专利名称：：在真核细胞中同源重组的改进的方法
技术领域：
：本发明涉及将核酸有效和定向整合进细胞染色体中的改进的方法。
发明内容不同的细胞类型被用于不同的工业目的。例如，哺乳动物细胞系被用于抗体生产；真菌细胞是生产多肽和次级代谢产物的优选生物；细菌细胞被优选用于小代谢产物和抗生素生产；植物细胞被优选用于口味和香味化合物。重组技术被广泛地用于细胞和/或方法的生产力的最优化。这可包括大量选择，包括但不限于感兴趣的基因的过表达、竞争途径的删除或灭活、改变酶的区室化、增加蛋白质或代谢产物分泌、提高细胞器官含量等等(见例如KhetanandHu(1999)In:ManualofIndustrialMicrobiologyBiotechnology,Eds.DemainandDavies,pg.717-724)。为了使用这些方法获得成功，关键是重组构建体被稳定维持在生产宿主中。这可以是作为附加型载体(episomalvector)的部分或通过整合进入基因组中。后一种情形是优选的解决方法，因为这是最稳定的情形。进一步更优选的是在预定的、正确的基因组基因座处整合。因为在若干种物种中，特别是大部分真核生物中，DNA进入基因组的整合以高频率随机发生，通过重组DNA技术构建工业生产细胞常引起不想要的多核苷酸整合，导致随机的基因组修饰。另外，这常导致多重整合和由此导致的不稳定情形。这种不受控制的、多核苷酸的"随机多重整合"是可能危险的方法，其能够引起不想要的宿主基因组修饰，导致降低的生产力。因此，高度期望能够通过感兴趣的多核苷酸的高效正确的基因组靶向构建工业生产细胞系。另外，既然可获得越来越大量生物的完整基因组序列，那么构建全基因组过表达和删除文库的机会是开放的。有效构建这类文库的重要要求是所考虑的生物能够被有效地转化，感兴趣的多核苷酸以高频率被正确靶向，将核酸正确定向整合入基因组所需的同源性相对较短。文献描述了若干种方法降低细胞中该不期望的、随机的多核苷酸整合的频率。真核细胞具有至少两种独立的将核酸(当然尤其是DNA)整合进宿主基因组中的途径(一个通过同源重组，一个通过非同源重组)。酵母5Vzcc/arcw^c^cerevWae是对同源重组(HR)具有偏好的生物。该生物的同源重组对非同源重组的比例(HR/NHR)可从约0.9到1变化。与5"acc/^ram少c^ce"v&'ae相反，大部分高级真核细胞(包括真菌、植物和哺乳动物)对非同源重组(NHR)具有偏好。其中，HR/NHR比例范围在0.0001和0.5之间。在这类生物中，定向整合频率相当低。要被整合进这类生物基因组中的多核苷酸序列侧翼的同源区的长度也必须相对较长，例如至少2,000碱基对用于断裂单个基因。这类侧翼区的必要性代表了克隆包含所述多核苷酸的DNA构建体和用该构建体转化生物时的沉重负担。另外，位于这些侧翼区内的相邻基因在转化后的重组过程期间能够被轻易地破坏，从而引起不想要的和预料外的副作用。最近，若干个公开文件描述了非常有效率的非同源末端连接(NHEJ)途径，该途径负责细胞中多核苷酸的随机整合，这是改进HR/NHR比例的一种方法(参阅例如Ninomiya"a/.,2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:12248-12253;Krappmann&a/"2006,Eukaryot.Cell.5:212-215)。这可能是一种非常有力的方法，其导致基因靶向效力的非常显著的提高(甚至高达60倍)。然而，该方法仍然有一些缺点。首先，该方法不是对所有物种都适用的。例如，己经分离了A"70(NHEJ途径的组件之一)缺陷的哺乳动物细胞(Pierce"a/"2001,GenesandDevelopment15:3237-3242)。这些突变体具有高出六倍的同源性指导的修复频率，但是同源性指导的定向整合效率没有提高。其次，尽管在若干真菌物种中其对NHR/HR比例具有积极作用(参f阅伊」乡口Ninomiya"a/.,2004;KrappmannWa/.，2006)，在大咅P^^青7兄下其被限制为60-90%的正确基因靶向。这对于使用一个或若干个基因而言是可接受的改进，但是对于高通量全基因组分析和/或基因功能的修饰而言则不是。在获得100%正确转化体的个体情况下涉及长的侧翼区，这也不适合高通量全基因组分析和/或基因功能的修饰。第三，为了获得具有改进的HR/NHR比例的这类菌株，需要修饰宿主细胞的重组机制，这可能导致不想要的副作用(参阅例如Celli"a/.,NatCellBiol(2006),8:885-8卯)。也可以通过过表达HR途径的组分改进HR/NHR比例。该方法的一个例子由Shakedaa/.(2005,ProcNatl.Acad.Sci.USA.102:12265-12269)给出。他们显示通过过表达酵母RAD54可以将HR频率提高100倍。该结果仍然仅得到1-10%的正确突变体，使得该方法不适用于高通量全基因组分析和/或基因功能修饰。另一种方法是所谓的二分基因靶向方法(bipartitegene-targetingmethod)(Nielsen&a/.,2006，43:54-64)。该方法使用选择标记物的两个重叠的无功能部分。在正确的同源重组后，选择标记物成为有功能的。他们用最有效的同源重组体系J^ergz7/imV/w/a似在真菌物种中测试了该方法，在WT细胞中具有24%的正确基因靶向。该方法导致超过标准方法2.5倍的提高，但是即便是在mVMa朋中，获得的转化体仅有62%是正确的。还使用相当长的侧翼区来获得正确的靶向。这对于使用一个或若干个基因而言是可接收的改进，但是对高通量全基因组分析和/或基因功能修饰而言不是。Liu"a/.(2001，J.Bacteriol.,183:1765-1772)描述了另一种方法，该方法使用第二选择标记物来富集Aremom'wmcAo^ogemwi中具有靶基因破坏的转化体。该方法导致超过标准方法10倍的改进，但是获得的转化体仍然仅8%是正确的。Kang和Khang(US2005/0181509)还描述了另一种方法。这是Liu"a/.(2001)方法的变更。他们应用负选择标记物即单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVtk)基因作为第二选择标记物。如果选择步骤能正确工作，则基因组中随机整合的多核苷酸会杀死细胞，因为/^K汰基因会将琼脂平板中的5-氟-2、-脱氧尿苷转化为毒性化合物。该方法也提高了细胞中正确靶向的频率，但是其被限制为50%的细胞。更重要的是获得了非常高的假阳性百分比(9-100%)，这使得该方法不适合高通量全基因组分析和/或基因功能的修饰。Kang禾QKhang(US2005/0181509)也描述了白喉毒素A(t/")基因的测试。该基因已经在植物和哺乳动物细胞中被用作第二标记物，将正确基因靶向的频率提高至1-2%(参阅例如Terada"。/.，2004,PlantCellRep.22:653-659;YagiWa/.,1993,Anal.Biochem.214:77-86)。然而，他们不能够使该标记物在真菌物种中有功能。出人意料的是，我们发现通过将提高HR/NHR比例的方法与使用第二可选择标记物的方法组合起来，能够在通常具有NHR偏好的细胞中获得100%的正确基因靶向。另外，我们惊人地发现白喉毒素AW")基因在丝状真菌中起作用，并可在真菌物种中被有效地用作第二(和致死的)标记物，以富集其中发生了正确基因靶向事件的细胞。本发明公开了构建真核细胞的方法，所述真核细胞中染色体DNA序列中的靶序列被置换为想要的置换序列，所述方法包括修饰对NHR具有偏好的亲本真核细胞，提供与亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞，提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置换序列，该置换序列5'和3'侧的侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表达盒，所述表达盒包含编码选择标记物的基因和与之可操作地连接的、在真核细胞中有功能的调节序列；用所述DNA分子转化经修饰的真核细胞；培养细胞，获得经转化的后代细胞，所述后代细胞染色体中插入了所述DNA分子，通过表达选择标记物，取消选定其中DNA分子通过非同源重组事件被插入染色体中的后代细胞；和获得其中染色体DNA序列中的靶序列被想要的置换序列置换的细胞。具有NHR偏好的亲本真核细胞可以是具有下述HR/NHR比例的任何真核细胞，所述比例《.5，优选地a.2，更优选地《.1，最优选地^.05。精确的比例可在一个物种中不同的基因座之间变化。测定上述比例的合适基因组为w'oD基因座(及其在所有物种中的同源物)和Kt/70基因座(及其在所有物种中的同源物)。通过分析一组转化体测定HR/NHR比例，以确定转化体的哪部分具有正确的基因靶向(HR)和转化体的哪部分具有不正确的重组(NHR)。有若干种获得这些数据的方法(i)表型分析；如果同源的靶基因座具有易于检测的表型，如m'aD基因座(如果被删除，则细胞成为抗氯酸盐的)，则可在合适的识别培养基(例如含有或不含有氯酸盐)上测试所有的转化体，以获得HR和NHR事件的频率(ii)PCR分析；可对分离自转化体的DNA进行PCR分析，所述PCR分析使用在侧翼序列外退火的一个引物和在置换序列内退火的一个引物。如果获得了预期大小的扩增，则证实了HR事件。如果未获得片段或获得错误大小的片段，则可进行对照PCR，所述对照PCR使用的两个引物均与待置换的靶基因座退火。如果获得了预期大小的扩增，则证实了NHR事件。(iii)Southem分析；用限制性酶消化分离自转化体的DNA，所述分析产生取决于HR或NHR事件或野生型状态的不同杂交模式。快速扫描许多转化体的优选方法是PCR。与亲本细胞相比具有提高的NR/NHR比例的真核宿主细胞可以通过修饰亲本真核细胞获得，所述修饰通过提高HR途径的效率和/或通过降低NHR途径的效率。从而将HR/NHR比例提高了至少2倍，优选地至少4倍，更优选地至少10倍。在本发明的上下文中，HR途径被定义为涉及控制多核苷酸定向整合进宿主基因组中的基因和元件，所述多核苷酸与宿主基因组的某个预定位点具有某种同源性，所述位点是整合靶向的位点。NHR途径被定义为涉及控制多核苷酸整合进宿主基因组中的所有基因和元件，与多核苷酸与宿主基因组序列的同源性程度无关。提高HR途径的效率和/或降低NHR途径的效率可以通过上调和/或下调HR和/或NHR中涉及的基因表达来完成。当获得的真核细胞中DNA序列的表达水平与亲本真核细胞中相同DNA序列的表达水平相比分别更高或更低、优选地更高或更低至少2倍、更优选地更高或更低至少4倍、进一步更优选地更高或更低至少IO倍时，该DNA序列(例如基因)的表达水平分别被上调或下调。被下调时，DNA序列的表达最优选为不可检测的。DNA序列表达水平的上调和/或下调可以如下监测通过Northern印迹(参阅例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,Sambrooka/.，NewYork:ColdSpringHarbourPress,1989)来定量测量存在于细胞中的相应的mRNA的量，和/或通过Western印迹来定量测量存在于细胞中相应的蛋白质的量。也可以通过"组学"技术如转录本组学(transcriptomics)和/或蛋白质组学测量mRNA和蛋白质水平。MRNA量中的差异也可以通过DNA阵歹U分析定量(Eisen,M.B.andBrown,P.O.DNAarraysforanalysisofgeneexpression.MethodsEnzymol.1999:303:179-205)。可以通过对亲本真核细胞进行重组体基因操作技术和/或经典诱变技术获得DNA序列表达水平的上调和/或下调。使用重组体基因操作技术上调DNA序列的表达优选地包括DNA序列的过表达。使用重组基因操作技术下调DNA序列的表达优选地包括DNA序列的灭活。可以通过将DNA序列置换为其无功能的变体或通过将DNA序列的部分或全部从基因组中删除来完成灭活。在一个实施方案中，DNA序列表达水平的上调和/或下调可以是可诱导的。这可以通过将DNA序列的内源调节区(即编码HR禾口/或NHR中涉及的组件的基因)置换为新的调节区来达成，所述新的调节区优选地包含可阻遏或可诱导的启动子，更优选地包含可以被(例如被葡萄糖阻遏、氨阻遏和/或pH阻遏)接通和/或切断的启动子。真菌葡萄糖-阻遏的启动子的例子是Pem'"7/〖Mwc/o^oge""附pcbAB启动子(Martin&fl/"1999,AntonieVanLeeuwenhoek.75:21-31)或A^erg/〃wm'ger葡萄糖淀粉酶启动子。可接通/切断的启动子的例子描述于以下的出版物中激活/阻遏二元体系允许芽殖酵母中紧密的四环素调节的基因表达(Belli"a/.，1998，Nucl.AcidRes.26:942-947);可被光接通的基因启动子体系(ShimizuWa/.,2002，NatBiotech.20:1041-1044)。随后可以通过监测相关DNA序列的表达水平选择合适的真核细胞。任选地，可以通过测量NHR禾n/或HR途径的效率和/或HR/NHR比例选择真核细胞。在本发明的上下文中，可以通过使用给定的同源性区将给定的多核苷酸序列定向整合进丝状真菌基因组中预定位点的效率来测量丝状真菌HR途径的效率。在本发明的上下文中，可以通过给定的多核苷酸序列在丝状真菌基因组中的非定向整合的效率来测量丝状真菌NHR途径的效率，而不考虑任何同源性区。在一个优选的实施方案中，与亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞可以通过降低NHR途径的效率获得。这可以通过下调涉及真核细胞中NHR的基因表达来达成，所述下调是与相同条件下测量的亲本真核细胞中所述基因的表达相比。根据一个优选的实施方案，与亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞在至少一个其内源基因上是有缺陷的，所述内源基因是涉及NHR途径的以下酵母基因的等价物尺t/70、《t/朋、iAD50、Mi￡/7、Xi52、丄/G4、丄/FA和S/i^(vandenBoschaa/.,2002，Biol.Chem.383:873-892andAllen"a/.,2003，Mol.CancerRes.1:913-920)。酵母和《C/^基因的等价物的一个例子分别是来自丝状真菌的基因或mi5/禾Q/^/S或mi52(见WO05095624和Ninomiya"a/.,2004)。酵母基因的哺乳动物等价物也是已知的，为Km70或《m朋基因(参阅例如Pierce"a/.,2001)。与上文提到的亲本细胞相比具有提高的NR/NHR比例的真核细胞优选地被用作使用下文描述的DNA分子转化的宿主细胞。DNA分子的第一DNA片段包含想要的置换序列，其5'和3'侧的侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列。本发明中使用术语"基本同源"表示置换序列侧翼的DNA序列与靶序列侧翼的染色体DNA序列在不多于3kb、优选地不多于2kb、更优选地不多于lkb、进一步更优选地不多于0.5kb、进一步更优选地不多于0.2kb、进一步更优选地不多于0.1kb、进一步更优选地不多于0.05kb、最优选地不多于0.03kb的区域上具有至少80%、优选地至少90%的同一性程度。因此需要的同一性程度可取决于基本同源的序列的长度。同源序列越短，同一性百分比越高。技术人员明白，为了通过双重交叉事件达成同源重组，这些侧翼序列需要存在于置换序列的两侧，并且需要与染色体中靶序列两侧的序列基本同源。置换序列的性质可取决于想要的用途而变化。置换序列可例如对真核细胞赋予可选择的表型。在该情况下，置换序列包含选择标记物。优选地，选择标记物是阳性选择标记物。优选的阳性选择标记物是am必基因。当需要灭活靶序列时，优选地将选择标记物用作置换序列。置换序列还可以是靶序列的经修饰的版本，例如提供感兴趣的序列的改变的调节或表达与原始基因产物相比具有改变的特性的经修饰的基因产物。置换序列还可使得感兴趣的序列的额外拷贝存在于真核细胞基因组中，以获得该感兴趣的基因的扩增。置换序列可以是与感兴趣的真核细胞同源或异源的序列。其可以从任何合适的来源获得或可以通过定制合成制备。靶序列可以是感兴趣的任何序列。例如，靶序列可以是要通过灭活或修饰该序列研究其功能的序列。靶序列也可以是需要其灭活、修饰或过表达来赋予真核细胞想要的表型的序列。第二DNA片段包含表达盒，所述表达盒提供选择标记物的表达。然而，仅仅非同源重组事件会导致选择标记物盒的真实整合。这意味着包含第一和第二DNA片段的DNA分子通过非同源重组进入真核细胞染色体中后会发生该选择标记物产物的表达。因此当DNA分子在与靶序列不同源的位点整合时，会发生表达盒的整合。可以取消选定(deselect)那些表达可选择标记物的细胞，即将其从经转化的后代细胞的种群中去除。在本发明的上下文中，编码选择标记物的第二DNA片段赋予受体真核细胞可检测的表型。可检测的表型选择标记物的例子是绿色荧光蛋白(eGFP)、黄色荧光蛋白(eYFP)、蓝绿色荧光蛋白(eCFP)、蓝色荧光蛋白(eBFP)、红色荧光蛋白(RFP)、/3-半乳糖苷酶(/3-gal)、葡萄糖苷酸酶(glucoronidase,GUS)。优选地，这类可检测的表型选择标记物是可选择的标记物。可选择的标记物的例子是，但不限于tn5-ble(腐草霉素R)、hyg(潮霉素R)、kan(卡那霉素R)、gen(G418R)、amdS(乙酰胺利用)。在一个优选的实施方案中，编码可检测表型选择标记物的第二DNA片段是致死的选择标记物，其赋予真核细胞致死的表型。这类致死表型可以通过多种方式达成。例如当致死选择标记物编码对细胞有毒的化合物(例如白喉毒素A或抑制型tRNA)时，可以直接达成致死表型。当致死选择标记物编码酶，所述酶将具体的底物转化为毒性化合物时，还可以有条件地达成致死表型。这类条件致死标记物与可以被转化为毒性化合物的底物的组合为硝酸盐还原酶(mVLD基因)与氯酸盐组合，乳清酸核苷-5，-单磷酸盐脱羧酶(pjtG基因)与氟-乳清酸组合，乙酰胺酶(am^基因)与氟-乙酰胺组合，或胸苷激酶(汰基因)与5-氟-2，-脱氧尿苷组合。提供选择标记物表达的表达盒包含与选择标记物编码基因可操作地连接的调节序列。术语"可操作地连接"是指下述并置状态，其中所述组件处于允许它们以其想要的方式作用的联系中。与编码序列"可操作地连接的"调节序列如启动子、增强子或另一表达调节信号以下述方式安置来自其编码序列的多核苷酸的表达在与调节序列相容的条件下达成。选择标记物表达盒的调节序列优选地对感兴趣的真核细胞的染色体而言是异源的，即调节序列来自与待转化的感兴趣的真核细胞不同的真核物种。在该背景中使用同源调节序列可导致对应于同源调节序列的染色体位点上的定向整合。这类整合事件是不期望的，因为其降低了对包含靶向序列的位点的正确靶向百分比。使用的调节序列可驱动组成型表达；这使得能够在转染后直接使用阴性选择。或者，可以使用驱动选择标记物基因的可调节表达或可诱导表达的调节序列；这涉及两步步骤。首先，在不发生选择标记物基因转录的条件下进行转化体的转染和随后的分离。其次，将经分离的转化体转移至诱导阴性选择标记物基因转录的条件下，从而选择性地杀死经历了随机整合事件的所有隔离群。DNA分子可以以任何顺序包含第一和第二DNA片段，优选是线性的。如果置换序列不包含选择标记物，则这类标记物可在独立的DNA分子中提供。使用本领域普遍已知的技术，用包含第一和第二DNA片段的DNA分子和任选的包含选择标记物的DNA分子转化真核细胞。简言之，通过将真核细胞与合适量的DNA分子(优选是线性的形式)接触来转化真核细胞，并通过在仅经转化的细胞能够生长的选择性培养基上培养细胞来选择经转化的细胞的菌落。转化后，包含第一和第二DNA片段的DNA分子通过同源或异源整合事件整合进真核宿主细胞的染色体中。通过置换序列和靶序列侧翼的同源序列上的双重交叉事件，在宿主染色体的靶序列上发生同源整合事件。这类事件确保包含选择标记物表达盒的第二DNA片段不被整合进染色体中。非同源整合事件导致包含第一和第二DNA片段的完整DNA分子的整合。当选择标记物基因在整合后被表达时，取消选定其中发生了非同源整合事件的细胞。选择标记物基因的表达可以与转化体的选择同时发生，或者在选择了转化体后的较晚阶段发生。在后一情况下，选择标记物基因的表达可以被合适的诱导物诱导。真核细胞是具有NHR偏好的真核细胞。优选地，真核细胞是真菌、植物或动物细胞。更优选地，真菌是JW6Tg/〃M、尸em'"7/^w、或尸/c/n'a的属；最优选As^erg〃/wsw'ger、^pergz7/wsm'c/w/朋s、v4s/7erg7'〃w51—/wa、CA，o/o"'簡/wc/:"o衡m^、A7炒veram少ces/ac"i"、/^'c/n'a戸s/on.51或尸/c/n'aa/ern7的禾中。更优选地，植物是Jra^Wo/w^、Wcoriawa、6V/fl"wm、丄a"wca、SrasWca、(9^za、J5paragi^、尸/swm、A/edZcago、Zea、//on/ewm、Seca/e、7V/ricw附、CVzp57'cw附、C"wcwm^、C^cm/^wY"、C"r函.5、C"ms、5brgA画的属；最优选地是爿ra/^Woi戸SAa/^a、A^co0.firnato^acci/附、iS"o/awi/附/yco/er^cwm、6b/awmfw/e厂os"Mm、iSo/aww附附e/owge朋、5b/a鹿wescw/e幽w、丄a由cas加'va、6ms\s7,cawa戸51、5ra肌'cao/eracefl、Sra肌'cara戸、(9，ag励e/rz.ma、(9，a5"fl/fra、q/^c/wa/^、P/5M附saZ/vw/w、MetZ/cagosariva、Zeama_y5、i7onieMmvw/gare、Seca/ecerea/e、7hYz'cw附aes^'vwm、7V7.ricwmdMn/w、C"o/zs7'cwmsa/vtw、CwcM/""6"a/epo、C"rw〃ws/朋a加、Q/c訓^we/o、C"ms1awrawftyb//a、C"n^moxz'ma、C"n^附ecZ/ca、C"ms厂ericw/ato的禾中。更优选地，动物细胞是//麵o、ia"t^、Mws、iSW、5as、Z)am'o、Cam's、、E《薦s、属；最优选的是//omos—^s1、朋rveg7'ci^、MwsmwscM/i"、scr—、5tw她ms、Ajw/o、C朋/s/w/t^、、E《wwscfl/a〃i"、/Sa/mosfl/,、Owco/^ywc/^，^y、GW/ig"〃ws、Me/eagr^gfl〃o/avo、Droop/n7a附e/a/7oga对er、Caewor/mZc//toe/ega朋的禾中。通过使用具有提高的HR/NHR比例的真核细胞，本发明的方法有利地确保了多核苷酸至感兴趣的染色体靶位点的增加的靶向。本发明的方法还有利地允许提供经转化的真核细胞，所述经转化的真核细胞富含其中发生了正确定向重组事件的细胞。尤其是与使用无第二片段(其包含选择标记物)的转化中的1-2%相比，至少50%的经转化的克隆具有靶向了染色体中靶序列的置换序列。图1显示质粒pdel-hdfA的克隆方案。五个PCR反应PCR1A、PCR2A、PCR3、PCR4A和PCR5的细节在实施例1中详细说明。其中指出了每个中间体质粒名称和相关的限制性酶切位点。图例*=图解用酶限制性消化；带垂直线的方框=5'同源侧翼序列；带水平线的方框=3'同源侧翼序列；白色方框-mm^选择标记物盒；大黑色方框=腐草霉素选择标记物盒；小黑方框=重组序列图2显示真菌中两种不同的重组途径。A.(双重)同源重组，导致定向整合事件。在该情况下非同源的We基因不会整合，从而使得转化体对腐草霉素敏感。B.非同源重组，导致随机整合事件。在该情况下非同源的We基因会整合，从而使得转化体抗腐草霉素。在此之上，靶基因座(在该情况下为保持完整。图例LF二5，同源侧翼序列；《m^=am^S选择标记物盒；RF-3'同源侧翼序列；ble=腐草霉素选择标记物盒；hdfA=尸ew'"7/z'wmc/zo^oge"wm基因(酵母KU70同系物)。"X"表示重组事件。图3显示为了确定cAoAwge舰m基因是否被正确删除的PCR对照。A.WT基因座。B.正确的基因靶向使用寡核苷酸SEQIDNO11和SEQIDNO12会产生2.6kb的片段；WT不会产生片段。C.正确的基因耙向用寡核苷酸SEQIDNO13和SEQIDNO14会产生3.6kb的片段；WT不会产生片段。D.正确的基因靶向用SEQIDNO15和SEQIDNO16不会产生片段；WT会产生2.2kb的片段。图例LF二5，同源侧翼序列；am必=am必选择标记物盒；RF=3'同源侧翼序列；=尸em'c/肌wmc/o^oge"ww基因(酵母KU70同系物)。箭头指出实施例1文中描述的寡核苷酸退火位置。粗线指出在实施例1文中描述的PCR反应中扩增的PCR片段。图4是PCR对照的图示，所述PCR用于确定是否获得了不含标记物版本的Pem'd〃/wmc/o^oge"wm删除突变体。A.ama^标记物仍然存在的删除使用寡核苷酸SEQIDNO17和SEQIDNO18应当产生5kb的片段。B.选择的重组事件的图示，使得细胞成为氟乙酰胺抗性的。B.不含标记物的删除用寡核苷酸SEQIDNO17和SEQIDNO18会产生1kb的片段。图例LF=5，同源侧翼序列；am必=am必选择标记物盒；RF=3'同源侧翼序列；箭头指出实施例1文中描述的寡核苷酸退火位置。粗线指出在实施例l文中描述的PCR反应中扩增的PCR片段。图5显示在Pe"/c/〃/wmc/^wge冊m的niaD基因座上定向整合的途径。A.质粒pDESTR4R3Naw必N.B.线性化的pDESTR4R3Nam必N在基因组"&D基因座上诱导了双重同源重组(或交换)。C.flmc/S交换后的基因组m'aZ)基因座构成。图例LFniaD=w'oD基因基因座的5'同源侧翼序列；am必二aw必选择标记物盒；RFniaD^m'aD基因基因座的3'同源侧翼序列；"X"表示重组事件。图6显示通过使用第二可选择标记物与具有改进的同源重组频率的菌株组合在尸ew'd肌wmc/o^oge"wm的"&Z)基因座上定向整合的途径。A.质粒pDESTR4R3NphleoNam必。B.线性化的pDESTR4R3NphleoNam必在基因组基因座上诱导了双重同源重组(或交换)。C.We交换和丧失am必基因后的基因组wVLD基因座构成。指出了证实正确基因靶向的PCR扩增，包括预期的片段大小。图例LFniaD=基因基因座的5'同源侧翼序列；We=腐草霉素选择标记物盒；RFniaD=m'aZ)基因基因座的3'同源侧翼序列；am^S=am^S选择标记物盒；"X"表示重组事件。箭头指出实施例4文中描述的寡核苷酸退火位置。粗线指出在实施例4文中描述的PCR反应中扩增的PCR片段。图7显示通过使用第二可选择标记物与具有改进的同源重组频率的菌株组合在Pe"/d〃Zwwc/zo^oge履m的w/aZ)基因座上定向恢复的途径。A.质粒pDONR201aw必ni800禾QpDONR201a/w必ni1200的图示。B.(被M/wI或7VnJ任一)线性化的载体pDONR201am必ni800和pDONR201am^S"ni1200在基因组wVlD基因座上产生了双重同源重组(或交换)。C.中心441bp恢复后的基因组m'aZ)基因座构成。图例LFniaD=m'aZ)基因基因座的5'同源侧翼序列；=部分"/flD开放读码框；RFniaD="/aD基因基因座的3'同源侧翼序列；am必=am必选择标记物盒；"X"表示重组事件。箭头指出实施例5文中描述的寡核苷酸退火位置。粗线指出在实施例5文中描述的PCR反应中扩增的PCR片段。实施例通用材料和方法标准步骤如另ij处(Sambrooke,fl/"1989,Molecularcloning:alaboratorymanual,2ndEd.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)所述进行。使用校正读码聚合酶Phusion(Finnzymes)根据制造建的菌株和质粒的验证通过使用Taq聚合酶完成。限制性酶来自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。对于常规克隆，使用^c/2er油,"co//菌株Top10和DH10B(Invitrogen)。根据制造商手册使用Invitrogen的Gateway体系。构建的质粒的验证通过限制性分析和随后的测序进行。实施例1册!j除尸em'cz7/z'M附c/zrysogewMW白勺Z;J/^基因载体构建为了删除涉及非同源末端连接途径的酵母KU70基因的真菌等价物尸em'd〃/wmc/o^ge聰m基因(见WO05095624)的染色体拷贝，构建了整合载体pdeW^/4。为此PCR扩增/^//J基因的紧邻上游和紧邻下游的2500bp基因组DNA片段。使用SEQIDNO1和SEQIDNO2的寡核苷酸从基因组DNA中PCR扩增上游区(别名左侧翼；图1中PCR1A)，从而在远左侧端引入lal位点。为了简化随后的am^S标记物的去除，通过从基因组DNA中PCR扩增基因下游第一个1000bp并将其融合至左侧翼，将该盒周围的1000bp重复引入构建体中(图1中PCR2A)。为此使用寡核苷酸SEQIDN03和SEQIDN04，在右侧末端引入禾Q位点。整个片段(3.5kb)被克隆进pZERO-TOPO(Invitrogen)中，产生质粒pTOPO-LFA-RFA2。使用寡核苷酸SEQIDNO5和SEQIDNO6从pHELY-Al(见WO04106347)中PCR扩增a,w^选择标记物盒，在左端引入mrt、^yi和幼yi位点和在右端引入丄ci和mwi位点(图1中PCR3)。还将该片段克隆进pZERO-TOPO中(即产生质粒pTOPO-L-amdS)并随后将片段再克隆进pTOPO-LFA-RFA2中，产生质粒pLFA2-RFA2-Lox-"w必。使用寡核苷酸SEQIDNO7和SEQIDNO8从基因组DNA中PCR扩增下游区(别名右侧翼；图1中的PCR4A)，从而在左端引入A>"I、和血d位点和在右端引入X/"I位点。将片段再次克隆进pZERO-TOPO中，产生质粒pTOPO-L-RFA。为了有助于随后针对基因座上定向整合的有效筛选，使用寡核苷酸SEQIDNO9和SEQIDNO10从pAMPF21(Fierro^a/.,1996,CurrGenet29:482-489)中PCR扩增腐草霉素抗性盒(图1中PCR5;Phleo)，从而在左端引入历打rfin、Jscl和Kj^I位点和在右端引入iVort位点。用和消化片段并将其克隆进pCR2.1中，产生pCR2.1-Phleo。用止cl和消化后从pTOPO-L-RFA中分离右侧翼；并将其克隆进pCR2.1-Phleo，产生质粒pLox-RFA-Phleo。分离pLox-RFA-Phleo的爿c5l-Vo,1片段并将其连接在用Jd-A^I消化过的pLFA-RFA2-Lox-am必中后获得的完全删除构建体，产生质粒pdel-Z^/4(见图l)。染色体拷贝的删除从质粒pdel-;W/A中以邻I片段形式分离出删除片段，并转染至尸em'c/〃/w附cA/^^ogewiwz原生质体中。尸em'c/〃/wwc/z^ysogewwm原生质体根据标准方案生产(参阅例如Cantoral"a/.,1987，Biotechnology5:494-497;Swinkels"a/.,1997，WO97/06261)，然而使用Glucanex(Sigma)作为分解酶。转染后将原生质体涂布在用乙酰胺作为唯一氮源的选择性再生琼脂平板上(培养基的精确描述参阅Swinkelsfl/.，1997)。利用乙酰胺的菌落被转移至新鲜的乙酰胺平板(无蔗糖诱导孢子形成)上并随后针对腐草霉素敏感性筛选300个菌落(在如US2002/003975中针对Pem'd〃/wm"0^oge""m所述的矿物培养基琼脂上，不含苯乙酸但是补充有15g/L的琼脂用于固化和50mg/L的腐草霉素)。由此获得的转化体应当针对基因座上的定向整合被富集，因为随机转化体会是腐草霉素抗性的(见图2)。300个利用乙酰胺的转化体中仅9个是腐草霉素敏感性的。这表明3%的原始转化体是推定的正确转化体，即朝向/^/^的靶向可以是成功的。这与针对丝状真菌报导的值是一致的，其中在WT状态下大部分转化体是随机整合的结果。通过添加针对腐草霉素敏感性的筛选，我们能有效地取消选定这些并对有限量(即9个)推定的/^/4突变体作出更多努力。/^/M删除的验证用菌落PCR筛选9个推定的突变体中的六个，确定删除是否正确。为此，将一块孢子化的菌落重悬在50ml水中并在98。C煮沸10分钟。离心细胞碎片并在3个PCR反应中使用1ml上清液(见图3)。使用下述引物组，只有带有正确整合事件的转化体能够产生2.6kb的片段(见图3B)，所述引物组中正向引物在am^S盒的终止子处退火，反向引物在删除盒中使用的右侧翼下游退火。使用寡核苷酸SEQIDNO11和SEQIDNO12的PCR反应显示所有6个候选者在该位点上具有正确的整合。使用下述引物组，只有具有正确整合的转化体会得到3.6kb的片段(见图3C)，所述引物组中正向引物在删除盒中使用的左侧翼上游退火，反向引物在am必盒的伊W启动子处退火。使用寡核苷酸SEQIDNO13和SEQIDNO14的PCR反应显示只有一个候选者在该位点处具有正确的整合。使用下述引物组，具有正确整合事件的转化体不会产生片段，所述引物组含有在基因ATG处起始的正向引物和恰好在的STOP密码子之前起始的反向引物。使用寡核苷酸SEQIDNO15和SEQIDNO16的PCR反应显示在最先的两个PCR后剩余的单个候选者确实未得到条带，而其他五个候选者中仍然能够扩增/^/A指出在后一组中，/^/J基因座上发生了奇数重组。然而，证实了SA1菌株是真正的/^/j删除菌株。因此结论是6个转化体中的l个具有正确的/^/4基因置换。获得不含标记物的突变体为了获得清洁的/^/j突变体，必须去除^m^选择标记物。为了简化起见，在克隆时引入1000bp重复片段(见图l)。该1000bp与删除构建体中使用的右侧翼区的最先1000bp完全相同。因此，如果该1000bp中会发生重组，则能获得清洁的删除，其中侧翼区被保留而整个/^/J基因座会被去除。^m/S选择标记物具有下述优点可以选择该基因的存在(即能够在乙酰胺作为唯一氮源时生长)以及不存在(即存在"m^S时氟乙酰胺会产生有毒的氟)。将菌株SA1的孢子涂布在含氟乙酰胺的琼脂平板上(W09706261)，分离生长的菌落并用菌落PCR检验。为此，如上所述获得PCR模板材料，并使用寡核苷酸SEQIDNO17和SEQIDNO18进行PCR。在SA1的情况下，这可产生5kb的片段，而在重组的情况下(即不含标记物的/^/C4删除)，这可产生lkb的片段(见图4)。检验了10个氟乙酰胺抗性的菌落，其均显示1kb的条带。据此，这10个候选者均不能够在乙酰胺平板上生长，证实了双重同源重组的发生"m必基因已经被去除，这些菌落是真正的无标记物删除菌株(AS1到AS10)。无标记物突变体的表型为了确定/^^突变体是否具有明显的表型，检验了5个项目青霉素V生产、形态学、生长速率、孢子形成和腐草霉素敏感性。如US2002/0039758所述在液体培养基中检验青霉素V生产。检验了四个菌株WT、SA1(含flm必的/^/^突变体)、AS1和AS2(均无标记物的突变体)。生产力分别为100%、114%、105%和100%。因此，hdfA删除不引起青霉素生产的明显改变。通过在平板上培养突变体检验形态学。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^^删除不引起形态学的明显改变。在如上所述的青霉素V生产力测试中通过测量OD600检验生长速率。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^/J删除不引起生长速率的明显改变。通过用眼睛比较琼脂平板上菌落的着色和结构检验孢子形成。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/W/4删除不引起孢子形成的明显改变。因为/^^基因产物可能在腐草霉素敏感性的修复机制中起作用，检验了一种已知的DNA断裂诱导物。这通过在如US2002/0039758中针对Pew'c/Wwmc/zo^ogewwm而描述的矿物培养基琼脂平板上测试生长完成，所述培养基不含苯乙酸，但是补充有15g/L用于固化的琼脂和0-50mg/L腐草霉素。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^/」删除不引起腐草霉素敏感性的明显改变。最后，我们得出结论突变体没有明显的表型，并可被用于进一步的研究。册lj除尸ew'd〃/讓c/zrys收e"騰的hdffi基因载体构建为了删除涉及非同源末端连接途径的酵母KU80基因的真菌等价物尸em'd肌wmcAo^oge鹿mAc(/B基因(见WO05095624)的染色体拷贝，构建了整合载体pdeW^/B。构建一般与图1中针对基因所列的相同。首先，PCR扩增Ac^B基因的紧邻上游和紧邻下游的2500bp基因组DNA片段。使用寡核苷酸SEQIDNO19和SEQIDNO20从基因组DNA中PCR扩增上游区(别名左侧翼)，从而在远左端引入lal位点。为了有助于随后去除画必选择标记物，通过从基因组DNA中PCR扩增/^/B基因上游的最初1000bp并将其融合进左侧翼，将该盒周围的1000bp重复引入构建体中。为此，使用寡核苷酸SEQIDN021和SEQIDN022，在右端引入^yi禾n位点。将整个片段(3.5kb)克隆进pZERO-TOPO(Invitrogen)中，产生质粒pTOPO-LFB-RFB2。将pTOPO-L-amdS的Sr^I-AAM片段再克隆进pTOPO-LFB-RFB2中，产生质粒pLFB2-RFB2-Lox-amdS。使用寡核苷酸SEQIDNO23和SEQIDNO24从基因组DNA中PCR扩增A^B的下游区(别名右侧翼)，从而在左端引入《p"I、^/I和Acl位点，和在右端引入X/"I位点。将该片段克隆进pZERO-TOPO中，产生质粒pTOPO-L-RFB。用Ad和AT;"I消化后从pTOPO-L-RFB中分离该右侧翼；并克隆进pCR2.1-Phleo，产生质粒pLox-RFB-Phleo。分离pLox-RFB-Phleo的Jcd-A/ort片段并将其连接在用Jcd-A^I消化的pLFB-RFB2-Lox-am必中后，获得M/S的完整删除构建体，产生质粒pdel-M历(见图1)。染色体拷贝的删除从质粒pdel-Z^/S中以片段的形式分离出删除片段，并转染至尸em'c/〃/w附c/o^oge"w附原生质体(根据标准方案生产，艮卩根据Cantoral"a/.，1987,Biotechnology5:494-497;Swinkels"a/.,1997，WO97/06261,但是使用Glucanex(Sigma)作为分解酶)。转染后将原生质体涂布在使用乙酰胺作为唯一氮源的选择性再生琼脂平板上(SwinkelsW1997中描述的培养基)。利用乙酰胺的菌落被转移至新鲜的乙酰胺平板(无蔗糖诱导孢子形成)上并随后针对腐草霉素敏感性筛选375个菌落(在如US2002/0039758中针对c/owgem/m所述的矿物培养基琼脂上，不含苯乙酸但是补充有15g/L用于固化的琼脂和50mg/L的腐草霉素)。由此获得的转化体应当针对/^^基因座上的定向整合被富集，因为随机转化体会是腐草霉素抗性的(在图2中针对/^0概述)。375个利用乙酰胺的转化体中仅12个是腐草霉素敏感性的。这表明了3.2%的原始转化体是推定的正确转化体，即朝向/^/B基因的耙向可以是成功的。这与针对丝状真菌报导的值是一致的，其中在WT状态下大部分转化体是随机整合的结果。通过添加针对腐草霉素敏感性的筛选，我们能有效地取消选定这些，并对有限量(即12个)推定的/^/B突变体作出更多努力。/^/B删除的验证用菌落PCR筛选12个推定的/^/B突变体中的八个，确定删除是否正确。为此，将部分孢子化的菌落重悬在50ml水中并在98'C煮沸10分钟。离心细胞碎片并在3个PCR反应中使用1ml上清液(与图3中针对概述的设置类似)。使用下述引物组，只有带有正确整合事件的转化体能够产生2.6kb的片段，所述引物组中正向引物在mm^盒的终止子处退火，反向引物在删除盒中使用的右侧翼下游退火。使用寡核苷酸SEQIDNO11和SEQIDNO25的PCR反应显示所有8个候选者在该位点上具有正确的整合。使用下述引物组，只有具有正确整合事件的转化体会得到3.6kb的片段，所述引物组中正向引物在删除盒中使用的左侧翼上游退火，反向引物在am^S盒的g;c^启动子处退火。使用寡核苷酸SEQIDNO26和SEQIDNO14的PCR反应显示8个候选者中的7个在该位点处具有正确的整合。使用下述引物组，具有正确整合事件的转化体不会产生片段，所述引物组含有在/^/S基因ATG处起始的正向引物和恰好在的STOP密码子之前起始的反向引物。使用寡核苷酸SEQIDNO27和SEQIDNO28的PCR反应显示在最先的两个PCR后剩余的7个候选者中5个的确未得到条带，而在其他三个候选者中仍然能够扩增(部分)/^历，表明在后一组中，基因座上发生了奇数重组。然而，证实了SB2、SB3、SB4、SB5和SB12菌株是真正的/^/S删除菌株。因此结论是8个转化体中的5个具有正确的/^/B基因置换。获得无标记物的突变体为了获得清洁的/^/B突变体，必须去除am^S选择标记物。为了简化起见，在克隆时引入1000bp重复片段(见上文)。该1000bp与删除构建体中使用的右侧翼区的最先1000bp完全相同。因此，如果该1000bp中会发生重组，则能获得清洁的k/ys删除，其中侧翼区被保留而整个/^/B基因座会被去除。am^S选择标记物具有下述优点可以选择该基因的存在(即能够在乙酰胺作为唯一氮源时生长)以及不存在(即存在amdS时氟乙酰胺会产生有毒的氟)。将5个Ac/yB菌株的孢子涂布在含氟乙酰胺的琼脂平板上(W09706261)，分离生长的菌落并用菌落PCR检验。为此，如上所述获得PCR模板材料，并使用寡核苷酸SEQIDNO29和SEQIDNO30进行PCR。如果am必存在，这会产生5.5kb的片段，而在重组的情况下(即无标记物的/^/S删除)，这会产生1kb的片段(如在图4中针对/^/4所概述的)。针对5个/^/B菌株中的每个检验了IO个氟乙酰胺抗性的菌落，所有的衍生物均显示1kb的条带。据此，这50个衍生物均不能够在乙酰胺平板上生长，证实发生了重组"m必基因已经被去除，这些菌落是真正的/^/S无标记物删除菌株(ASI到ASIO)。无标记物/^诏突变体的表型和对突变体一样，我们确定了/^/S突变体是否不具有明显的表型。检验了相同的个5项目青霉素V生产、形态学、生长速率、孢子形成和腐草霉素敏感性。如US2002/0039758中所述在液体培养基中检验青霉素V生产。对每个amt^阳性/^/B菌株检验了两个无标记衍生物，并与WT菌株的生产力比较(表1)。表1./^/S突变体的青霉素V生产力；WT的生产力被设定为100。<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>生产力均在WT菌株的100+/-10%左右。因此，A^B删除不引起青霉素生产的明显改变。通过在平板上培养突变体检验形态学。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^/B删除不引起形态学的明显改变。在如上所述的青霉素V生产力测试中通过测量OD600检验生长速率。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^/B删除不引起生长速率的明显改变。通过用眼睛比较琼脂平板上菌落的着色和结构检验孢子形成。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^/B删除不引起孢子形成的明显改变。因为/^/B基因产物可能在腐草霉素敏感性的修复机制中起作用，检验了一种已知的DNA断裂诱导物。这通过在如US2002/0039758中针对尸ew'd〃/wwc/o^ogem/m而描述的矿物培养基琼脂平板上测试生长来完成，所述培养基不含苯乙酸，但是补充有15g/L用于固化的琼脂和0-50mg/L腐草霉素。未观察到相对于WT的显著差异。因此，/^/S删除不引起腐草霉素敏感性的明显改变。最后，我们得出结论像突变体一样，/^/B突变体没有明显的表型，并可被用于进一步的研究。实施例3尸ew'd'w7c/;n^oge丽m的Zfi^或突变体菌株中的同源重组频率为了确定与WT相比/^/J和/z^B删除菌株的同源重组频率，构建了编码硝酸盐还原酶的m力D基因座的删除盒。为此，扩增了mVLD基因座的两个1800bp片段，通过flw^S表达盒分离，并应该使得m'a/)基因的部分被交换为flmdS表达盒，从而赋予转化体氯酸盐抗性(归因于"&D的删除)和能够使用乙酰胺作为唯一的氮源。进行了三个PCR反应(见表2)并将其克隆进Invitrogen的GatewaypDONR载体中，使得能够通过Multi-Gateway4本系P逭后有效鬲虫合(见www.Invitrogen.com)。表2.用于克隆niaD-删除盒的寡核苷酸和pENTR载体。<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>三个获得的的载体被用于进行进入pDESTR4-R3的多位点Gateway反应，产生质粒pDESTR4R3Namd，(见图5)。用EcoRI线性化该质粒并转染至Penicilliumchrysogenum原生质4本。Penicilliumchrysogenum原生质体根据标准方案(参阅例如Cantoral"a/.,1987，Biotechnology5:494-497;Swinkelsa/.,1997，WO97/06261)生产，但是使用Glucanex(Sigma)作为分解酶。转染后将原生质体涂布在使用乙酰胺作为唯一氮源的选择性再生琼脂平板上(培养基的详细描述见SwinkelsWa/.,1997)。利用乙酰胺的菌落被转移至新鲜的乙酰胺平板(无蔗糖诱导孢子形成)上并随后针对氯酸盐敏感性(每升NaCl，3g;KH2P04,1g;FeS04.7H20，10mg;MgS04,7H20,0.5g;OxoidAgarno.l,15g;葡萄糖，20g;孢子元素，见WO970626L第10-11页，从ZnS04到生物素的所有元素；腺嘌呤，1.85g;KC103,12.5g)筛选100个菌落。从表3中存在的结果可以清楚地概括出，/^/J或/^/S中任一个的删除对定向整合的频率具有显著的影响定向整合从WT中的1%提高到突变体中的47-56%。表3.WT、hdfA和HDFb突变体中的基因靶向频率。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>实施例4使用第二可选择标记物在Penicilliumchrysogenumm的hdfA或hdfB突变体菌株中改进的同源重组效率为了测定第二可选择标记物的影响，获得pDESTR4R3NphleoNaw必的删除构建体(见图6)。破坏w'aD基因座后将/^/4和/^/B删除菌株的同源重组频率再次与WT相比较。为此，如实施例3中所述使用"&D基因座的1800bp侧翼片段，但是这次通过We表达盒分离这些，产生腐草霉素抗性。处于同源侧翼区之外，am^S表达盒可被用于取消选定任何因为非同源整合事件而不想要的转化体。事实上，应该可能在氟乙酰胺/腐草霉素选择平板(甚至不含氯酸盐)上直接选择正确的转化体。进行PCR反应扩增We基因盒并引入必需的Gateway位点(见表4);出于对完整性的考虑，从实施例3中复制两个侧翼区PCR。表4.用于构建pDESTR4R3NphleoNamdS的寡核苷酸和pENTR载体<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>三个获得的的载体被用于进行进入pDESTR4-R3的多位点Gateway反应，产生质粒pDESTR4R3NphleoN。使用寡核苷酸SEQIDNO39和40进行PCR扩增后，可以作为Ap"I-五coRI片段从质粒pHELY::Al(WO04106347)中分离P砂cL4-am必片段，并克隆进pDESTR4R3NphleoN的五c(^I-^p"I位点中，产生质粒pDESTR4R3NphleoNamdS。用iV^I线性化该质粒并转染至Pem'"'〃/MmcAo^ogemmi原生质体(根据标准方案生产，艮口根据Cantoral"1987,Biotechnology5:494-497;Swinkels"g/"1997，WO97/06261,但是使用Glucanex(Sigma)作为分解酶)。转染后将原生质体涂布在含腐草霉素的选择性再生琼脂平板上(在如US2002/0039758中的矿物培养基琼脂上，不含苯乙酸但是补充有1M蔗糖、15g/L用于固化的琼脂和50mg/L腐草霉素)。孢子形成后在乙酰胺和氟乙酰胺琼脂平板(WO9706261)上检验mw必基因的不存在。使用两个特异的引物组通过PCR进行最终的检验，所述引物组应当仅在带有定向删除的突变体中给出片段(图6)。通过使用寡核苷酸SEQIDNO41和42检验左侧翼的整合，同时使用寡核苷酸SEQIDNO43和44检验右侧翼的整合。所有的腐草霉素抗性菌落和不利用am^S的菌落显示具有朝向niaD基因座的基因耙向。对于WT而言，95个腐草霉素抗性菌落中仅有l个也是不利用am^S"的。因此，通过使用具有改进的HR/NHR比例和能够被用作可选择标记物的第二DNA片段的菌株的组合，基因靶向效率从1.1%(WT)被提高至100%(/^//4和/^^突变体二者)，所述菌株。从两个实验中均纯化了具有正确m'"D删除的隔离群，分别称作HTAN禾QHTBN。这些结果显示了组合具有改进的HR/NHR比例的菌株和使用第二可选择标记物的有益作用。WT菌株中的基因靶向频率为1%左右(实施例3)。具有改进的HR/NHR比例、但是未用第二可选择标记物转化的菌株显示47-56%的正确基因靶向(实施例3)。具有正常的HR/NHR比例(即WT菌株)、但是用第二可选择标记物转化的菌株显示16-63%的正确基因靶向(实施例1和2)。然而，当使用具有改进的HR/NHR比例和第二可选择标记物的菌株时，获得了惊人的100%正确的基因靶向(本实施例)。实施例5使用第二可选择标记物在尸em'd〃^mcAr^oge腦m的Ad/g突变体菌株中改进的同源重组效率通过使用名为pDONR201fl/w必ni800和pDONR201flw^Sni1200的两个构建体(图7)获得非常有效的基因靶向的第二个例子，所述基因靶向通过组合具有最优化的同源重组频率的作用菌株和使用第二可选择标记物完成。使用实施例4的HTBN菌株作为受体菌株。通过并仅通过精确的基因靶向恢复菌株HTBN中缺乏的m'oD基因的441bp中心部分。为此，重建m'^D片段被800bp(如在pDONR201flm必ni800中)或1200bp(如在pDONR201am^Sni1200中)的同源耙向序列侧翼包围。另外，am^S表达盒被用作同源侧翼区外的第二可选择标记物。首先，从pHELY-Al中PCR扩增am^S表达盒并通过Gateway技术克隆进pDONR201载体中，得到质粒pDONR201-a附必(表5)。其次，从基因组DNA中PCR扩增(表5)，用MM禾卩消化并克隆进pDONR201am^S中，分别产生质粒pDONR201amc^ni800禾卩pDONR201amG^ni1200后获得2041(=800+441+800)和2841(=1200+441+1200)的恢复片段。表5.用于PCR扩增的寡核苷酸。<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>用M/mI或MiJ线性化载体pDONR201am必W800和pDONR201am必hi1200，并转染进Pew'c/肌wwcAowge"Mm原生质体(根据标准方案生产，即根据Cantoral"a/.,1987，Biotechnology5:494-497;Swinkels"a/"1997,WO97/06261,但是使用Glucanex(Sigma)作为分解酶)。转染后将原生质体涂布在用硝酸盐作为唯一氮源的选择性再生琼脂平板上(每升NaCl，3.0g;KH2P04,1.0g;FeS04.7H20,10.0mg;MgS04.7H20，0.5mg;葡萄糖，10.0g;蔗糖，342.0g;OxoidAgar,15.0g;NaN03，1g;1M磷酸盐缓冲液pH6.8,10ml)。获得了H^—个转化体(见表6)并将其转移至新鲜的平板(无蔗糖诱导孢子形成)上。孢子形成后在乙酰胺琼脂平板(见W09706261)上检验amc^基因的不存在，转化体均不能够生长，表明发生了非同源重组且仅获得100%的正确基因靶向。结果清楚地表明组合具有改进的HR/NHR比例的菌株和使用第二可选择标记物的有益效应。WT菌株中的基因靶向频率为1%左右(见实施例3)。具有改进的HR/NHR比例、但是未用第二可选择标记物转化的菌株显示47-56%的正确基因靶向(见实施例3)。具有正常的HR/NHR比例(即WT菌株)、但是用第二可选择标记物转化的菌株显示16-63%的正确基因耙向(实施例1和2)。然而，当使用具有改进的HR/NHR比例和第二可选择标记物时，获得了惊人的100%正确的基因靶向(本实施例)。表6.在菌株HTBN中恢复441bp中心niaD片段后获得的转化体。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>权利要求1.构建真核细胞的方法，所述真核细胞染色体DNA序列中的靶序列被置换为想要的置换序列，所述方法包括修饰对NHR具有偏好的亲本真核细胞，提供与所述亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞，提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置换序列，该置换序列5’和3’侧的侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表达盒，所述表达盒包含编码选择标记物的基因和与之可操作地连接的、在真核细胞中有功能的调节序列；用所述DNA分子转化所述经修饰的真核细胞；培养所述细胞，获得经转化的后代细胞，所述后代细胞染色体中插入了所述DNA分子，通过表达所述第二标记物，取消选定其中所述DNA分子通过非同源重组事件被插入所述染色体中的后代细胞；和获得其中所述染色体DNA序列中的所述靶序列被所述想要的置换序列置换的细胞。2.根据权利要求1的方法，其中对NHR具有偏好的所述亲本真核细胞是具有下述HR/NHR比例的真核细胞，所述比例S0.5，优选地^0.2，更优选地SO.l，最优选地S0.05。3.根据权利要求1或2的方法，其中所述HR/NHR比例被提高至少2倍，优选地至少4倍。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中通过提高HR途径的效力和/或降低NHR途径的效力来达成对所述亲本真核细胞的修饰。5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中通过下调、优选地灭活NHR途径中涉及的酵母基因〖t/70、Kt/柳、WD50、Mi五〃、Z^S2、ZJG4、￡/F7、AS7/和/或S/i^的等价物，来达成对所述亲本真核细胞的修饰。6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述置换序列侧翼的所述基本同源的DNA序列与所述靶序列侧翼的染色体DNA序列在不多于3kb的区域上具有至少80%的同一性程度。7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中所述置换序列包含选择标记物、经修饰的耙序列版本和/或存在于所述真核细胞基因组中的感兴趣的序列的额外拷贝。8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述选择标记物表达盒的所述调节序列对所述真菌细胞是异源的。9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述选择标记物表达盒的所述调节序列包含组成型或诱导型启动子。10.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述选择标记物是毒素。11.根据权利要求1-9中任一项的方法，其中所述选择标记物是有条件的选择标记物。12.根据权利要求1-11中任一项的方法，其中所述选择标记物是由t/"基因编码的白喉毒素A、由基因编码的硝酸盐还原酶、由基因编码的乳清酸核苷-5，-单磷酸盐脱羧酶、由"w^S基因编码的乙酰胺酶或由汰基因编码的胸苷激酶。全文摘要本发明公开了构建真核细胞的方法，所述真核细胞染色体DNA序列中的靶序列被置换为想要的置换序列，所述方法包括修饰对NHR具有偏好的亲本真核细胞，提供与亲本细胞相比具有提高的HR/NHR比例的真核细胞；提供包含第一DNA片段和第二DNA片段的DNA分子，所述第一DNA片段包含想要的置换序列，该置换序列5’和3’侧的侧翼是与靶序列侧翼的染色体DNA序列基本同源的DNA序列，所述第二DNA片段包含表达盒，所述表达盒包含编码选择标记物的基因和与之可操作地连接的、在真核细胞中有功能的调节序列；用DNA分子转化经修饰的真核细胞；培养细胞，获得经转化的后代细胞，所述后代细胞染色体中插入了所述DNA分子，通过表达选择标记物，取消选定其中DNA分子通过非同源重组事件被插入染色体中的后代细胞；和获得其中染色体DNA序列中的靶序列被想要的置换序列置换的细胞。文档编号C12N15/90GK101421401SQ200780012737公开日2009年4月29日申请日期2007年3月14日优先权日2006年4月8日发明者海瑟里恩·图-里尔,理查德·克尔曼,马可·亚历山大·伯格·范德申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司