专利名称：甘蔗根特异表达启动子及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学和植物基因工程领域。具体地讲，本发明涉及一种甘 蔗根特异表达的启动子序列，含有该启动子的重组核酸序列，构建体和表达系统，及其驱动 功能基因在甘蔗根内特异性表达和优先表达的用途。
背景技术：
在利用基因工程技术对农作物进行遗传改良的过程中，人们常常期望插入的外源 基因能够限制在受体特定的组织中表达。这有两个重要的原因首先，相对于整体和持续性 表达而言，限制性表达(restricted expression)可减少植株体内营养资源新陈代谢的浪 费，降低对植株自身原有新陈代谢的影响，降低对植株生长的影响；其次，当外源表达蛋白 与植株上人或动物的食用部位没有关系时，外源基因最好直接表达在这些食用部位以外的 其他部位中，特别是在人或动物摄取外源表达蛋白的后果还不十分清楚的时候。而当外源 表达蛋白是对人体或动物有益的营养物质时，则应尽量使外源蛋白在人或动物的使用部位 高效表达。高等植物根的结构简单、组成稳定，是研究器官发生和发育的良好模式系统，有效 的根特异表达启动子是利用抗病虫基因、抗逆性基因、促进矿物质吸收的基因以及促进特 定次生物质代谢的基因等有益目的基因导入农作物并在植物根中驱动表达的必要前提。甘蔗是禾本科(Graminaceae)甘蔗属(SaccharumL.)植物，原产于热带、亚热带地 区。甘蔗是一种高光效的C4植物，其光饱和点高、二氧化碳补偿点低、光呼吸率低、光合强 度大、因而生物产量很高，它不仅是一种重要的糖料作物，也是一种重要的能源植物。由于 甘蔗是一种宿根植物，主要种植于旱坡地，逆境(特别是干旱和低温)和各种病虫害对其生 长影响很大，提高甘蔗对逆境和病虫的抗性一直是甘蔗育种的主要目标之一。研发甘蔗根 特异表达启动子，对甘蔗抗病虫、抗逆性等的遗传改良具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一个在甘蔗根特异表达的启动子及其植物表达载体。本发明 的技术方案为一种甘蔗根特异高效表达启动子，具有序列表<400>1中的序列。上述启动子是包括从甘蔗总DNA中克隆的甘蔗己糖转运蛋白基因(PST2a)的启 动子，经测序其长度为1968bp，通过启动子预测(Promoter predictions)等软件进行基 础启动子的分析，结果表明该启动子在540-590bp、908-958bp、1575_1625bp、1652-1702bp、 1894-1944bp存在五处基础启动子区。利用该启动子序列与植物表达载体pCAMBIA1301构 建成一个含有甘蔗己糖转运蛋白基因(PST2a)基因启动子和GUS基因的新的植物表达载体 PCAMBIA1900。通过农杆菌介导法遗传转化甘蔗愈伤组织，获取转基因甘蔗植株，⑶S组织化 学染色结果显示甘蔗己糖转运蛋白基因(PST2a)基因启动子是一个根特异性表达的启动子。以下我们分为两部分详细介绍我们的发明内容。一、PST2a基因启动子的克隆及植物表达载体的构建
1. PST2a基因启动子的分离及序列分析甘蔗基因组DNA提取采用经改良的CTAB法小量提取甘蔗基因组DNA。根据基因 库中已登录的甘蔗己糖转运蛋白基因(PST2a)基因的序列(登录号为AY165599. 1)，按照染 色体步移试剂盒(Universal Genomeffalker Kit)的要求设计两条引物Sl :5，-GCAACAAGAGCAGCTCCCGACATGTTTTC-3，；S2 5，-GCTCAACGATCCCTGCAACAGCGAGTTAA-3，。再依据试剂盒提供的引物、方法及反应条件进行PCR扩增。PCR扩增得到一条长 约2000bp的产物，扩增片段回收后与PMD-18T载体连接，转化大肠杆菌DH5 α感受态细 胞，挑取阳性克隆，交上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。测序结果表明 其为长1968bp，序列如序列表中<400>1。通过启动子预测(Promoterpredictions)等软 件进行基础启动子的分析，结果表明在540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、 1894-1944bp存在五处基础启动子区。该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如 TATA盒、CAAT盒、转录起始位点及其他调控元件(表1)。表1 :PST2a基因启动子元件分析
名称个数代表序列序列中位点功能G-box2CACGTA378光反应顺式调控元件ACIII element1GTTAGGTTC999维管束特异表达相关元件RY-repeat1CATGCA632核蛋白的结合位点GATA-box7GATA185,488,615, 752,1071,1658 1904特异性表达启动子 的必需元件ABRE元件1TACGTG49脱落酸应答元件ARE元件1TGGTTT112厌氧应答所必需的元件HD-Zip3GTAAT736,772蛋白结合位点LTR元件1CCGAAA1543低温应答元件MBS元件1CAACTG588干旱诱导应答相关 的MYB结合位点Skn-Imotif2GTCAT535,1913植物胚乳形成有关TGACG-motif4TGACG436,954 1135,1316茉莉酸应答元件Circadian2CAANNNNATC253,298节律控制应答元件
2.根特异植物表达载体PCAMBIA1900的构建根据已测序的甘蔗己糖转运蛋白基因(PST2a)基因启动子序列，设计在5’端加上 BamH I 酶切位点的上游引物 Pl (5，-GGATCCGGCATCTCGGCTTTCTACG-3，)和在 3，端加上 NcoI 酶切位点的下游引物P2 (5，-CCATGGCGACCAAGAGCCAACTGAAG-3’ )。通过PCR反应扩增启动 子目的片段，回收PCR产物，经测序无误后再用BamH I和NcoI双酶切该产物和植物表达载 体PCAMBIA1301，并将酶切获得的含有两个酶切位点的启动子片段和pCAMBIA1301载体大 片段连接获得含有PST2a基因启动子的植物表达载体PCAMBIA1900。(图1)二、PST2a基因启动子的功能鉴定将pCAMBIA1900转入农杆菌菌株EHA105中，转化甘蔗愈伤组织，通过分化筛选培 养，获得转基因植株。待转基因甘蔗植株长至成熟期，取其根、茎，叶组织，进行组织化学染 色和显微观察，证明该启动子具有甘蔗根特异表达的特性。本发明提供一种甘蔗根特异高效表达启动子序列及其植物表达载体，该启动子以 其取代植物表达载体PCAMBIA1301上的组成型CaMV35S启动子，构建一个新的植物表达载 体，利用该载体对甘蔗进行遗传转化，该启动子具有组织特异表达功能，该启动子的获得， 对甘蔗抗病虫、抗逆境等遗传改良的研究具有重要意义。
图1为含有PST2a基因启动子的植物表达载体pCAMBIA1900示意图。
图2为转基因甘蔗根的GUS染色图。
图3为转基因甘蔗根的GUS染色图。
图4为转基因甘蔗根的GUS染色图。
图5为转基因甘蔗茎的⑶S染色图。
图6为转基因甘蔗叶的GUS染色图。
图7为非转基因甘蔗根的GUS染色图。
图8为非转基因甘蔗茎的⑶S染色图。
图9为非转基因甘蔗叶的GUS染色图。
具体实施例方式下面用实施例对本发明做进一步说明。1.甘蔗叶片基因组DNA的提取取甘蔗叶片约lg，用液氮研磨成粉末状，加入2ml已预热的2% CTAB提取缓冲液 中，65°C温浴1小时；4°C、10000r/min离心2_3分钟，将上清转至另一离心管中，加入等体 积氯仿异戊醇(24 l)，10000r/min离心10分钟；取上清液加入等体积的异丙醇沉淀， 室温放置30min ； 12000r/min离心lOmin，以70%的酒精洗涤2次，晾干，溶于加有RNAse的 TE缓冲液中，37°C温浴30min;加入等体积酚氯仿异戊醇(25 24 1)，轻轻颠倒、混 勻，12000r/min离心IOmin ；取上清液加酚氯仿异戊醇重复抽提1次；在上清中加入等 体积的异丙醇，混勻，室温放置半小时，12000r/min离心10分钟，去上清，沉淀用70%的酒 精洗涤2次，晾干，溶于50 μ ITE缓冲液中。2.基因组DNA步行和扩增
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用几种限制性内切酶Hindlll、EcoRI, PstI, XbaI分别对甘蔗基因组DNA进行 酶切消化。50μ1反应体系含IX反应缓冲液，5ygDNA和20u的限制性内切酶，37°C保 温12小时；加入等体积的氯仿，颠倒混勻，室温、12，000r/min离心5min ；取上清，加入2 倍体积的无水乙醇，1/10体积的3mol/L醋酸钠NaAc (pH5. 2)，混勻，-20 °C静置30min， 15，000r/min离心15min;沉淀用70 %乙醇洗涤两次，晾干，10 μ 1灭菌蒸馏水溶解；取 5μ1用于连接，连接体系为基因组酶切产物5 μ 1，盒式(Cassette)接头2.5 μ 1，连接 酶 I (LigationSolution I ) 15 μ 1，连接酶 II (Ligation Solution ΙΙ)7·5μ1，总体积 30 μ 1，混勻后16°C连接过夜，反应完成后，用乙醇沉淀回收DNA，连接后的产物溶于10 μ 1 灭菌蒸馏水，该加接头的甘蔗基因组酶切产物作为以下PCR扩增的模板。进行初级PCR 50 μ 1反应体系包含2 μ 1 DNA连接产物，1 X反应缓冲液，0. 5 μ 1 LA Tap 酶(5υ/μ 1)，8μ 1 dNTPs (各 2. 5mM)，1 μ 1 引物 Sl，ly 1 引物 Cl。反应程序为1 个 循环，94°C 5min ；30 个循环，94°C lmin,55°C 2min,72°C 4min ； 1 个循环，72°C 7min。将初级 PCR产物稀释50倍。进行次级PCR。50 μ 1反应体系包含1μ 1稀释的初级PCR产物，1 X反应缓冲 液，0. 5 μ 1 DNA 聚合酶(LA Tap) (5U/ μ 1)，8 μ 1 核苷酸混合物 dNTPs (各 2. 5mM)，1 μ 1 引 物S2，lyl引物C2。反应程序为1个循环，94°C 5min ;30个循环，94°C lmin，56°C 2min， 72°C 4min ；1个循环，72°C 7min。所扩增的PCR产物用1. 2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测， 结果由HindIII产生的DNA库中扩增出约2000bp的片段，从凝胶中纯化回收目的产物。将 纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，挑取阳性克隆，交 上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。3.序列分析通过启动子预测(Promoter predictions)等软件进行基础启动子的分析，结果表 明在 540-590bp、908-958bp、1575-1625bp、1652-1702bp、1894-1944bp 存在五处基础启动 子区。该启动子具有高等植物启动子应具有的调控元件，如TATA盒、CAAT盒、转录起始位 点及其他调控元件(表1)。4.根特异植物表达载体pCAMBIA1900的构建根据已测序的甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a基因启动子序列，设计在5’端加上 BamH I酶切位点的上游引物Pl (5’ -GGATCCGGCATCTCGGCTTTCTACG-3’ )和在3’端加上酶 NcoI切位点的下游引物P2 (5，-CCATGGCGACCAAGAGCCAACTGAAG-3’)。通过PCR反应扩增启 动子目的片段，50 μ 1反应体系包含1 μ IDNA稀释的初级PCR产物，IX反应缓冲液，0.5μ 1 DNA聚合酶LATap (5U/ μ 1)，8 μ 1核苷酸混合物dNTPs (各2. 5mM)，1 μ 1引物P2，1 μ 1引物 Ρ2。反应程序为1 个循环，94°C 5min ；30 个循环，94°C lmin，56°C 2min，72°C 4min ；1 个循 环，72°C 7min。回收PCR产物，经测序无误后再用BamH I和NcoI双酶切该产物和植物表 达载体pCAMBIA1301，50y 1反应体系包含回收PCR产物或pCAMBIA1301质粒DNAlOul， 缓冲液Buffer E 5ul，BamHI 5ul，NcoI 5ul，BSA(IOO)O. 5ul，用无菌水将反应体系补充至 50yL。37°C水浴反应3小时后，用胶回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)回启动 子片段和PCAMBIA1301双酶切载体大片段，琼脂糖凝胶电泳检测回收结果。将酶切获 得的含有两个酶切位点的启动子片段和PCAMBIA1301载体大片段连接获得含有PST2a基 因启动子的植物表达载体。反应体系如下7ul启动子目的片段DNA，Iul pCAMBIA1301双酶切载体，2ul连接酶缓冲液lOXligase buffer, Iul T4DNA连接酶。16°C连接过夜后，将 连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，用BamH I和NcoI双酶切鉴定重组子，命名为 PCAMBIA1900。5.冻融法转化植物表达载体pCAMBIA1900至ΕΗΑ105中“冻融法”将植物表达载体pCBI1900导入农杆菌(ΕΗΑ105)中，具体操作为向农 杆菌(ΕΗΑ105)感受态细胞中加入1 μ g纯化的Ti质粒DNA，混勻，冰上放置5min，置于液氮 速冻5min，立即用37°C水浴热激5min，加入800 μ L YEP液体培养基。在28°C缓慢振荡培 养(< 200r/min) 2_3h。IOOOOrpm离心50s,吸去部分上清，剩余200 μ L菌液重悬菌体，把 菌液分别涂布于含链霉素(Str) 50ug/ml，利福平(Rif) 50ug/ml，卡那霉素(Km) 50ug/ml的 YEP固体培养基上，28°C倒置培养约48h，可见抗性菌落长出。挑取抗性菌落于相应抗生素 的YEP培养基中，摇菌24-48h，小量提取质粒进行酶切鉴定。PST2a基因启动子的功能鉴 定1.农杆菌介导法转化甘蔗1. 1外植体的处理以田间材料为转化体，选取生长健壮植株的尾稍部分，逐层剥去外层老叶，再取其 距顶端生长点约IOcm左右的幼叶组织作为外植体。外植体先用75%的乙醇浸泡30sec后， 再用0. 1 %的升汞处理12min，后用无菌水洗3_4次，放在无菌的滤纸上吸干水珠，再小心剥 去最外一层叶片组织，然后将其横切成0. 2 0. 5mm厚的薄片并接种于Ml固体培养基上， 25°C黑暗培养。20天左右长出胚性愈伤组织，可直接用于转化。1. 2农杆菌菌液的准备将经PCR鉴定的农杆菌在相应抗生素的YEP平板上划线，挑取单菌落接种到 5mLYEP (含有 Kan 50 μ g/mL, Str50 μ g/mL, Rif 50 μ g/mL)的液体培养基中，于 28 °C， 200rpm振荡培养至对数生长期(约24h)，于150mL三角瓶中扩大培养到IOOmL含有相同抗 生素的YEP培养基中，培养至OD为0. 6左右(IOh)，将菌液转移到离心管中，4°C，5000rpm 离心5min，弃上清，吸干残液，用等体积(IOOmL)的MR液体培养基(含150 μ mol/LAS)重悬 菌体，最后置于28°C，200rpm激活2h，诱导细菌Vir基因的表达，作为转化材料的浸染液。1. 3农杆菌菌液浸染愈伤组织及共培养将甘蔗胚性愈伤组织置于准备好的农杆菌工作菌液中浸泡约30-40min，期间用 无菌镊子轻轻搅动愈伤组织。浸染30min后，用无菌漏勺滤去菌液，然后将胚性愈伤组织 转移到滤纸上，在超净工作台中晾干，直至材料表面干爽、无水膜，并把材料组织块切成 0. 3-0. 5cm的小块，然后转到含100 μ mol/L的AS的MS固体培养基上，22°C左右黑暗共培养 3-4d。共培养后用含CarfOOmg/L的无菌水洗涤胚性愈伤组织一次，再用无菌水洗2_3次， 最后再用MS液体培养基洗一次，置于无菌滤纸上在超净工作台中吹晾到材料干爽后，将胚 性愈伤组织转移到含有CarfOOmg/L的M2培养基上，28°C光下培养。1. 4农杆菌浸染后的愈伤组织分化成苗28°C，M2培养基上光下培养浸染过的胚性愈伤组织45天左右便能分化出小苗，期 间需要经常更换新鲜M2培养基，约15天左右更换一次，可降低农杆菌污染几率，同时还要 剔除褐化和被农杆菌严重污染的组织块。1. 5甘蔗小植株的筛选培养及定植
挑选0. 5-3cm高的小苗，转移到含有PPT2. 5-3. 5mg/L的M3培养基上筛选培养50 天左右，期间经常更换新鲜M3 (加PPT)培养基，约20天左右更换一次，并逐步进行分株。将 最后剩余的抗性小苗按编号独立培养于M3 (不加PPT)培养基上，当抗性小植株长到4-7cm 后，按编号剪取小苗叶片，约3-4cm、20mg左右，微量提取DNA，进行Bar和⑶S基因双重PCR 检测。双重PCR阳性抗性苗经壮苗培养后，移植于沙床上。各培养基配方①Ml :MS+2,4-D lmg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 8g/L，pH 5. 8 ；②M2 :MS+6-BA lmg/L+KT 0. 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 8g/L, pH 5. 8 ；③M3 :MS+IBA5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 卡拉胶 8g/L，pH 5. 8 ；④MR 1/5MS 大量元素 +MS 其他成分 +2. 4Dlmg/L+IOmmol/L 果糖 +10mmol/L 葡萄 糖+30g/L蔗糖(固体培养基应加入卡拉胶8g/L)，pH 5. 3。2.⑶S组织化学染色取成熟转基因及非转基因甘蔗植株的根、茎(切片)、叶，放入IOml大离心管中， 加入 GUS 染色液[2. Ommol/L K3 [Fe (CN) 6], 2. Ommol/L K4 [Fe (CN) 6]，10mmol/L EDTA_Na2， 0. 辛基苯基聚氧乙烯醚(TritonX-100)，0. 5mg/ml 5-溴-4氯-3-吲哚葡萄糖苷 (X-Gluc)，氯霉素100 μ g/m，以50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7. 0)配制]，材料全部浸泡在染 液中，盖好盖子防止挥发。37°C培养箱中温育2h至过夜(时间可延长至1-2天)。取出材 料转入70%酒精中脱色2-3次，直至阴性对照材料呈白色为止。取出材料放在载玻片上，置 于载物台上，用光学显微镜观察。在白色背景下的蓝色斑点即为GUS表达位点，并照相。染 色材料可浸入标准固定液(70%酒精90ml，福尔马林5ml，冰醋酸5ml)中保存。在组织化学染色试验中，转基因植株的根(附图2-4)被染成蓝色，茎(附图5)、叶 (附图6)均未被染成蓝色，非转基因植株的根(附图7)、茎(附图8)、叶(附图9)均未被 染成蓝色。说明用含有甘蔗己糖转运蛋白基因PST2a启动子区的表达载体pCAMBIA1900转 化甘蔗材料，GUS基因只在根中表达。说明该启动子是一个根特异性启动子。
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权利要求
一种分离的甘蔗根特异表达启动子，其特征在于具有序列表<400>1中的序列。
2.一种甘蔗根特异高效表达载体，其特征在于利用了权利要求1所述的甘蔗根特异表 达启运子驱动目的基因表达的植物表达载体。
3.根据权利要求2所述的甘蔗根特异高效表达载体，其特征在于用权利要求1所述的 甘蔗根特异高效表达启动子置换植物表达载体PCAMBIA1301上的CaMV35S启动子，构建成 在启动子下游含有GUS基因的甘蔗根特异高效表达载体。
全文摘要
本发明涉及甘蔗根特异高效表达启动子序列及其植物表达载体，该启动子长1968bp，以其取代植物表达载体pCAMBIA1301上的组成型CaMV35S启动子，构建一个新的植物表达载体，命名为pCAMBIA1900。利用该载体对甘蔗进行遗传转化，对转基因植株的不同组织进行GUS组织化学染色显示，该启动子具有组织特异表达功能，即只在根中表达。该启动子的获得，对甘蔗抗病虫、抗逆境等遗传改良的研究具有重要意义。
文档编号C12N15/113GK101948833SQ20101018483
公开日2011年1月19日 申请日期2010年5月13日 优先权日2010年5月13日
发明者张树珍, 杨本鹏, 王文治, 蔡文伟, 马滋蔓 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所