0301抑 制在异种移植物模型中抑制结肠直肠肿瘤生长。
[0122] 还在从经历上述相同流程的小鼠获取的异种移植物组织切片中进行SMAD7、细胞 增殖标志物PCNA和⑶K2配偶体周期蛋白A的免疫染色。图7D中示出了 SMAD7、PCNA和 周期蛋白A染色的异种移植物切片的代表性图像。示出了来自于6个代表性实验之一的图 像。在左侧列中示出了同种型对照染色（同种型）。与来自于SMAD7正义寡核苷酸处理的 小鼠（S)相比，在从GED-0301处理的小鼠（AS)中发育的异种移植物获取的组织切片中观 察到所有三种信号的降低，证实了 SMAD7反义寡核苷酸介导的SMAD7蛋白的抑制引起结肠 直肠癌细胞中体内细胞增殖降低。
[0123] 实施例9 :在自发性结肠直肠癌模型中SMAD7反义寡核苷酸给药抑制肿瘤发生
[0124] 使用自发性结肠直肠癌的小鼠模型，检查了 SMAD7反义寡核苷酸在体内抑制肠肿 瘤发生的能力。具体来说，将在腺瘤性结肠息肉病（Apc)基因中带有显性突变的多发性肠 肿瘤（Min)小鼠用于这些实验。该小鼠模型类似于也由APC基因中的突变引起的被称为家 族性腺瘤性息肉病的人类疾病。用致癌原AOM处理Apc (Min/+)小鼠提高肿瘤发生率、数目 和尺寸，特别是在结肠中。将小鼠每周一次用A0M(10mg/kg)腹膜内（i.p)处理共两周，并 监测肿瘤形成。在最后一次AOM注射后一周，将小鼠每周三次用125 μ g/小鼠的SMAD7反 义（AS)或正义⑶寡核苷酸口服治疗，直至在第80天处死。并行地，向小鼠给药未标记的 寡核苷酸（CTR)或FITC偶联的SMAD7反义寡核苷酸（FITC偶联的AS ; 125 μ g/小鼠）的口 服药剂，并在8小时后处死，以便评估寡核苷酸的肠摄取（图8G)。肠组织切片的分析揭示 出存在FITC信号，指示反义寡核苷酸定位到靶组织。
[0125] 在第72天的内窥术显示，用SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠发生多个大的肿瘤， 然而在SMAD7反义寡核苷酸处理的小鼠的结肠中肿瘤的数目和尺寸减小（图8A，左栏）。 肿瘤数目和肿瘤评分的内窥术分析揭示，相比于SMAD7正义寡核苷酸处理的小鼠，在SMAD7 反义寡核苷酸处理的小鼠中这些参数显著减小（图8A，图表；对于肿瘤数目来说，S相比于 AS，P = 0. 004 ;对于肿瘤评分来说，S相比于AS，P = 0.0 Ol ;对于两个图表来说，条指示平 均值土SEM，3个单个实验，每个组彡5只小鼠）。这些结果通过在第80天处死的小鼠中肿 瘤的直接评估得到验证。具体来说，结肠组织的H&E染色揭示出，在SMAD7正义寡核苷酸而 不是反义寡核苷酸处理的小鼠中存在大的生长（图8A，中栏）。
[0126] 肿瘤（T)和非肿瘤（NT)切片的免疫组织化学显示，在暴露于SMAD7正义寡核苷酸 (S)的肿瘤区域中，SMAD7被上调，并且由反义寡核苷酸处理抑制（AS，图8B)。PCNA染色证 实了 Smad7反义寡核苷酸的抗增殖效果（图8C)。此外，反义寡核苷酸处理在肿瘤区域中降 低了周期蛋白A和⑶C25A的水平（图8D、E)，并上调了 p-EiF2a (Ser 51)水平（图8F)。 因此，在结肠直肠癌的多个动物模型中，GED-0301在体内成功地抑制肿瘤形成和生长。
[0127] 通过参考并入
[0128] 本文中引用的每个专利文献和科学文章的全部公开内容，为所有目的通过参考并 入本文。
[0129] 等同性
[0130] 本发明可以以其他特定形式体现而不背离其基本特征。因此，上述实施方式应该 被当作是说明性的，而不是限制本文中描述的发明。本发明的范围由随附的权利要求书而 不是由上面的描述指定，并且意欲将在权利要求书的等同性的意义和范围之内的所有变化 包含在其中。
【主权项】
1. 一种治疗结肠直肠癌的方法，所述方法包括抑制患者结肠直肠肿瘤中的SMAD7。2. -种抑制结肠直肠癌细胞生长的方法，所述方法包括抑制结肠直肠癌细胞中的 SMAD7〇3. -种治疗结肠直肠癌的方法，所述方法包括向需要治疗的患者给药有效量的SMAD7 的特异性抑制剂。4. 一种抑制患者结肠直肠癌细胞生长的方法，所述方法包括向结肠直肠癌患者给药有 效量的SMAD7的特异性抑制剂。5. 如权利要求3或4所述的方法，其中所述抑制剂包含针对SMAD7的反义寡核苷酸。6. 如权利要求5所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸包含选自由SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12所组成的组中的的寡核苷酸。7. 如权利要求5或6所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸包含SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :9。8. 如权利要求5或6所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸包含SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO : 10。9. 如权利要求5-8任一项所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸为肠胃外 给药。10. 如权利要求9所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸为口服给药。11. 如权利要求3或4所述的方法，所述方法包括给药包含针对SMAD7的反义寡核苷酸 和可药用载体的药物组合物。12. 如权利要求11所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸选自由SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 9、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12 所组成的组中。13. 如权利要求11或12所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸包含SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :9。14. 如权利要求11或12所述的方法，其中所述针对SMAD7的反义寡核苷酸包含SEQ ID NO :6 或 SEQ ID NO : 10。15. 如权利要求11-14任一项所述的方法，其中所述药物组合物为肠胃外给药。16. 如权利要求11-14任一项所述的方法，其中所述药物组合物为口服给药。17. 如权利要求16所述的方法，其中所述药物组合物包含含有丙烯酸乙酯-甲基丙烯 酸共聚物的肠溶包衣。18. 如权利要求1或3-17任一项所述的方法，其中所述患者是人类。19. 如权利要求5-18任一项所述的方法，所述方法包括给药至少100 y g所述反义寡核 苷酸。20. 如权利要求19所述的方法，所述方法包括给药35mg至500mg所述反义寡核苷酸。21. -种用于治疗结肠直肠癌的药物组合物，所述药物组合物包含针对SMAD7的反义 寡核苷酸和可药用载体。22. 针对SMAD7的反义寡核苷酸在用于制造治疗结肠直肠癌的药物中的应用。23. -种SMAD7抑制剂在治疗结肠直肠癌中的应用。24. -种SMAD7抑制剂在治疗结肠直肠癌中的应用，其中所述抑制剂如权利要求2至 10任一项中所定义。25. -种SMAD7抑制剂在治疗结肠直肠癌中的应用，其中所述抑制剂如权利要求11至 20任一项中所定义，并且其中所述抑制剂与可药用载体一起，在如权利要求11至21任一项 中所定义的药物组合物中。
【专利摘要】本文中公开了使用SMAD7表达或功能的特异性抑制剂来治疗和/或预防结肠直肠癌的方法。还公开了用于治疗和/或预防结肠直肠癌的含有SMAD7抑制剂的药物组合物，以及在治疗和/或预防结肠直肠癌中使用的含有SMAD7抑制剂的药物的制造。
【IPC分类】C12N15/113, C07K14/495, A61K48/00
【公开号】CN105008394
【申请号】CN201480016188
【发明人】乔瓦尼·蒙泰莱奥内, 塞尔瓦托·贝林薇雅, 维蒂·弗朗西斯卡
【申请人】诺格尔制药有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2903597A1, WO2014140333A1