专利名称:一种直接鉴定高等植物dna同源重组的方法
技术领域：
本发明涉及一种植物遗传性状的分析方法，尤其涉及一种直接鉴定高等植物DNA同源重组的方法，属于植物遗传学领域。
背景技术：
减数分裂是有性生殖物种世代交替的转折点，而减数分裂过程中同源染色体间发生重组使生殖细胞的遗传基础多样化从而加速了生物的进化。虽然人们对于同源重组进行了大量研究，其仍然是所知甚少的遗传学现象之一。从上世纪60年代开始，人们对同源重组机制在原核生物和真菌系统中进行了系统的研究，并相继提出了多种同源重组模型(Holliday R. A mechanism for gene conversion in fung1. Genet. Res, 1964,5 :282-304 ；Meselson M S, Radding C M. A general model of genetic recombination. Proc. Natl.Acad. Sc1. USA,1975, 72 :358-361 ；Szostak J W,Orr-weaver T L,Rothstein R J，et al.,The double-strand break-repair model for recombination. Cell,1983,33 :25-35)。目前得到广泛认可的同源重组模型为Szostak等(1983)提出的双链断裂模型，其大致可以概括为DNA链发生双链断裂；单链DNA末端侵入形成hoiIiday连接体；通过分支移动产生异源双链DNA ；Holliday中间体切开并对错配碱基进行修复。并通过电镜证实holliday连接体的存在(Potter H, Dressier D. On the mechanism of genetic recombination electron microscopic observation intermediates. Proc. Natl. Acad. Sc1. USA,1976,73:3000-3004)。目前多数遗传重组现象的研究集中在原核及真菌生物中(PadmoreR, Cao L, Kleckner N. Temporal comparison of recombination and synaptonemalcomplex formation during meiosis in S.cerevisiae. Cell,1991,66 :1239-1256 ；Goldway M, Sherman A, Zenvirth D, Arbel T, Simchen G.A short chromosomal regionwith major roles in yeast chromosome III meiotic disjunction, recombinationand double strand breaks. Genetics, 1993,133 :159-169 ；Jessop L, Allers T, LichtenM.1nfrequent co-conversion of markers flanking a meiotic recombinationinitiation site in Saccharomyces cerevisiae. Genetics, 2005,169 :1353-1367)。对于高等植物，由于缺乏合适的研究材料及方法，迄今尚未见从DNA水平直接观测高等植物同源重组的方法以及判断是否有异源双链DNA形成的相关证据。
就植物而言，植物孢母细胞减数分裂完成后，其大、小孢子发育都需通过一次以上的有丝分裂才能形成卵细胞或精子，而有丝分裂具有使异源双链DNA“纯合化”的作用，以至无法直接检测异源双链DNA的存在。这主要是由于在大、小孢子发育过程中，通过Ho 11 idayjunction结构产生的异源双链DNA经有丝分裂的DNA复制而形成两条DNA链“纯合化”的姊妹染色体，并经过有丝分裂后期染色体分离(减数后分离)，两条姊妹染色体分别进入不同的配子。由于同源重组的存在，这两条姊妹染色体遗传基础并不相同，但此后不论经过多少次有丝分裂，但每个单倍性配子只有DNA链已经完全一致的姊妹染色体中的一条。这样，在正常二倍体杂种后代中，只能通过两个或多个连锁位点或性状分析判断是否发生遗传重组，而仅针对一对性状或一个位点，则难以辨别是否发生同源重组，更无法直接判别异源双链DNA的形成与否。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有的植物同源重组的检测方法对于一对性状或一个位点难以鉴别是否发生同源重组的问题，提供一种新的直接鉴定高等植物DNA同源重组的方法，该方法可以通过检测是否有异源双链DNA形成从而判别该位点是否发生同源重组以及重组率的大小。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的
一种直接鉴定高等植物DNA同源重组的方法，包括以下步骤
(I)以待鉴定的植物为母本，施加理化处理诱导胚囊染色体加倍获得两条姊妹染色体共存于同一配子的2η雌配子；(2)用2η雌配子与父本植物的雄配子杂交获得杂种三倍体材料；(2)筛选获得父母本有差异且母本杂合的共显性分子标记引物；(3)提取母本以及三倍体材料的DNA为扩增模板，以筛选的共显性分子标记引物作为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；(4)将扩增产物分别进行毛细管电泳分析如果杂种三倍体材料的扩增产物中只出现母本的共显性分子标记的其中之一，表明在该分子标记相关位点未发生同源重组；如果杂种三倍体材料的扩增产物中出现了母本的全部遗传信息，则说明待鉴定的母本植物在该分子标记相关位点发生了同源重组并形成异源双链DNA。
只有在适宜的大孢子发育时期进行理化处理才能获得两条姊妹染色体共存于同一配子的2η雌配子。本发明通过进一步的试验发现，只有在胚囊发育的第一次有丝分裂时期(即单核胚囊时期向二核胚囊发育之间)对胚囊施加理化处理才能获得两条姊妹染色体共存于同一配子的2η雌配子，从而阻止同源重组形成的异源双链DNA减数后分离，并通过与一父本杂交而将相关信息固定于三倍体内，是本发明方法得以成功检测DNA同源重组的基础。
公开号为CN 101147465Α的中国发明专利公开了一种诱导植物胚囊染色体加倍选育三倍体的方法，该申请所要解决的技术问题是植物三倍体诱导时机和效率问题，该申请披露了诱导植物胚囊染色体加倍的有效时期为四核胚囊时期。本发明通过进一步的试验发现，在四核胚囊时期对其施加理化处理并不能阻止同源重组形成的异源双链DNA减数后分离，只有在单核胚囊向二核胚囊发育时施加理化处理诱导胚囊第一次有丝分裂染色体加倍，才能保证使异源双链DNA经过复制形成的两条姊妹染色体共存于同一个2η配子中。
所述的理化处理可以是诱导植物多倍体的各种常规手段，例如可以用秋水仙碱溶液进行浸泡处理，秋水仙碱溶液的浓度可以为O. 3-0. 5%，处理的时间可以是6-48小时等；此外，也可以采用高温对胚囊进行处理，所述的高温可以是38-44°C等，所述的处理时间可以是1-8小时等；总之，这些诱导植物多倍体的各种常规手段均为本领域技术人员所通晓。
分子标记是以DNA分子多态性为基础的遗传标记，其中包括可检测植物因同源重组形成的异源双链的共显性分子标记，如SSR分子标记。采用共显性分子标记(如SSR)分析胚囊染色体加倍来源的三倍体后代的遗传信息，就可以通过分析是否有异源双链DNA形成而检测同源重组发生情况。根据所要检测的母本样品，再选择与母本杂交的适宜父本，通过相关数据库结合毛细管电泳筛选就可得到对于父母本有差异且母本杂合的共显性分子标记引物。
以待鉴定的母本植物为哲引3号杨(Populus pseudo-simonii XP.nigra ‘Zheyin3#’ )为例,本发明选定北京杨’(P. Xbeijingensis)为与哲引3号杨进行杂交的父本。本发明通过杨树 SSR 数据(http://www. ornl. gov/sci/ipgc/ssr_resource.htm)并结合毛细管电泳反复筛选得到对于父母本有差异且母本杂合的三对SSR引物，具体序列见表I。
本发明利用源于胚囊染色体加倍获得的特殊三倍体群体以及筛选出的共显性分·子标记，通过分析是否存在异源双链DNA而判别相关DNA区段是否具有遗传重组，统计胚囊染色体加倍获得的杂种三倍体群体中显示该植物所有遗传信息的植株数，从而较为方便地计算出某杂交组合中某一基因位点实际发生的同源重组率。本发明方法对于植物遗传分析、分子标记技术方法判别以及指导三倍体育种等具有重要的理论和应用价值。
图1引物GCPM_2570扩增胚囊染色体加倍来源的三倍体株系及其亲本后的毛细管电泳图谱。
图2引物PMGC_93扩增胚囊染色体加倍来源的三倍体株系及其亲本的毛细管电泳图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1检测‘哲引3号杨’在孢母细胞减数分裂过程中的同源重组情况试验
一、试验材料
待检测母本材料‘哲引3 号杨’(P. pseudo-simonii XP. nigra ‘Zheyin3#’)；
父本材料‘北京杨’(P.Xbeijingensis)。
二、试验方法及检测结果
当‘哲引3号杨’的胚囊发育阶段处于单核胚囊时期向二核胚囊发育之间对胚囊施加理化处理(用0. 3-0. 5%的秋水仙碱溶液浸泡雌花序6-48小时)，获得两条姊妹染色体共存于同一配子的2n雌配子；将2n雌配子与‘北京杨’ (P. Xbeijingensis)的雄配子进行杂交获得三倍体植株；
依据杨树SSR 数据库(http: //www. ornl. gov/sci/ipgc/ssr_resource. htm),筛选对于‘哲引3号杨’及‘北京杨’有差异，且‘哲引3号杨’为杂合的三对共显性SSR引物，分别为 GCPM_2570、PMGC_93 和 WPMS_16 (表 I)。
表I适于检测‘哲引3号杨’ X ‘北京杨’母本同源重组的SSR引物
权利要求
1.一种直接鉴定杨属植物DNA同源重组的方法，包括以下步骤 (1以待鉴定的杨属植物为母本，施加理化处理诱导胚囊染色体加倍获得两条姊妹染色体共存于同一配子的2η雌配子；(2)用2η雌配子与父本植物的雄配子杂交获得杂种三倍体材料；(2)筛选获得父母本有差异且母本杂合的共显性分子标记引物；(3)提取母本以及杂种三倍体材料的DNA为扩增模板，以筛选的共显性分子标记引物作为PCR扩增引物，分别进行PCR扩增；(4)将扩增产物分别进行毛细管电泳分析如果杂种三倍体材料的扩增产物中只出现母本的共显性分子标记的其中之一，表明在该分子标记相关位点未发生同源重组；如果杂种三倍体材料的扩增产物中出现了母本的全部遗传信息，则说明待鉴定的母本植物在该分子标记相关位点发生了同源重组并形成异源双链DNA，其中，在母本大孢子发育过程中处于单核胚囊时期向二核胚囊发育之间，即胚囊第一次有丝分裂时期，施加所述的理化处理。
2.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的母本是‘哲引3号杨’(P. pseudo-simonii XP. nigra ‘Zheyin3#’);所述的父本是‘北京杨’ (P. Xbei jingensis)。
3.按照权利要求
1或2所述的方法，其特征在于，所述的理化处理包括用秋水仙碱溶液进行浸泡处理或用高温进行诱导。
4.按照权利要求
3所述的方法，其特征在于所述的秋水仙碱溶液的浓度为O.3-0. 5%,所述的处理时间是6-48小时；所述的高温温度是38-44°C，所述的处理时间是1_8小时。
5.按照权利要求
1所述的方法，其特征在于所述的共显性分子标记引物是SSR引物。
6.按照权利要求
1或5所述的方法，其特征在于所述的共显性分子标记引物选自以下3组引物中的任意一组(1)由SEQ ID No.1和SEQ ID No. 2组成的引物对；(2)由SEQID No. 3和SEQ ID No. 4组成的引物对；(3)由SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6组成的引物对。
专利摘要
本发明公开了一种直接鉴定高等植物DNA同源重组的方法，包括(1)以待鉴定的植物为母本，诱导胚囊染色体加倍获得2n雌配子；(2)2n雌配子与父本植物雄配子杂交获得杂种三倍体；(2)筛选获得共显性分子标记引物；(3)以筛选的共显性分子标记引物进行PCR扩增；(4)扩增产物进行毛细管电泳分析如果三倍体扩增产物中只出现母本的共显性分子标记之一，表明在该分子标记相关位点未发生同源重组；如果三倍体扩增产物中出现了母本的全部遗传信息，表明待鉴定母本植物在该分子标记相关位点发生了同源重组并形成异源双链DNA。本发明方法对于植物遗传分析、分子标记技术方法判别以及指导三倍体育种等具有重要的理论和应用价值。
文档编号C12Q1/68GKCN102392074 B发布类型授权 专利申请号CN 201110363048
公开日2013年4月10日 申请日期2011年11月16日
发明者康向阳, 董春波, 索玉静, 王君, 张平冬 申请人:北京林业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan