专利名称：表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4_Cre的构建，是利用基因工程技 术，建立了能够在细胞内表达Cre重组酶的质粒，用于在细胞内表达Cre重组酶并监测LoxP 元件的活性，为建立Cre-LoxP重组酶系统模型提供了监测工具，同时提供了相应的制备方 法，属于动物验证学领域。
背景技术：
Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛应用，是条件性基因打靶、诱导 性基因打靶、时空特异性基因打靶策略的技术核心，建立人类疾病动物模型一般需要Cre 重组酶以特定的模式表达，例如使用组织特异性启动子。要在细胞内监测Cre-LoxP重组酶 系统的活性，需要建立能够在细胞内有效表达Cre重组酶的载体，目前人们使用的Cre重组 酶载体多为病毒，但使用病毒载体多不具有安全性和简便性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4_Cre的序列SEQ IDN0 1 ；本发明的另一目的在于提供一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，用 于鉴定具有LoxP元件的载体，可以很好的在猪细胞内表达Cre重组酶活性，起到对条件性 表达绿色荧光蛋白载体的监测作用，避免了用病毒载体作为鉴定Cre-LoxP重组酶系统的 弊端，并且pCEP4-Cre质粒可以在药物筛选(潮霉素B)的压力下以独立于细胞染色体外的 游离形式存在于细胞内，避免了对基因组的插入而引起的突变。本发明技术方案是这样实现的一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构 建，其特征在于首先采用基因工程的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4-Cre与载 体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞，在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体 pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于 剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件；具体制备方法如下将LoxP锚定neo和一个终止序列基因，后接EF1 a启动子启动的绿色荧光蛋白基 因，当与pCEP4-Cre质粒转入细胞后，Cre重组酶表达，将Loxp卯定的终止子删除，使绿色 荧光蛋白表达；lpCEP4-Cre 载体构建1、1用于构建载体的Cre制备根据Genpank上Cre基因的序列及猪密码子偏爱性设计引物，用重叠延伸PCR将 Cre基因拼接出来。将PCR得到的Cre片段的5'端引入到p⑶NA3. 1上的Hindlll酶切位 点，Cre片段的3'端引入到pCDNA3. 1上的EcoRI酶切位点。1、2 载体 pCEP4_Cre 的制备分别用Hindlll和Xhol双酶切载体pCEP4和pCDNA3. 1-Cre,得到的Cre片段的
35'端引入到pCEP4上的HindIII酶切位点，Cre片段的3'端引入到pCEP4上的XhoI酶切 位点，并委托北京天根公司进行测序，测序完全正确。2、pEF-stop-eGFP 载体构建将已有质粒pGKneotpAlox2中两Ioxp位点间的序列切下连接到pEF_GFP质粒中 eGFP的启动子EFl α后。所述的LoxP元件是在细胞水平通过细胞转染及荧光显微观察可以特异性检测条 件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件。通过以下试验例证明本发明的效果试验例lpCEP4_Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时转染猪胚胎成纤维细胞的检 测一荧光检测1成纤维细胞系将所构建的载体pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP瞬时转染中国长 白猪胚胎成纤维细胞。2试验过程培养细胞至70 80%左右进行转染，将1号孔细胞瞬时转染 pEF-stop-eGFP质粒做为阴性对照、2号孔细胞瞬时共转染pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP、 质粒、3号孔细胞瞬时转染pEF-GFP质粒做为阳性对照、4号孔细胞作为空白对照。并用含 10% FBS血清的培养基培养。5% C02培养箱中培养24H、48H时，在荧光共聚焦显微镜下观 察绿色荧光蛋白的表达情况。3试验结果单独转染pEF-stop-eGFP质粒的阴性对照细胞不表达绿色荧光蛋 白，共转染pCEP4-Cre和pEF-stop-eGFP质粒的细胞中Cre重组酶切除Loxp卯定的终止子 以后，绿色荧光蛋白表达。结果如下见图ICre重组酶切除stop序列以后，绿色荧光蛋白的表达情况。 试验例2pCEP4_Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时转染猪胚胎成纤维细胞的检 测-—RT-PCR检测1成纤维细胞系将所构建的载体pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP瞬时转染中国长 白猪胚胎成纤维细胞。2试验过程分别取转染48H后的细胞RNA做为模板，利用绿色荧光蛋白的引物进 行RT-PCR鉴定，同时设立不加模板只加水的空白对照；以转染pEF-GFP载体的细胞提取总 RNA作为模板，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阳性对照；转染pEF-stop-eGFP载体的 细胞提取总的RNA，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阴性对照。3试验结果pCEP4_Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时共转染的细胞、Cre重组酶切除 stop序列以后，RT-PCR检测绿色荧光蛋白的表达，而瞬时转染pEF-stop-eGFP载体的细胞 提取总的RNA，进行RT-PCR实验无绿色荧光蛋白的表达，进一步确定绿色荧光蛋白的表达 情况。结果表明，pCEP4-Cre、pEF-stop-eGFP载体瞬时共转染的细胞RNA为模板经PCR在 804bp处出现特异性条带，证明绿色荧光蛋白基因得以转录。结果如图2。M, MarkerIII 1、细胞克隆2、细胞克隆3、阳性对照4、阴性对照5、空白对照本发明的积极效果在于应用基因工程技术构建了一个表达Cre重组酶的质粒，并 且重组质粒pCEP4-Cre可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在，并在撤去药物压力后以每代10%的速率丢失；可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变；其 使用的简便性和安全性可被广泛的应用，为人类Cre重组酶系统的检测发展起到积极的推 动作用。
图ICre重组酶切除stop序列以后，绿色荧光蛋白的表达情况；A、C为猪胚胎成纤维细胞瞬时共转染pCEP4_Cre和pEF-stop-eGFP后24H、48H荧 光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况。B、D分别A、C为细胞对照 图2RT-PCR分析绿色荧光蛋白的表达；M :ladder、l，2、以细胞的RNA为模板的RT-PCR产物3、阳性对照4、阴性对照5、空白对照图3pCEP4_Cre载体构建具体实施例方式下面结合附图和实施例旨在对本发明做进一步描述，而不是以任何方式限制本发 明；在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实 现的任何改动或改变都将落入本发明的待批权利要求范围之内。实施例lpCEP4_Cre载体的构建根据Genpank上Cre基因的序列及猪密码子偏爱性设计引物，用重叠延伸PCR将 Cre基因拼接出来将PCR得到的Cre片段的5'端引入到pCDNA3. 1上的HindIII酶切位点，Cre片 段的3'端引入到pCDNA3. 1上的EcoRI酶切位点分别用HindIII和XhoI双酶切载体pCEP4和pCDNA3. l_Cre，得到的Cre片段连接 线性的pCEPMinvitrogen公司)，并委托北京天根公司进行测序，测序完全正确的用于片 段的连接试验，采用天根公司的大提质粒试剂盒大提质粒之后，用于细胞转染。实施例2pEF-stop_eGFP载体的构建将pGKne0tpAl0X2中含有Ioxp的片段在其两端酶切后，连入pEF_GFP载体，经酶 切鉴定和测序以后，采用天根公司的大提质粒试剂盒大提质粒之后，用于细胞转染。实施例3细胞的转染本发明采用脂质体介导DNA的胚胎成纤维细胞的转染，操作步骤。按 FuGENEHD(Invitrogen)说明书进行。转染前一天将原代培养的胚胎成纤维细胞用无抗生素 的培养液复苏至4个60mm平皿中，当细胞达到70 80%汇合时即可进行细胞转染。实施例4细胞水平鉴定_荧光观察为了验证所构建的载体是否可以有效的发挥Cre重组酶的活性，将转染的细胞培 养24H、48H时使用荧光显微镜观察。实施例5细胞水平鉴定-RT-PCR转染后48H所获得的细胞，提取细胞总的RNA进行RT-PCR反应，进一步鉴定绿色 荧光蛋白的表达。提取RNA和RT-PCR反应均采用Bioer Technology的Simply P总RNA 提取试剂盒提取试剂盒和一步法RT-PCR反应试剂盒。具体操作步骤参照说明书。RT-PCR
5反应的引物为绿色荧光蛋白的上游和下游引物El. 5' -GGC GCG CCC GCC ACC ATG GTG AGC AAG ；E2. 5' -GGC GCG CCT TAT CTA GAT CCG GTG GAT.以瞬时转染pEF-stop-eGFP载体的细胞总RNA为模板，利用绿色荧光蛋白引物所 扩序列作为阴性对照，同时设立不加模板只加水的空白对照，以瞬时转染pEF-GFP载体的 细胞总RNA为模板，利用绿色荧光蛋白引物所扩序列作为阳性对照。
权利要求
一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4 Cre的序列SEO ID NO1。
2.一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于首先采用基因工程 的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4_Cre与载体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞， 在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止 子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中 的LoxP元件；具体制备方法如下将LoxP锚定neo和一个终止序列基因，后接EFl α启动子启动的绿色荧光蛋白基因， 当与pCEP4-Cre质粒转入细胞后，Cre重组酶表达，将Loxp卯定的终止子删除，使绿色荧光 蛋白表达；
3.根据权利要求2所述的一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在 于pCEP4-Cre载体在动物细胞中，能够游离于细胞染色体外，不整和到细胞基因组中，同时 该载体表达的Cre重组酶能够切除动物细胞的基因组中或基因组外的Ioxp元件。
全文摘要
本发明涉及一种表达猪源Cre重组酶载体pCEP4-Cre的构建，其特征在于首先采用基因工程的方法构建pCEP4-Cre质粒，并用载体pCEP4-Cre与载体pEF-stop-eGFP共转染进入细胞，在表达Cre重组酶的情况下，将转入到细胞中的载体pEF-stop-eGFP中的Loxp卯定的终止子删除，使后接的报告基因eGFP得以表达，从而用于剪切条件性表达绿色荧光蛋白载体中的LoxP元件；其应用基因工程技术构建了一个表达Cre重组酶的质粒，并且重组质粒pCEP4-Cre可以在药物压力下独立于细胞染色体外存在，并在撤去药物压力后以每代10％的速率丢失；可有效的防止细胞基因组因插入外源基因而导致的基因突变；其使用的简便性和安全性可被广泛的应用，为人类Cre重组酶系统的检测发展起到积极的推动作用。
文档编号C12N15/63GK101892257SQ20101018508
公开日2010年11月24日 申请日期2010年5月28日 优先权日2010年5月28日
发明者周杨, 张明军, 朱建国, 李莉, 欧阳红生, 段新平, 毛丹, 王铁东, 聂代邦, 逄大欣 申请人:吉林大学