亚硝酸盐在慢性缺血中的应用的制作方法

专利名称：亚硝酸盐在慢性缺血中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于治疗慢性组织缺血的方法和组合物，特别涉及诱导缺血组织新血 管生长的方法。
背景技术：
慢性组织缺血，即组织血液供应的持续抑制，能够损害组织功能并导致组织和器 官损伤。慢性组织缺血在关键器官系统或身体部位，例如心、脑、肾、皮肤、四肢或胃肠道，可 导致人类高发病率和死亡率，需要持续的治疗策略以恢复受损器官的血液供应。发明概述本发明部分基于我们对用于治疗慢性组织缺血的组合物和方法的发现，包括与慢 性组织缺血相关的疾病、创伤或先天缺陷。本发明方法所述慢性组织缺血可由任何医学状 况所致的对组织血液供应的持续或反复抑制而引起，例如疾病如外周动脉疾病、I型或II 型糖尿病、动脉粥样硬化、间歇性跛行(由于供血不足表现为四肢末端抽筋疼痛)、四肢缺 血疾病、中风、心肌梗死、肠炎和外周神经病变；创伤性损伤如伤口、烧伤、划伤、挫伤、骨折、 感染或外科手术创伤。因此，慢性组织缺血可产生于各种类型的组织，例如骨骼肌、平滑肌、 心肌、神经组织、皮肤、间质组织、结缔组织、胃肠组织或骨。不管所述方法是否与特定医学状况或组织类型有关，该方法可通过对需治疗的患 病体(例如人类患者)给药含有无机亚硝酸盐或其药用盐的药物组合物而实现。所述无机 亚硝酸盐或其药用盐可通过各种方式制备，且可包含药用载体。为方便阅读，在各种情况 下，我们将不重复词组“或其药用盐”。它被理解为，只要无机亚硝酸盐可以使用，该化合物 的药用盐也可以使用。因此，本发明描述了无机亚硝酸盐的生理学上可接受的组合物以及对诊断患有例 如慢性组织缺血患者给药该组合物的方法。这些方法包括步骤a)鉴定经受或可能经受慢 性组织缺血疾病的患病体(例如人类患者)；以及b)提供患病体含有无机亚硝酸盐的组合 物，使得亚硝酸盐的给药时间和给药量足以刺激缺血组织中的血管生长。所述亚硝酸盐可 导致治疗前不存在的血管形成或使已有血管尺寸增加。尺寸增加是由于新组织的形成(例 如，新组织加入管壁)；而不是简单血管舒张的结果。易于接受无机亚硝酸盐治疗的患者也 可以用硝酸盐治疗。我们可以交替使用术语“患病体”、“个体”和“患者”。虽然本发明方法旨在用于人类患者，但本发明不限于此。也可用于治疗家养动物，包括例如猫、狗、马、牛以 及其它家养动物。本发明的药物组合物含有亚硝酸盐，例如亚硝酸(HNO2)的盐或酯或其药用盐。此 处“药用盐”指公开的化合物的衍生物，其中母化合物通过将已有的酸或碱的一部分转化为 其盐的形式而修饰。药用盐的示例包括但不限于，碱性残基，如胺的无机或有机酸盐；酸性 残基，如羧酸的碱或有机盐等。本发明所述药用盐包括常规的由母化合物形成的无毒盐，例 如，从无毒的无机酸或有机酸得到。本发明所述药用盐可由通过常规化学方法得到的含一 部分酸或碱的母化合物合成得到。一般地，这类盐可通过将这些化合物的游离酸或游离碱 形式与化学计量的合适的碱或酸在水中或有机溶剂中，或二者的混合物中发生反应而制备 得到；一般地，优选非水介质像醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的药用盐可包括，例如，亚硝酸钠、亚硝酸钾或亚硝酸钙。然而，本发明不仅 限于 Remington' s Pharmaceutical Sciences, 17th ed. , Mack Publishing Company, Easton, Pa.，1985，p. 1418 禾口 Journal ofPharmaceutical Science, 66，2 (1977)中列举的 盐，它们各自作为整体通过引用并入于此。还理解为，本发明所述的某种亚硝酸盐化合物可 以是可溶形式，如水溶性的，以及不可溶形式。亚硝酸盐化学式为N02_，在水中以离子形式 存在。亚硝酸钠化学式为NaN02，溶于水时形成钠离子Na+和亚硝酸离子N02_。进一步地，可 理解为本发明包括所有亚硝酸盐化合物的可溶形式。对患病体给药无机亚硝酸盐，使其给药时间和给药量足以导致缺血组织血管生 长。新血管的生长可由任何导致缺血组织再生的过程引起，例如血管发生，即已有的微动 脉连接成真正的侧动脉，或血管发生和动脉生成相结合。治疗过程中可直接监控新血管生 长，使用例如成像技术，如对照血管造影术，用于高分辨率灌流的对照脉冲序列(contrast pulse sequence,CPS)超声成像，生物标记，或者间接的，即通过临床终点监控。例如，给药 亚硝酸盐直至慢性缺血症状，例如间歇性跛行、静息性的跛行、神经病变或受损组织伤口愈 合得到改善。临床症状改善的评价需要将缺血组织和相应的非缺血组织进行比较。特定临 床终点的选择，部分基于医学状况的本质，例如间歇性跛行的停止或改善对于外周动脉疾 病或糖尿病患者是有用的；皮肤溃疡的治愈对于受损伤口愈合的患者是有用的，胃肠疼痛、 腹泻和便秘症状的减轻对于肠缺血患者是有用的。无机亚硝酸盐的使用剂量可以不同。例如，患病体可接受从约0.05iig/kg 约 5000 u g/kg.，例如约 0. 05、1、5、10、25、50、100、200、250、300、400、450、500、550、600、650、 700、750、800、850、900、1000、1250、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500 或 5000 u g/ kg。例如，患病体可接受高达或高达约165 ii g/kg、16. 5 ii g/kg或8. 25 ii g/kg。一般地，亚 硝酸盐的给药量为循环浓度(circulatingconcentration)不超过0. 6yM(即，亚硝酸盐的 给药剂量足以使得患病体内亚硝酸盐的循环浓度不超过0. 6 y M)。例如，亚硝酸盐的给药 量可以为循环浓度不超过 0. 0005 u M、0. 001 u M、0. 002 u M、0. 003 u M、0. 004 u M、0. 005 u M、 0. 01 u M、0. 02 u M、0. 03 u M、0. 04 u M、0. 05 u M、0. 1 u M、0. 15 u M、0. 2 u M、0. 25uM>0. 3u M、 0. 35iiM、0. 4iiM、0. 45iiM、0. 5iiM、0. 55 ii M或0. 6 ii M。因此，例举剂量可以使患病体内亚 硝酸盐的循环浓度达到或高达约0. 03 u M、0. 003 ii M或0. 0015 u M。治疗频率可以不同。患病体每天可接受一次或多次治疗(例如，1次、2次、3次、4 次、5次或6次/天)或者每隔数小时治疗(例如，约每隔2、4、6、8、12或24小时)。疗程可持续不同时间，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或更久。例如，可以 是每天2次，治疗3天，每天2次，治疗7天，每天2次，治疗10天。治疗周期可间断重复， 例如，每周、每两个月或每月，间断期间不给药。治疗可以是单独治疗或患病体生命期的持 续治疗(例如很多年)。所述组合物可以采用多种途径给药。例如，所述组合物经皮或静脉注射(输注)、 皮下、舌下、颅内、肌内、腹腔或肺内给药。本发明还包括口服剂。治疗原则可根据本领域技 术人员考虑的各种因素而不同。这些因素包括给药途经、制剂性质、患者疾病性质、患病体 大小、体重、体表面积、年龄、性别、对患者给药的其它药物以及主治医师的判断。所述组合 物可单独给药，或与其它用于慢性组织缺血的疗法联合给药，例如药物疗法、免疫疗法或外 科手术的方法(例如，阿司匹林治疗、抑制素治疗或抗高血压治疗)。本发明方法治疗的疾病可包括任何表现为慢性缺血的疾病。由于动脉狭窄或阻塞 所致慢性组织缺血的情况，例如，包括但不限于，例如，动脉粥样硬化、动脉硬化、急性冠状 综合征、冠状动脉疾病(CAD)、中风、肠缺血以及外周动脉疾病。本发明还包括由伤口，例如 损伤或外科手术引起的慢性组织缺血。除特殊说明，本文所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员公知的相同的 含义。尽管与本文所描述的相似或等同的方法和材料可用于实践或用来检测本发明，但合 适的方法和材料描述如下。所有出版物、专利申请、专利和本文提及的其它文献作为整体通 过引用并入。为避免冲突，将控制本说明书，包括定义。此外，所述材料、方法和示例仅为例 举，但不限于此。本发明一个或多个实施例连同附图和说明详述如下。本发明其它特征、目的和益 处将从说明书、附图和权利要求中毫无意义地得出。


图1A、1B、1C和1D描述的分析结果表明慢性亚硝酸钠治疗恢复的缺血后肢血流量 为NO依赖方式，慢性亚硝酸钠治疗对缺血后肢血流量的影响。图1A描述了与PBS对照相 比，不同剂量的慢性亚硝酸钠治疗对缺血后肢血流量的影响。图1B描述了亚硝酸钠加lmg/ kg羧基PTI0治疗对缺血后肢血流量的影响。图1C描述了注射165 u g/kg亚硝酸钠对缺血 后肢血流量的影响。图1D描述了注射PBS对缺血后肢血流量的影响。*，P < 0. Olvs PBS 对照，各时间点 ’#，P < 0. 01165 u g/kg亚硝酸钠vs 165 u g/kg亚硝酸钠加cPTIO，各时间 点o图2A和2B描述的分析结果表明慢性亚硝酸钠治疗不改变非缺血后肢血流量。图 2A表明腹腔内注射PBS的非缺血后肢血流量。图2B描述了腹腔内注射165 u g/kg亚硝酸 钠的非缺血后肢血流量。图3描述了不同剂量的慢性硝酸钠治疗对缺血后肢血流量影响的分析结果。图4A、4B、4C、4D、4E和4F描述的分析结果表明在NO-依赖方式下，慢性亚硝酸钠 治疗增加了缺血组织血管密度。图4A和4B描述了在第7天，分别以亚硝酸钠治疗的动物 和以硝酸钠治疗的动物，其CD31(红)和DAPI核(蓝)染色缺血腓肠肌的典型图像。图4C 和4D描述了在第3天和第7天，分别以165 u g/kg亚硝酸钠和以165 u g/kg硝酸钠治疗， 其缺血腓肠肌的血管密度。图4E和4F描述了在第3天和第7天，分别以165 y g/kg亚硝酸钠加羧基PTI0治疗，其缺血腓肠肌的血管密度。(标尺，150 u m)图5A、5B和5C描述了对高剂量亚硝酸钠和非缺血亚硝酸盐组织的血管密度测定 的分析结果。图5A和5B描述了在第3天和第7天，分别以3. 3rng/kg亚硝酸钠和硝酸钠 治疗，其缺血腓肠肌的血管密度。图5C描述了在第7天，以PBS-对照和165 u g/kg亚硝酸 钠治疗的小鼠，其非缺血腓肠肌的血管密度测定。图6A、6B、6C和6D描述的实验结果表明在N0-依赖方式下，慢性亚硝酸钠治疗刺 激的内皮细胞增殖。图6A和6B描述了在第3天，分别以PBS和165 u g/kg亚硝酸钠治疗 的动物，其Ki67增殖标记(绿)、⑶31(红)和DAPI核(蓝)染色缺血腓肠肌的典型图像。 图6C描述了在PBS和亚硝酸钠治疗的组织士 cPTIO之间，以DAPI核染色的共区域化的Ki67 量。图6D描述了在PBS和亚硝酸钠治疗的组织加cPTIO之间，以⑶31染色的共区域化的 Ki67的测定。*，P < 0. 001亚硝酸钠vsPBS或亚硝酸盐加PTI0。(标尺，150 u m)图7A、7B、7C、7D和7E描述的实验结果表明慢性亚硝酸钠治疗改变的血液和组织 中的亚硝酸盐水平。图7A描述了在第3天和第7天，以PBS对照和亚硝酸钠(165 u g/kg) 治疗，其血液亚硝酸盐水平。*沖<0.01治疗^ PBS对照血液亚硝酸盐水平。图7B和7C 描述了在第3天和第7天，分别以PBS-治疗的对照组和亚硝酸盐-治疗的动物(165 u g/ kg)，其组织亚硝酸盐水平。*，P < 0. 01缺血vs非缺血组织亚硝酸盐水平。图7D和7E描 述了在第3天和第7天，分别以PBS-治疗的对照组和亚硝酸盐-治疗的动物，在缺血和非 缺血后肢中，其总eNOS蛋白表达，标准化为0肌动蛋白表达。图8A、8B、8C和8D描述的实验分析结果为慢性亚硝酸钠治疗对组织NO代谢和 cGMP水平的影响。图8A和8B描述了在第3天和第7天，分别以PBS对照和165 u g/kg亚硝 酸钠治疗，在非缺血组织和缺血组织中，其SN0+XN0的水平。图8C和8D报告了在第3天和 第7天，分别以PBS对照和165 u g/kg亚硝酸钠治疗，在非缺血组织和缺血组织中，其cGMP 总蛋白的量，pg/mg。图9A、9B、9C、9D和9E描述的实验结果表明慢性亚硝酸钠治疗显著增加了缺血组 织血流量和刺激动脉生成。图9A和9B描述了在不同时间点，分别加入cPTIO和不加入 cPTIO,由165 u g/kg亚硝酸钠引起的慢性缺血组织中血流量的显著变化。图9C描述了以 PBS-治疗的对照组和亚硝酸钠治疗的动物，其动脉分支的数量。图9D和9E描述了在第7 天，分别以亚硝酸盐治疗和以PBS-治疗的小鼠，其缺血后肢中动脉脉管的脉管形成。*，P < 0. Olvs硝酸钠。图10描述的实验结果表明单次腹腔注射亚硝酸钠不能恢复缺血后肢血流量。图11描述的实验结果表明延迟的亚硝酸盐治疗能恢复缺血后肢血流量。*，P <0.01，在各时间点，亚硝酸钠vs PBS。图12描述的实验结果表明持续的亚硝酸盐治疗增强了伤口愈合。CP < 0. 01，在 各时间点，亚硝酸钠vs PBS)图13描述的实验结果表明亚硝酸钠恢复了 Db/Db糖尿病小鼠的缺血后肢血流量。 (*P < 0. 01，在各时间点，亚硝酸钠vs PBS)不同附图中的相同标记表示相同要素。发明详述我们在下文中将继续描述本发明治疗慢性组织缺血的方法。这些方法可以应用到在任一不同医学状况下可引起慢性组织缺血的患者中，并预期使这些患者受益。除其他因 素外，该方法基于发明人发现对具有慢性组织缺血的患病体施用无机亚硝酸盐或含有无机 亚硝酸盐的药物组合物后，结果在缺血性的组织中新血管发生了选择性增长。组合物本发明的药物组合物包括无机亚硝酸盐，例如亚硝酸(HN02)盐或酯或者其药用 盐。亚硝酸盐离子为no2-。通常来讲，亚硝酸盐化合物既可以是亚硝酸的盐，也可以是亚硝 酸的酯。亚硝酸的盐包括但不限于碱金属盐类，如钠、钾；碱土金属盐类，如钙、镁、钡，以及 有机碱的盐类，如胺基碱和无机基碱。本发明的化合物还包括产生于中间体或最终化合物 中的原子的所有同位素。同位素包括那些原子数相同但质量数不同的原子。例如，氢的同 位素包括氚和氘。本文所用的术语“化合物”是指任一无机亚硝酸盐或其药用盐，意味着包 括所述结构的所有立体构体、几何异构体、互变异构体以及同位素。所有化合物及其药用盐 也都意味着包括溶剂化物或水合物的形式。本发明的化合物可以采用化学合成领域的普通技术人员已知的各种方法来制备。 本发明的化合物可以采用下述的方法连同合成化学领域已知的合成方法一起进行合成，或 采用本领域普通技术人员推崇的在此基础上进行变换的方法来合成。亚硝酸盐的制备方法 在本领域中是公知的，广泛的前体和亚硝酸盐也可以从市场上购买到。碱和碱土金属的亚 硝酸盐可以通过将一氧化氮(NO)和二氧化氮(N02)的混合物与相应的金属氢氧化物溶液 进行合成得到、以及通过相应硝酸盐的最终分解得到。其他亚硝酸盐可以通过还原相应的 硝酸盐来获得。本发明的化合物可以采用下述常规的方法和步骤从易得的起始原料制备。十分感 谢给出的经典的或优选的工艺条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)， 除另有说明外，还可以使用其他的工艺条件。最佳的反应条件可以根据所用的反应物或溶 剂而有所不同，但这种条件可以由本领域的普通技术人员通过常规的优选程序来决定。不考虑本发明化合物的原始来源或它们所获得的方式，本发明的化合物可以根据 它们的应用来配制。例如，本发明的化合物可以组合物的方式配制，应用于组织培养的细胞 中或给予患者。当作为药物时，本发明化合物的任一种都可以药物组合物的形式给药。这 些组合物可以药学领域熟知的方式制备，也可以通过各种途径给药，这取决于局部治疗或 全身治疗以及待治疗的区域。给药方式可以是局部给药(包括眼部和粘膜，其中包括鼻腔 粘膜，阴道和直肠递送)、肺部给药(例如通过粉末或气雾剂的吸入剂或吹入剂，包括通过 喷雾器；气管内的、鼻腔内的、表皮的和经皮的)、眼部、口腔或胃肠。眼部递送的方法可包 括局部给药(眼药水)、结膜下、眼周或玻璃体内注射或球囊导管插入或在结膜囊内通过手 术放置眼部植入物。肠胃外给药包括静脉、动脉、皮下、腹腔或肌肉注射或输液；或颅内，如 鞘内或脑室内给药。肠胃外给药可以为单丸剂量的形式，或可以例如通过连续灌注泵的形 式。局部给药的药物组合物和制剂可包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳剂、凝胶、滴剂、栓剂、喷 雾剂、液体、粉末等等。如有必要，还可选用常规药物载体、水性、粉末或油性基质，增稠剂寸。本发明还包括药物组合物，该药物组合物含有作为活性成分的一种或多种本文所 述的化合物，其与一种或多种药用载体联用。在制备本发明的组合物时，活性成分典型地 与赋形剂混合，并由赋形剂稀释或包被于下述容器中，所述容器的形式可以是例如胶囊、小袋、纸或其他容器。当赋形剂用作稀释剂时，可以是固体、半固体或液体材料(例如中性盐 水)，这些材料作为活性成分的媒介、载体或介质。因此，所述组合物可以是片剂、丸剂、粉 剂、锭剂、小袋、扁囊剂、酏剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(固体或在液体介质 中)、含有例如活性化合物重量最大为10%的软膏剂、软和硬明胶胶囊、栓剂、无菌注射溶 液和无菌包装粉末。正如本领域已知的，稀释剂的类型可以根据预期给药途径而有所不同。 所得组合物可以包括附加剂，诸如防腐剂。所述化合物还可以应用到器械(如导管)表面， 或含在泵、贴片或其他药物递送器械的里面。本发明的治疗药物可以单独施用，或者在药用 赋形剂或载体(如生理盐水)存在的情况下在混合物中施用。基于给药模式和途径选择 赋形剂或载体。用于药物制剂的适宜的药用载体以及药用必需品在本领域熟知的参考书 Remington ‘ sPharmaceutical Sciences (E. W. Martin)以及 USP/NF (美国药典和国家处 方)中均有描述。在制剂过程中，可先将活性化合物磨碎以提供适当的粒径，然后再与其他成分相 结合。如果活性化合物基本上不溶于水，可将其粒径磨至小于200目。如果活性化合物实 质上是水溶性的，可以通过研磨来调整粒径，使其在制剂中基本上均勻分散，如约40目。一些适当的赋形剂示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、 磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆和甲 基纤维素。该制剂还可以包括润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；湿润剂；乳化剂和悬 浮剂；防腐剂，如甲基-和羟丙基-苯甲酸；甜味剂；以及调味剂。采用本领域已知的方法 将所述药物组合物这样配制，患者服用后可使活性成分速释、缓释或延迟释放。所述组合物可以单位剂量形式配制，每份剂量含有，例如，活性成分从约0. lmg至 约50mg、从约0. lmg至约40mg、从约0. lmg至约20mg、从约0. lmg至约10mg、从约0. 2mg至 约20mg、从约0. 3mg至约15mg、从约0. 4mg至约10mg、从约0. 5mg至约lmg ；从约0. 5mg至约 lOOmg、从约0. 5mg至约50mg、从约0. 5mg至约30mg，、从约0. 5mg至约20mg、从约0. 5mg至约 10mg、从约0. 5mg至约5mg ；从约lmg至约50mg、从约lmg至约30mg，、从约lmg至约20mg、 从约lmg至约10mg、从约lmg至约5mg ；从约5mg至约50mg、从约5mg至约20mg、从约5mg 至约10mg ；从约10mg至约100mg、从约20mg至约200mg、从约30mg至约150mg、从约40mg 至约100mg、从约50mg至约100mg。术语“单位计量形式”是指物理上的离散单位，适合于人 类患病体和其他哺乳动物的单一剂量，每个单位含有预定量的活性物质，以该活性物质联 合适当的药用赋形剂所能产生的预期的治疗效果来计算。制备固体组合物诸如片剂时，将 主要的活性成分与药用赋形剂混合，形成含有本发明化合物的均勻混合物的固体预制剂组 合物。当提及这些预制剂组合物均勻时，活性成分典型地均勻分布在整个组合物中，所以所 述组合物可以很容易地被分成等量的有效的单位计量形式，诸如片剂、丸剂和胶囊剂。然后 将该固体预制剂分成上述类型的单位剂量形式，例如本发明的活性成分从0. 1至约500mg。本发明的片剂和丸剂可以有包衣，或者以其他形式混合以提供一种具有延长效果 优势的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量和外剂量组分，后者以封套的形式包裹前 者。这两种组分可以通过肠衣层分开，肠衣层的作用是抵抗在胃中分解，并允许内层组分完 整地通过十二指肠，或延迟释放。可以用各种材料作为肠衣层或包衣层，这些材料包括许多 聚合物酸及聚合物酸与虫胶、十六醇和乙酸纤维素等材料的混合物。可以用于口服给药或注射给药的本发明化合物和组合物的液体形式包括水溶液、
9适当的调味糖浆剂、水或油混悬剂，及含有食用油诸如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油的 调味乳剂，以及酏剂及同类药用载体。用于吸入剂或吹入剂的组合物包括药用溶液和混悬液、水或有机溶剂或者它们的 混合物，及粉末。液体或固体混合物可以含有本文中描述的和/或本领域已知的适当的药 用赋形剂。在一些实施方案中，所述组合物可以通过具有局部或全身作用的口服或鼻呼吸 途径给药。可以通过使用惰性气体喷洒组合物。喷雾溶液可以直接从喷雾设备中吸入，或 者从可直接连接到一个面罩或间歇性正压呼吸机的喷雾装置中吸入。溶液、混悬剂或粉末 组合物都可以适当的方式从递送制剂的器械中通过口服或鼻腔给药。施予患者的组合物可以是上述药物组合物中的一种或多种形式。这些组合物可以 通过常规的灭菌技术或无菌过滤进行灭菌。水溶液可以包装使用，或冻干使用，给药前，将 冻干制剂与无菌水载体结合使用。化合物制备的PH典型地在约3-11之间，例如在约5-9 之间、6和7之间、7和8之间。可以理解，使用前述的赋形剂、载体或稳定剂将会形成药用 盐制剂。药物组合物中本发明化合物的比例或浓度将根据许多因素而有所不同，这些因素 包括剂量、化学特性(如疏水性)和给药途径。例如，本发明的化合物可以生理缓冲水溶液 的形式来提供，该溶液含有约0. 1至约10% w/v的该化合物，用于肠外给药。治疗方法慢性组织缺血与广泛的医学状况有关，这些医学状况可导致流向身体某部分或组 织包括身体某部分的血液部分地、基本上完全或完全减少，也可能是疾病、损伤或未知原因 导致的结果，还可能受个体遗传构造的影响。不考虑导致慢性组织缺血的医学状况，用包括 本文描述的无机亚硝酸盐的药物组合物治疗慢性组织缺血的患者。这种治疗可以完全地或 部分地消除慢性组织缺血的一些或全部症状和体征，降低症状的严重度，延迟发作，或者减 缓进展或随后症状发展的严重度。新血管生长如下面进一步的描述，本发明的组合物给药一定时间和一定量后，足以在缺血组 织中出现新血管的生长。我们可以交换地使用术语“新血管生长”、“新血管形成”和“新血 管发展”。新血管生长是指血管形成过程中的所有时期，包括初始信号事项、内皮细胞的细 胞补充、新血管及新血管与已存在血管之间连接的形成和扩大。新血管生长可能来自引起 缺血组织血管再生或血管新生的任何过程，例如血管生成、或血管形成、或者血管生成与血 管形成的结合。术语血管发生典型地用于描述从成血管细胞到血管的胚胎发展。血管形成 一般被理解为产后要求康复的生理过程。血管生成一般围绕新毛细血管或毛细血管分支的 形成，通过从既存的毛细血管中生长、发育和重叠而形成。血管形成，即先前存在的小动脉 的连接产生真实侧支动脉的生长，一般被理解为围绕在动脉闭塞后从既存的相互连接的小 动脉中形成成熟的动脉。血管生成具有一些共性，但导致它的途径不同，因此最终结果为 血管形成能潜在地完全替换闭塞的动脉，而血管生成则典型地不能完全替换。但限制性结 构位于新毛细血管的上游时，在缺血性区域增加毛细血管的数量不能增加血流量；在阻塞 位点周围转移血流量形成新的侧支血管。另外，由血管生成和血管形成产生的结构在细胞 组成上有所不同。毛细血管是由血管外皮细胞支持的内皮细胞形成的管路。动脉和静脉是 由很多层组成的内膜，由内膜细胞、外膜细胞和基底膜构成；中间层，主要由平滑肌细胞及其胞外基质构成；和最大血管中的外膜，主要由纤维母细胞及其胞外基质构成。多种信号途径都有助于新血管生长。这些途径的中心是缺氧诱导因子1 (HIF-1)， 一种由结构性的表达HIF-10亚单位和氧-调节的HIF-la亚单位构成的异源转录因子。 HIF-1 a亚单位在充分的灌注细胞中不停的合成和降解；在缺氧条件下，HIF-1 a的降解 受到限制，导致其蓄积和HIF-1 0与二聚化、DNA结合、共激活因子的补充和靶基因转录激 活。氧供求不平衡导致氧不足，这种生理刺激诱导细胞产生血管生成细胞因子，诸如血管 内皮生长因子(VEGF)。这些分泌的蛋白在内皮细胞上与它们的同族受体(VEGFRs)结合， 激活信号转导途径，刺激细胞发生血管生成。VEGF在内皮细胞中导致大量的信号级联。结 合到VEGF受体-2 (VEGFR-2)启动酪氨酸激酶信号级联，刺激因子产生，不同程度的刺激血 管通透性(eNOS，产生NO)、增殖/存活(bFGF)、迁移(ICAMs/VCAMs/MMPs)并最终分化为成 熟的血管。包含在新血管形成的其他生长因子包括，例如，FGF，能促进内皮细胞、平滑肌细 胞和纤维母细胞的增殖和分化；VEGFR和NRP-1，能整合生存信号；Angl和Tie2，能稳定血 管；PDGF(BB-homodimer)和 PDGFR，能使平滑肌细胞恢复健康；TGF-0、endoglin 和 TGF-3 受体，能增加胞外基质生产；MCP-1;整合素aV0 3、5和a 5 0 1，能结合基质大分子 和蛋白酶；VE-钙粘附蛋白和CD31 ；蝶素，能决定动脉或静脉的形成；纤溶酶原激活因子，能 改变胞外基质并释放和激活生长因子；纤溶酶原激活因子抑制因子-1，能稳定血管；N0S和 C0X-2 ；AC133，能调节成血管细胞分化；以及Idl/Id3，能调节内皮的转分化。除了在缺血组织中具有能激活血管内皮细胞的能力外，某些血管生成细胞因子， 诸如VEGF、PLGF和基质衍生的生长因子1 (SDF-1)，能刺激血管生成细胞的异源群体从骨髓 和其他组织到血管生成和血管形成的位点的迁移和恢复。已知能参与到这些反应中的细胞 类型为循环血管生成细胞，包括内皮祖细胞、骨髓细胞、间质细胞和造血祖细胞。血管形成似乎主要由流体切应力引发，该流体切应力是动脉闭塞后由血流量条件 改变诱导的。血管形成包括内皮细胞的活化、基底膜降解、白细胞浸润、血管细胞增殖、新生 内膜形成、细胞外基质的重建和细胞因子参与。更具体地说，机械应力引起内皮细胞产生化 学促进因子，开始增加直径的进程。切向应力的增加引起在血管壁表面表达的单核细胞趋 化蛋白-1 (MCP-1)分子数量的增多，以及TNF- a、bFGF和MMP的水平增加。MCP-1能增加 单核细胞粘附到细胞壁的趋势。TNF-a为细胞发展提供了一个炎性环境，而bFGF有助于在 内皮细胞诱导有丝分裂。最后，MMPs改造动脉周围的空间，提供新的侧支血管扩张的余地。一氧化氮(NO)在血管生成和血管形成中均显示出正向调节内皮细胞应答。N0增 加了各种血管新生因子的表达，包括VEGF，其中，连同其他调节因子，通过正反馈机制增加 N0水平。除了刺激仅由脆弱的内皮细胞组成的新生的和不成熟的血管生长，N0还能恢复血 管周壁细胞，稳定血管并让它们成为全面运作的渠道。N0还可以防止缺血性损伤的组织细 胞呼吸放缓。已证实N0可调节几种内皮细胞信号途径，例如，Erkl/2和PKC。在心血管系统中负责产生N0的主要的酶为内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，其受大 量分子和信号途径调控。重要的是，由于酶表达量通常与N0代谢水平成正比，eNOS活性 很大程度上也是负责全身的N0生产。N0很容易通过脂质双层扩散，其生物学行为主要取 决于与金属蛋白和其他自由基种类的反应；经典的示例为可溶于血红素酶的鸟苷酸环化酶 (sGC)的活化，其能启动信号级联，导致血管扩张和抑制血小板。此外，N0也可以通过氧化 产生亚硝酸盐，亚硝酸盐可进一步被氧化生成硝酸盐(N03_)。
亚硝酸盐和硝酸盐都能从N0S独立途径调节NO产生。无机亚硝酸盐可以与氧_血 红素结合蛋白(血红蛋白和肌红蛋白)、脱氧血红蛋白、脱氧肌红蛋白、黄嘌呤氧化还原酶、 内皮型一氧化氮合成酶、酸性歧化通过各种机制接受一个电子还原为N0，线粒体电子传递 链中的各成员，例如，线粒体血红蛋白都是潜在的电子供体。亚硝酸盐被还原成NO的能力， 使其在生物条件下成为唯一的NO供体，例如组织缺血，在生物条件下，这些潜在还原剂中 的大多数都是有活性的。NO与几种胞内靶标相互作用，形成各种含有NO的种类，包括S-亚 硝基硫醇、C-或N-S-亚硝基化合物，以及亚硝基血红素加合物。此外，这些亚硝基产物可 以作为NO的生物储藏器，在一定条件下将其释放出来。给药本发明治疗慢性组织缺血的方法是通过给药无机亚硝酸盐一定时间和足以在缺 血性组织中使新血管生长的量。所述组合物的给药量和频率可以根据不同情况而有所不同，例如，根据给药对象、 患者的状态和给药的方式。在治疗应用中，对慢性组织缺血患者给予所述组合物的给药量 应足以减轻或至少部分减轻慢性组织缺血及其合并症的症状。剂量有可能依赖于慢性组织 缺血的类型和进展程度、慢性组织缺血的严重程度、年龄、体重和特殊患者的一般情况、所 选组合物的相对生物学效果，赋形剂的制剂、给药途径以及主治医师的判断等变量。可以从 由体外和动物模型试验系统得出的剂量-响应曲线推测有效剂量。有效剂量是指产生令人 满意的临床结局的剂量，例如改善慢性组织缺血的症状和体征或减缓其进展。每剂无机亚硝酸盐的用量可以不同。例如患病体可以接受的剂量为从约0. 05 Ug/ kg 至约 5000 u g/kg,例如约 0. 05、1、5、10、25、50、100、200、250、300、400、450、500、550、 600、650、700、750、800、850、900、1000、1250、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500 或 5000 u g/kg。一般地，我们给予亚硝酸盐的量的循环浓度不超过0. 6 ii M、例如0. 0005 u M、 0. 001 u M、0. 002 u M、0. 003 u M、0. 004 u M、0. 005 u M、0. 01 u M、0. 02 u M、0. 03 u M、0. 04 u M、 0. 05iiM、0. liiM、0. 15iiM、0. 2uM>0. 25uM>0. 3uM>0. 35 u M>0. 4 u M>0. 45uM>0. 5 u M> 0. 55 ii M 或 0. 6 ii M。因此，示例性的剂量可以包括 8. 25 u g/kg、16. 5 u g/kg 或 165 u g/kg, 示例性的循环血浆浓度可以包括0. 0015 u M、0. 003 ii M或0. 030 u M。治疗的频率也可以不同。患病体每天可以进行一次或多次治疗(例如，一次、两 次、三次、四次或多次)或者每几个小时接受治疗(例如，约每2、4、6、8、10、12或24小时)。 治疗的疗程可以是不同的期间，例如两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天或 更多天。例如，治疗可以为一天两次共三天、一天两次共七天、一天两次共十天。治疗周期 可以间隔重复，例如每周、每两个月或每个月，其间需有一段不治疗的时间。治疗可以是单 次治疗或者持续至患者终身(例如很多年)。慢性组织缺血本发明的方法可应用到任何广泛的医学状况，其中一个最基本的特征就是流向人 体组织或器官的血液持续下降，或者已经部分或完全堵塞。因此，本方法可应用于治疗与疾 病、与外伤或环境压力相关的慢性组织缺血。组织的血流量减少可能是例如渐进的动脉阻 塞的结果，这种渐进的动脉阻塞由动脉粥样硬化的斑块或存在凝血块引起的血管变硬和/ 或失去弹性导致。组织的血流量减少也可能是环境危害的结果，例如外伤或手术操作阻断 了血液流向组织或器官。典型地，随着伤口区域缺氧程度的不同，伤口的氧张力快速地且逐渐地减小。诱发缺氧的环境条件也属于本发明的范围。本发明所涉及的疾病包括，例如，心血管疾病、外周动脉疾病、动脉硬化、动脉粥样 硬化、心肌梗死、严重肢体缺血性疾病、中风、急性冠脉综合征、间歇性跛行、糖尿病、包括1 型和2型糖尿病、皮肤溃疡、外周神经病变、发炎性肠道疾病、溃疡性结肠炎、克罗恩病、肠 缺血和慢性肠系膜缺血。本发明的方法还可应用到与外伤有关的慢性组织缺血，例如，外部损伤诸如伤口、 裂伤、烧伤、挫伤、骨折或慢性感染。包含在本发明范围内的还有任何手术操作引起的持续 性组织损伤，例如，动脉内膜切除术。包括组织或器官移植的操作也属于本发明的范围。示 例包括血管搭桥，心脏、肝、肺、胰岛细胞移植以及用于植入宿主的体外产生的组织移植。本 发明的方法还用于治疗由暴露在环境危害引起的慢性组织缺血，例如在低氧条件下慢性暴 露，如高纬度或持续的有氧消耗。本文提供的方法适用于任一个广泛的组织类型，包括，例如，肌肉、平滑肌、骨骼 肌、心脏肌肉、神经组织、皮肤、骨髓间充质组织、结缔组织、肠胃组织或骨。软组织，诸如上 皮组织，如单层的鳞状上皮、分层的鳞状上皮、立方上皮或柱状上皮，疏松结缔组织(也称 为乳晕结缔组织)，纤维结缔组织，如将肌肉连接到骨骼的肌腱和在关节处将骨连接在一起 的韧带。本发明的方法包括识别经受或有可能经受慢性组织缺血的患病体(例如人类患 者)的步骤。因为慢性组织缺血可由广泛的医学状况引起，其中最基本的特征是流向组织 的血液持续下降，或者已经部分或完全堵塞，这一特别的症状和体征将由于各种原因或减 少血流量的因素而有所不同。因此，例如周边动脉疾病(PAD)(周边血管疾病的一种形式，其中动脉有部分或完 全阻塞，常常是由于通向腿或手臂的一或多条血管动脉粥样硬化导致)中慢性组织缺血的 症状，包括间歇性跛行，即髋部、臀部、大腿、膝盖、小腿或上脚部在用力时疲劳、抽筋和疼 痛，休息后消失，休息时跛行、麻木、刺痛、或者小腿或脚凉、神经病变，或缺损组织创面愈 合。下肢的PAD往往与糖尿病，特别是2型糖尿病有关。臂动脉疾病通常不是由于动脉粥 样硬化所致，而是其他条件，例如自身免疫性疾病、血液凝块、放射治疗、雷诺氏病、重复运 动和外伤。手臂运动时的常见症状包括不舒服、沉重、疲倦、手指痉挛和疼痛。通过进行一 个或多个诊断测试，可以诊断PAD，诊断测试包括，例如，踝肱指数(ABI)测试、血管造影、超 声或MRI分析。心肌缺血很少有或根本没有症状，但通常情况下，它与诸如心绞痛、疼痛、疲劳血 压升高的症状有关。心肌缺血的诊断测试包括血管造影、休息、运动或动态心电图；闪烁 显像研究(放射性心脏扫描)；超声心动图；冠状动脉造影；以及很少用的正电子发射断层 扫描。本发明的方法也可与本领域已知的其他方法联用治疗慢性组织缺血，包括药物治 疗、手术、抗炎制剂、抗体、运动或改变生活方式。特定治疗方法的选择可能各不相同，将取 决于慢性组织缺血的严重程度，患病体的一般健康和主治医生的判断。本发明的组合物也 可以与一种或以上的有效成分结合调配，它可以包含任何药物制剂，如抗高血压药、抗糖尿 病药物、他汀类药物、抗血小板药物(氯吡格雷和西洛他唑)、抗体、免疫抑制剂、抗炎制剂、 抗生素、化疗药物等。
具体实施例方式实施例1材料和方法动物和试剂。除特殊说明，使用的雄性野生型(C57BL/6J)小鼠，体重为20_25mg， 2-3 月龄。小鼠喂饲于 Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care, International-accreditedLSUHSC-Shreveport animal resource facility,并按照 National ResearchCouncil' s Guide for Care 禾口 Use of Laboratory Animals 进对亍。所有实验方案均获得 LSU Institutional Animal Care 禾口 Use Committee 批准。亚硝酸钠、硝酸钠、磷酸缓冲盐(PBS)以及其它化学试剂购自Sigma Chemical (St Louis, M0)。后肢缺血樽型。按照 Senthilkumar，A.，Smith, R. D.，Khitha, J.，Arora, N.， Veerareddy, S. , Langston, ff. . Chidlow, J. H. , Jr. , Barlow, S. C. , Teng, X. , Patel, R. P., 等2007. Arterioscler Thromb Vase Biol27 :1947-1954，通过结扎与深股动脉邻近的左侧 普通股骨动脉，引起后肢缺血。小鼠通过腹腔注射氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(8mg/kg) 进行麻醉，无菌条件下进行外科手术。将普通股骨血管和股骨神经均与动脉分开。在与深 股动脉邻近的普通股骨动脉设置两处结扎，然后在两处结扎之间切断。封闭切口并立即用 激光多普勒测量确定结扎处的组织血流量。血管牛成。使用Microfil硅酮注射MV120测定缺血四肢的后肢血管生成。血管 生成前，静脉注射罂粟碱(5ng/ml)和腺苷(lmg/ml)以增加铸型树脂的灌流。简言之，将与 股骨动脉分叉邻近的腹部大动脉用5. 0缝线材料和插套管尾部与结扎处连接，此处用PE50 管支撑，用缝线结扎。将400ia Microfil灌注至大动脉导管，在4°C原位放置16小时。将 后肢肌肉组织逐级置于40%、60%、80%和100%的甘油溶液中孵育，每种浓度各孵育24小 时，进行清洗。随后用立体显微镜拍摄血管生成。激光多普勒测量组织血流量。Vasamedics Laserflo BPM2深度组织穿透激光多 普勒装置用于测量后肢血流量。将探针置于小鼠腓肠肌的中部，稳固定位激光探针的尖端。 非缺血四肢和缺血四肢的读数以血流量每100g组织每分钟的血流量(ml)记录。每日血流 量测量在首次注射亚硝酸盐或硝酸盐的24小时之前进行，以获得灌流中典型的稳态变化。 血流量通过将缺血肢体血流量除以非缺血肢体血流量再乘以100，测定组织血流量百分数 的变化。在单独的系列实验中，在亚硝酸盐或硝酸盐给药30秒内测量血流量以评价血流量 的突然变化。血管密度测量。按照Senthilkumar，A.，Smith, R. D.，Khitha, J.，Arora, N.， Veerareddy, S. . Langston, ff. , Chidlow, J. H. , Jr. , Barlow, S. C. , Teng, X. , Patel, R. P., 等 2007. Arterioscler Thromb Vase Biol 27 :1947_1954 中所描述的，对肌肉组织的血管 密度进行测定。简言之，将缺血(左)和非缺血(右)组织分开，埋入OCT冷冻介质中，冷 冻，制成3微米切片。将切片置于-20°C 95%乙醇冰醋酸中1小时，进行固定。将切 片置于4°C含5%马血清的PBS中包埋过夜。向其中加入1 200稀释(在含5%马血清 的PBS中)的抗⑶31(PECAM-I)，37°C孵育1小时。切片用1 %马血清/PBS洗3次，向其中 加入1 250稀释(在含5%马血清的PBS中)的与Cy3共轭连接的抗鼠二抗，室温孵育1 小时。清洗切片并用Vectashield DAPI(4'，6_ 二脒_2'-苯基吲哚氟安定)核复染剂安装切片。每个肌肉样本需4张染色切片，每张切片至少需要4个区。用Hamamatsu数码相 机拍照，使用Nikon TE-2000荧光显微镜(Nikon公司，日本)分别对CD31和DAPI染色用 TRITC 和 DAPI 光照，200 倍放大。用简易 PCI 6. 5 版软件(Compix Inc，Sewickly，PA)测定 每张切片的⑶31和DAPI染色面积。测定血管密度用⑶31像素密度除以DAPI像素密度之 间的比。累积图像采集和血管密度数据，以双盲形式分析和计算，然后，确定的数据用于统 计学分析并生成图表。 亚硝酸盐测定,NO代谢，组织cGMP和eNOS蛋白水平。按照Lang，J. D.，Jr.，Teng, X. , Chumley, P. , Crawford, J. H. , Isbell, Τ. S. , Chacko, B. K. , Liu, Y. , Jhala, N. , Crowe, D. R.，Smith, Α. B.，等 2007. JClin Invest. 117 :2583_2591，亚硝酸盐和组织 NO 代谢水平， 使用化学发光技术测定组织(亚硝基硫醇、C-或N-亚硝基化合物或亚硝酰基铁蛋白，其共 同指 SN0+XN0)。用 Cayman Chemical (Ann Arbor, MI)的 cGMP ELISA，按照操作手册，测定 腓肠肌cGMP水平。注射PBS或亚硝酸钠2分钟后采样。通过Western印迹分析测定后肢的 总eNOS蛋白水平。 统计分析。用Students T-test (未配对)，在亚硝酸钠或硝酸钠vsPBS对照组之 间，最小的P <0. 05对于显著性是必要的，分析血流量、血管密度、内皮细胞增殖、组织亚 硝酸盐和NO代谢以及cGMP数据。将实验组的血液中亚硝酸盐数据和血流量迅速变化分 别与PBS对照组相比较，以及O天时间点，用Bonferroni的试验后单向方差分析(one-way AN0VA)，最小的P < 0. 05对于显著性是必要的。统计数据用GraphPad Prism 4. O软件处 理。实验中所用小鼠的数量如下述实施例所示。实施例2慢性亚硝酸钠治疗增加缺血组织血流量我们测定如实施例1中描述的小鼠后肢缺血模型中亚硝酸钠的范围对缺血组织 血流量的影响。通过腹腔注射给药亚硝酸钠，每天2次，剂量范围8. 25-3，300 μ g/kg ；每个 治疗组15只小鼠。按照实施例1中的激光多普勒法测定血流量。通过测定缺血肢体血流 量除以各自对应的非缺血肢体血流量，计算每只动物的百分数变化，来测定缺血组织灌流 的变化。如图IA所示，结扎后第3天，8. 25、16. 5、165和3，300 μ g/kg剂量的亚硝酸盐增加 了缺血后肢的血流量百分数，逐渐增加到第7天。与较高和较低剂量相比，165 μ g/kg的亚 硝酸钠短时效力最佳。接着，我们检测是否通过一氧化氮(NO)依赖机制，亚硝酸钠增加缺 血组织血流量。如图IB所示，NO清除剂、羧基PTIO (2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪 唑啉-1-烃氧基-3-氧化物)，以每日剂量lmg/kg施用，可显著减弱亚硝酸钠恢复缺血四肢 血流量的能力。如图IC所示，注射165 μ g/kg亚硝酸钠可24小时增加缺血后肢血流量；注 射PBS 24小时后，没有观察到缺血后肢血流量的变化(图1D)。重要地，如图2A和图2B所 示，PBS和亚硝酸钠都没有改变非缺血后肢血流量；每个治疗组使用10只小鼠。如图3所 示，当用硝酸钠代替亚硝酸钠，在第5天和第7天硝酸钠最低剂量(8. 25 μ g/kg)能增加缺 血四肢血流量。实施例3慢性亚硝酸钠治疗选择性增强缺血引起的血管发生我们接着检测慢性亚硝酸钠治疗对缺血组织血管密度的影响。根据实施例1的方 法测定血管密度。图4A和4B表示在第7天，分别用硝酸钠和亚硝酸钠(165 μ g/kg)处理 动物，内皮细胞CD31染成红色，用DAPI核复染法将缺血腓肠肌染成蓝色。接受亚硝酸钠的 小鼠与接受PBS或硝酸钠的对照相比，其缺血组织中CD31内皮细胞染色更丰富。血管密度的定量分析表明，与PBS或硝酸钠对照治疗相比，在第3天和第7天亚硝酸钠(165 μ g/kg) 治疗显著增加血管密度(图4C和4D)；每个治疗组使用10只小鼠。与组织血流量变化一 致，在第3天和第7天同时施以cPTIO共同治疗，阻碍了亚硝酸盐对缺血后肢血管发生的增 强(图4E和4F)。与缺血组织血流量变化的百分数测定一致，与低剂量(165 μ g/kg)亚硝 酸盐相比，高剂量亚硝酸钠(3，300 μ g/kg)对增加缺血组织血管密度的效力较弱(图5A和 5B)。重要地，亚硝酸钠不显著改变非缺血组织血管密度，强调了慢性亚硝酸盐治疗的位点 特异性(图5C)；每组使用10只小鼠。实施例4慢性亚硝酸钠治疗加强缺血内皮细胞增殖用实施例1的后肢缺血模型分析亚硝酸钠对缺血腓肠肌内皮细胞增殖的影响。图 6A和6B表示从第3天，分别以硝酸钠或亚硝酸钠(165 μ g/kg)治疗，通过Ki67染色(绿) 缺血组织，连同内皮细胞CD31标记(红)和DAPI核染色(蓝)测定内皮细胞增殖的量。图 6C定量了在第3天，亚硝酸钠或硝酸钠用DAPI核复染法共区域化的Ki67量，表明亚硝酸钠 显著增强了缺血组织的Ki67核定位，而对于非缺血组织则无变化，Ki67核定位的增强受到 羧基PTIO的抑制。而且，亚硝酸钠显著增强了缺血组织的Ki67至⑶31共区域化，这种共 区域化的增强受到cPTIO的抑制(图6D)；每个治疗组使用10只小鼠。实施例5慢性亚硝酸盐给药对血液和组织亚硝酸盐水平的影响按照实施例1的方法分析硝酸盐治疗的动物和对照动物的血液和组织中的亚硝 酸盐水平。如图7A所示，用165yg/kg亚硝酸钠治疗一段时间后，血液中的亚硝酸盐水平 显著降低，而用PBS治疗变化小。图7B和7C分别表示用亚硝酸盐治疗的第3天和第7天 组织中的亚硝酸盐水平；每个治疗组使用10只小鼠。在第3天，亚硝酸盐治疗显著增加缺 血组织中的亚硝酸盐水平，而非缺血组织则无变化(图7B)。在第7天，组织亚硝酸盐水平 在以亚硝酸盐治疗的动物和以PBS对照治疗的动物之间差异不显著(图7C)。综上，这些数 据表明与非缺血组织相比，慢性亚硝酸钠治疗导致缺血组织中的亚硝酸盐早期优先累积。 对应于慢性亚硝酸钠治疗而降低的血液亚硝酸盐水平，促使我们去测定用PBS或165 μ g/ kg亚硝酸钠治疗的后肢肌肉组织中总eNOS蛋白水平。图7D表示在第3天，慢性亚硝酸钠 治疗显著降低缺血后肢组织的eNOS蛋白表达，而不改变非缺血后肢组织的eNOS蛋白表达。 在第7天，如图7E所示，亚硝酸钠降低非缺血组织的eNOS蛋白表达，而对缺血组织无影响； 如图7所示，每个实验组使用3只小鼠。这些数据表明，对应于慢性亚硝酸盐治疗而降低的 eNOS蛋白表达可能导致血液中的亚硝酸盐水平降低。实施例6慢性亚硝酸钠疗法期间NO组织代谢物和组织cGMP根据实施例1的方法测定了亚硝酸盐对NO代谢物、SNO和XNO的水平的治疗效果。 每个治疗组20只小鼠。165 μ g/kg亚硝酸钠-治疗的动物或PBS-治疗的对照组在第3天 和第7天的组织SN0+XN0水平分别见图8A和8B。第3天时，无论是亚硝酸钠(165 μ g/kg) 还是PBS都没有明显改变组织SN0+XN0水平。然而，与PBS相比，第7天时，亚硝酸盐治疗 能显著增加缺血性组织中SN0+XN0的水平。这些数据显示亚硝酸盐对组织亚硝酸硫醇、C-/ N-化合物和亚硝酸铁蛋白治疗的延迟效应，同时证明了在缺血性组织中优先产生含有中间 体的N0。我们还检查了慢性亚硝酸钠疗法在亚硝酸钠-治疗的动物中是否能选择性地增 加cGMP水平。分别如图8C和8D所示，在第3天和第7天，无论是165 μ g/kg亚硝酸钠还 是PBS都没有明显改变组织cGMP水平。
16
实施例7慢性亚硝酸钠疗法增强动脉形成和缺血组织血流量的迅速变化在慢性缺血中单独刺激血管生成对于恢复组织灌注通常作用不大。通过补充和小 动脉分化来增加动脉形成对于供应新形成的微血管很重要。此外，由于血流增加引起血管 切应力迅速增加是动脉形成的关键调节剂。按照实施例1的方法，我们检查了 165yg/kg 亚硝酸钠对缺血性组织和非缺血组织灌注迅速变化(30秒)的效果。每个治疗组10只小 鼠。如图9A所示，在结扎后第1天给药30秒内，165 μ g/kg亚硝酸钠能使缺血性组织的血 流量明显增强92，3士 18%。注射亚硝酸钠后，血流量增加的时间持续超过IOmin (未示出数 据)。亚硝酸盐能够引起血流量迅速大幅增加的能力与组织缺血时间成反比，因为第3天和 第7天在迅速血流量变化中，动物接受慢性亚硝酸盐治疗呈较小，但仍然显著的增加。这一 观察结果可能是因为产生了明显的血管生成活性，从而削弱了组织缺血程度。在迅速组织 血流量中亚硝酸钠_依赖性变化涉及N0，因为如图9b所示，在早期的时间点cPTIO明显抑 制了这种响应。为了进一步评估动脉形成的活性，我们在深股的远端和膝盖近端对后腿进行结 扎，这样更容易区分动脉供应的变化。如图9C所示，与PBS治疗的对照组动物的组织相比， 亚硝酸钠-治疗的动物组织中动脉分支点的数量明显更多。按照实施例1的方法制作动脉 铸型。图9D显示亚硝酸钠-治疗缺血后肢第7天的动脉铸型的一个代表性示例；图9E显 示PBS-治疗缺血后肢第7天的动脉铸型。可观察到许多侧支血管在整个组织中对亚硝酸 盐治疗的响应，表明动脉形成增强。相反，PBS的治疗没有提高动脉灌注，并且观察到最小 的侧支血管。总之，这些数据表明，慢性亚硝酸盐治疗在缺血组织中能增强动脉形成活性。 实施例8单次腹腔注射亚硝酸钠对缺血后肢血流量的影响按照实施例1的方法，对C57BL/6J小鼠(每个治疗组3只)左后肢进行永久性股 动脉结扎。结扎后单次腹腔注射PBS或亚硝酸钠(165yg/kg)45min。7天内每天监测血流 恢复情况，评价单次注射疗法的疗效。如图10所示，单次腹腔注射亚硝酸钠没有恢复缺血 后肢血流量。χ-轴上的“第0天前”是指进行结扎前结扎当天的血流量；χ-轴上的“第0天 后”是指进行结扎后结扎当天的血流量。实施例9延迟的亚硝酸钠疗法对缺血性后肢血流量的影响我们还评价了延迟的慢性亚硝酸钠治疗对缺血性后肢血流量恢复的影响。按照实 施例1的方法，对C57BL/6J小鼠(每个治疗组6只)左后肢进行永久性股动脉结扎。结扎 后第5天的早上腹腔注射PBS或亚硝酸钠(165 μ g/kg)(每天2次)，在后续的研究中每天 注射。按照实施例1的方法采用所述的深部组织穿透激光多普勒在整个研究中监测血流量 的恢复。如图11所示，延迟的亚硝酸盐疗法能恢复缺血性后肢血流量。χ-轴上的“第0天 前”是指进行结扎前结扎当天的血流量；χ-轴上的“第0天后”是指进行结扎后结扎当天的 血流量。实施例10在糖尿病小鼠中亚硝酸钠治疗恢复缺血性后肢的血流量我们评价了糖尿病小鼠中亚硝酸钠对缺血性后肢血流量的治疗效果。按照实施例 1和2的方法，对Db/Db糖尿病小鼠(每个治疗组5只)左后肢进行永久性股动脉结扎，不同 之处在于用2%可吸入的异氟烷麻醉小鼠。结扎后开始腹腔注射PBS或亚硝酸钠(165 μ g/ kg)(每天2次)，在后续的研究中每天注射。按照实施例1的方法采用所述的深部组织穿 透激光多普勒在整个研究中监测血流量的恢复。如图13所示，亚硝酸钠治疗能恢复糖尿病小鼠缺血性后肢的血流量。在所有时间点，分析亚硝酸盐-治疗的动物缺血性后肢的血流 量都显著高于PBS-治疗的对照组动物，研究结束后能达到结扎前的水平。实施例11连续亚硝酸钠疗法增强切除伤口愈合用4mm的打孔切片机开创全层切除伤口。采用实施例1的方法麻醉C57BL/6J小 鼠。在松弛的皮肤处打尖开创伤口，打半圆形活组织孔以获取一致的4mm直径的伤口(每 个治疗组4只)。开创伤口后立即腹腔注射PBS或亚硝酸钠(165yg/kg)(每天2次)，在 后续的研究中每天注射。接下来每天用数字卡尺测量伤口直径，用百分比标示其余的伤口 表面积。如图12所示，连续亚硝酸钠疗法能增强切除伤口的愈合。在研究的前六天，亚硝 酸钠-治疗的动物中其余伤口表面的百分比明显小于PBS-治疗的对照组动物，其余的表面 在余下的四天变得更小。本发明描述了大量的实施方案。然而，可以理解在不脱离本发明的精神和范围内， 可以对本发明进行不同的修改。因此，其他实施方案包含在所附的权利要求的范围内。
权利要求
治疗慢性组织缺血患病体的方法，该方法包括对患病体给药含有无机亚硝酸盐或其药用盐的药物组合物，其中亚硝酸盐的给药时间和给药量足以导致缺血组织血管生长。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括慢性组织缺血患病体的鉴定。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述患病体为哺乳动物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述患病体为人类。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述无机亚硝酸盐的药用盐为亚硝酸钠、亚硝酸 钾或亚硝酸钙。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚硝酸盐每日给药一次或多次。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述给药至少约2至10天。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述给药至少约2天；至少约3天；至少约4天； 至少约5天；至少约6天；或至少约7天。
9.根据权利要求15所述的方法，其中所述亚硝酸盐给药直至患病体的缺血症状得到 改善。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述缺血症状包括间歇性跛行、静息性跛行 (claudication during rest)、神经病变或受损组织伤口愈合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述硝酸盐的剂量为约1μ g/kg 约5000 μ g/kg ο
12.根据权利要求17所述的方法，其中所述剂量为约0.5 μ g/kg 约1000 μ g/kg。
13.根据权利要求17所述的方法，其中所述剂量为约0.5 μ g/kg 约500 μ g/kg ；约 0. 5 μ g/kg 约 250 μ g/kg ；约 0. 5 μ g/kg 约 100 μ g/kg ；或约 0. 5 μ g/kg 约 50 μ g/kg。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述剂量为约165μ g/kg;约16. 5 μ g/kg或约 8.25 μ g/kg。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚硝酸盐给药至患病体内的循环浓度为约 0. 0005 μ M 至约 0. 05 μ M0
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚硝酸盐给药至患病体内的循环浓度为约 0. 001 μ M 至约 0. 03 μ M 或约 0. 01 μ M 至约 0. 05 μ Μ。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚硝酸盐给药至患病体内的循环浓度为约 0. 03 μ M ；约 0. 003 μ M 或约 0. 0015 μ Μ。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述亚硝酸盐或其药用盐通过腹腔、静脉、皮下、 肌内、经皮、舌下或口服给药。
19.根据权利要求1所述的方法，其中血管生长的刺激产生于缺血组织而不产生于非 缺血组织。
20.根据权利要求1所述的方法，其中慢性缺血性疾病为外周动脉疾病、糖尿病、动脉 粥样硬化、间歇性跛行、严重肢体缺血性疾病、受损伤口愈合、中风、心肌梗死、发炎性肠道 疾病、骨折、骨感染或外周神经病变。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述糖尿病为I型或II型糖尿病。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺血组织包括骨骼肌、平滑肌、心肌、神经组 织、皮肤、间质组织、结缔组织、胃肠组织或骨。
23.根据权利要求1所述的方法，进一步包括施以抗缺血疗法。
24.根据权利要求1所述的方法，进一步包括施以抗菌剂、止痛剂、抗炎制剂、化疗制剂 或生长因子。
25.根据权利要求1所述的方法，其中所述缺血组织包括伤口。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述伤口包括皮肤、肌肉或结缔组织。
27.根据权利要求25所述的方法，其中所述伤口由外伤创伤、先天畸形或外科手术所致。
28.根据权利要求25所述的方法，其中所述亚硝酸盐给药直至伤口完全愈合。
29.治疗慢性组织缺血患病体的方法，该方法包括对患病体给药含有无机硝酸盐或 其药用盐的药物组合物，其中硝酸盐的给药时间和给药量足以导致缺血组织血管生长。
全文摘要
本发明涉及一种治疗慢性组织缺血患病体的方法，该方法包括对患病体给药含有无机亚硝酸盐或其药用盐的药物组合物，其中亚硝酸盐的给药时间和给药量足以导致缺血组织血管生长。
文档编号A61K33/06GK101939014SQ200880116483
公开日2011年1月5日 申请日期2008年11月17日 优先权日2007年11月15日
发明者克里斯托弗·凯维尔, 大卫·勒费, 拉凯什·帕特尔 申请人:路易斯安那州立大学;Uab研究基金会