透明质酸的制造方法和含有通过上述制造方法制造的透明质酸的防粘连用组合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明要求2013年3月20日提交的韩国专利申请第10-2013-0029876号（申请 号）的优先权，上述说明书整体为本申请的参考文献。
[0002] 本发明涉及具有体内低分解速度的透明质酸的制造方法和含有通过上述方 法制造的透明质酸的防粘连用组合物，更详细而言，本发明涉及包括将停乳链球菌 (streptococcus dysgalactiae)9103菌株（KCTC11818BP)在含有碳源和氣源的培养基中 进行培养的步骤的具有体内低分解速度的透明质酸的制造方法和含有通过上述方法制造 的透明质酸的防粘连用组合物。
【背景技术】
[0003] 透明质酸（Hyaluronic acid (HA)、Hyaluronan，（C^H^NNaOn) η (n>1000))是存在 于生物体的高分子，是糖胺聚糖的多糖类。其结构中带有D-葡糖醛酸与N-乙酰葡糖胺 以-1，3键和-1，4键反复连结而成的结构。透明质酸为水溶性物质，是粘度极高、具有高弹 性的特性、分子量为1，000-10, 〇〇〇, 〇〇〇Da(道尔顿）的宽范围的直链多糖类。
[0004] 透明质酸的保湿效果强，在物理摩擦状态下强烈的润滑作用功能极为优异，在针 对细菌等的侵入的保护效果等效能和物性方面具有极为理想的优点，因而在治疗领域中需 要其的适用症极多。为了开发这样的透明质酸，基本上使用生物体组织提取法或微生物培 养法，但是最近，由于鸡的鸡冠提取法的病毒侵入、杂质、炎症反应等诸多缺点，与之相比， 能够对分子量和生产率进行调节、能够获得高品质原料的微生物培养生产法有受到偏爱的 趋势。特别是最近的趋势是根据通过微生物培养进行调节后生产的透明质酸的分子量范围 来确定开发用途。10万Da以下的超低分子透明质酸主要用于食品、化妆品的用途，平均分 子量100万Da的低分子透明质酸被用作滴眼剂的原料或衍生物开发对象，平均分子量300 万Da~400万Da的透明质酸作为膝关节注射剂原料的使用价值高。此外还增加了作为眼 科手术辅助剂的使用，作为身体内的超高分子在防粘连剂的原料中受到瞩目。
[0005] 粘连（adhesion)可见于普通炎症的治愈过程中，在形成肉芽组织、瘢痕（scar) 时会相互缠绕，或者大量析出的纤维素相互缠绕，从而引起这样的现象。一般而言，开腹手 术后以67%~93%左右的频率发生粘连，其中的一部分会自行分解，但大多数情况下，可 能会诱发在创伤治愈后仍存在粘连的各种后遗症（Eur. J. Surg 1997, Suppl 577, 32-39) 〇 为了防止这种情况，在世界范围内针对覆盖手术后的创伤部位或者通过药物学作用等以物 理、化学方式阻断与周边组织发生粘连的防粘连剂进行了开发。这样的防粘连剂利用多种 高分子物质等来制作，主要使用藻酸、CMC和透明质酸，关于透明质酸，使用了利用低分子透 明质酸使分子量、粘度或弹性等增大的透明质酸交联物质。防粘连剂通常以膜状制品的形 式销售，但不容易对薄的膜进行拉伸，且不容易将一个制品分到其他部位来使用。基于此， 开发出了凝胶状的制品，其可利用注射器挤到手术部位来使用。从凝胶制品的特性上而言， 有时会流淌下来，因此使用高分子物质，在透明质酸的情况下，大部分使用交联的透明质 酸。如上所述，在将交联的透明质酸用于防粘连剂的原料时，最成问题的是交联中使用的化 合物，即，透明质酸作为生物体内物质被分解后，交联中使用的化合物仍可能滞留于体内而 引起副作用。
[0006] 查看关于含有透明质酸的防粘连用组合物的韩国国内主要专利内容等可知，在韩 国注册专利第10-1074467号中将L-精氨酸与透明质酸混合来制造防粘连剂，在韩国注册 专利第10-0374666号和韩国公开专利第10-2011-0114810号中使用作为透明质酸盐之一 的透明质酸钠来制造防粘连用透明质酸凝胶。此外，在韩国公开专利第10-2009-0012439 号中使用将透明质酸与交联剂混合后交联而成的透明质酸；在韩国以外的国家，在 US6630167中将透明质酸水溶液混合到交联剂水溶液中来制造防粘连剂。因此，在韩国国内 的现有技术中，未发现单独使用未进行交联或未对结构进行改变的透明质酸的情况；对于 透明质酸的使用，在韩国国内的现有技术中大多认为，透明质酸在体内容易分解，因而滞留 时间短，对于仅利用未进行交联的透明质酸这一点，大部分持否定的视角。
[0007] 因此，当务之急是开发未交联的在体内的滞留期间长的透明质酸以及开发使用上 述透明质酸来制造的防粘连用组合物。
【发明内容】
[0008] 发明所要解决的问题
[0009] 本发明人在对开发出体内滞留期间长、在防粘连剂中有效的透明质酸的方法进行 探索的过程中发现，利用停乳链球菌9103菌株制造出的透明质酸的体内分解速度慢、防粘 连效果优异，从而完成了本发明。
[0010] 本发明的目的在于提供一种具有体内低分解速度的透明质酸的制造方法，其包括 将停乳链球菌9103菌株（KCTC11818BP)在含有碳源和氮源的培养基中进行培养的步骤。
[0011] 本发明的其他目的在于提供一种防粘连用组合物，其以通过本发明的透明质酸制 造方法制造的未进行交联的透明质酸作为有效成分。
[0012] 本发明的其他目的在于提供一种防粘连方法，其包括将通过本发明的透明质酸制 造方法制造的未进行交联的透明质酸施用给需要该透明质酸的个体的步骤。
[0013] 本发明的其他目的在于提供一种用于防粘连的透明质酸，其通过本发明的透明质 酸制造方法来制造，且未进行交联。
[0014] 用于解决问题的手段
[0015] 为了达成上述目的，本发明提供一种具有体内低分解速度的透明质酸的制造方 法，其包括将停乳链球菌9103菌株在含有碳源和氮源的培养基中进行培养的步骤。
[0016] 为了达成本发明的其他目的，本发明提供一种防粘连用组合物，其以通过透明质 酸制造方法制造的未交联的透明质酸作为有效成分。
[0017] 为了达成本发明的其他目的，本发明提供一种防粘连方法，其包括将通过本发明 的透明质酸制造方法制造的未进行交联的透明质酸施用给需要该透明质酸的个体的步骤。
[0018] 为了达成本发明的其他目的，本发明提供一种用于防粘连的透明质酸，其通过本 发明的透明质酸制造方法来制造，且未进行交联。
[0019] 以下详细说明本发明。
[0020] 本发明提供一种具有体内低分解速度的透明质酸的制造方法，其包括将停乳链球 菌9103菌株在含有碳源和氮源的培养基中进行培养的步骤。
[0021] 优选的本发明的制造方法为包括下述步骤的制造方法：
[0022] (a)将停乳链球菌9103菌株在含有碳源和氮源的培养基中进行培养的步骤；和
[0023] (b)从通过上述（a)步骤培养的培养物中回收透明质酸的步骤。
[0024] 上述本发明的停乳链球菌9103菌株为如下得到的微生物：从牛的粪便中分离出 微生物，分离出该微生物中生产透明质酸的菌株，之后诱发突变，分选出不生产透明质酸分 解酶的非溶血性菌株，从而得到上述微生物。
[0025] 本发明的停乳链球菌ID9103菌株可以通过通常的链球菌属微生物的培养法进行 培养。
[0026] 上述培养基为含有碳源和氮源的培养基，有时可以追加含有氨基酸或金属离子。
[0027] 本发明的碳源只要是公知的用于微生物培养的碳源，则任一种均可使用，优选为 选自由葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖、甘油和它们的混合物组成的组中的碳源。更优 选为麦芽糖。
[0028] 本发明的氮源只要是公知的用于微生物培养的氮源，则任一种均可使用，优选为 选自由酵母提取物、酪蛋白胨、酪蛋白酸解物、酪蛋白酶解物、细菌蛋白胨、酪胨、新胨蛋白 胨和它们的混合物组成的组中的氮源。更优选为酪蛋白酶解物。
[0029] 上述酪蛋白酶解物是指对酪蛋白进行酶解而得到的物质，例如为胰蛋白胨、胰蛋 白胨T、胰蛋白胨X、BBL Biosate蛋白胨、Difco消化酪蛋白、细菌酪蛋白胨、BBL胰化酪蛋白 胨、细菌胰蛋白胨、Bitec胰蛋白胨、N-Z-胺A、N-Z-胺AS、N-Z-胺EKC、N-Z-胺L浓缩物、 N-Z-Case、N-Z_Case M、N-Z_Case ME、N-Z_Case plus、N-Z_Case TT、肽酶、胰蛋白胨 USP、药 典级胰酶消化酪蛋白、胰酶消化酪蛋白、犹太洁食认证酶解酪蛋白、胰蛋白胨V。
[0030] 本发明的培养基可以追加含有氨基酸或金属离子。
[0031] 上述氨基酸的种类没有限制，优选为选自由谷氨酰胺、赖氨酸、半胱氨酸、精氨酸、 蛋氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和它们的混合物组成的组中的氨基酸。更优选为