专利名称：一种融合蛋白HABP-mKate及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，涉及一种融合蛋白HABP-mKate及其制备方法和应用。 涉及利用分子克隆和基因优化的手段在大肠杆菌中生产可溶性融合蛋白HABP-mKate。另外 涉及如何合成优化的基因序列、以及如何将合成的基因序列导入表达载体。另外还涉及诱 导转化有融合蛋白HABP-mKate基因的大肠杆菌可溶性表达HABP-mKate蛋白的方法、以及 如何从细菌可溶性上清液中纯化明质酸结合蛋白。另外还涉及如何鉴定HABP-mKate对表 达HA的细胞以及活组织的特异性吸附的方法。
背景技术：
透明质烷(hyaluronan)又叫透明质酸(hyaluronic acid,HA)是天然的线性聚合 物，其在维持组织细胞外基质的水分中起着重要的作用，同时也参与了细胞的黏附和支持 细胞的迁移。另外，HA与透明质酸结合蛋白(hyaluronan-binding protein,HABP)以及细 胞膜上的受体相互作用起着各种各样的生物学功能。在最近的一段时间里，HA被描述为一 个新的肿瘤治疗的靶点。但是由于HA保守的结构以及存在各种生物体中，很难制备针对HA 的抗体应用免疫学的方法去检测。然而，随着HABP的发现，并且其可以特异的结合HA，人们 一直在尝试利用HABP来检测透明质酸酶的指标。虽然，利用HABP与HA特异结合的方法间 接的检测HA已经被用于临床的诊断。但是，目前的HABP主要从组织中纯化或哺乳动物中 表达纯化得到，但都受到成本的因素无法大规模生产，由于HABP价格昂贵，让其进一步的 推广和临床的大范围应用带来困难。自从绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)在上个世纪被从水母中发 现和克隆出以来，人们利于基因工程的方法把编码GFP的基因序列重组到各种物种当中， 制作出了各种各样的嵌合体(Chimeras)，这些嵌合体不但能够保持最初的生物个体的特征 并且具有GFP的一切特性。虽然绿色荧光蛋白可以产生相应的荧光而且荧光也非常稳定， 但是激发光的最大值与紫外线区非常接近。因为紫外光需要特殊的光学考虑而且对细胞有 毒害作用，所以通常不适宜活细胞光学观察。然而，人们发现了一个人GFP的同源类似物， 其激发波长位于远红外区域，和GFP相比，该蛋白具有很多优点，包括它的激发和发射光波 长，20分钟的快速激发时间并且其发生光波长在620匪之上，最重要的是该荧光蛋白是单 体，没有复杂的空间结构，我们把它叫做mKate，非常合适和其他蛋白融合表达。到目前为止，用于检测HA的蛋白HABP都是从富含HA的组织中直接纯化得到的。 虽然利用大肠杆菌系统表达重组蛋白已经很成熟，但是由于HABP很容易聚合，人们利用大 肠杆菌得到可溶性表达的HABP才刚刚成功。
发明内容
为了解决目前HABP直接提取成本高，不能大规模生产的不足，本发明利用基因工 程技术诱导表达融合蛋白HABP-mKate，解决了现有技术的不足。本发明的基本原理是利用基因优化的手段，对HABP以及mKate的基因序列进行密
3码子偏向性分析和优化，优化后合成的基因序列用PCR的方法连接成融合基因，同时在两 个优化的基因之间用linker加以连接。连接后的融合基因转化到大肠杆菌中进行诱导表 达，纯化目的蛋白，我们把这种蛋白叫做HABP-mKate。本发明所说的融合蛋白HABP-mKate，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。上述所说的融合蛋白HABP-mkate可通过下述步骤制得首先通过基因优化软件 对HABP和mkate的基因序列进行优化，优化后的基因序列使用重叠PCR的方法体外合成， 并在两端添加相应的酶切位点，克隆至PET-15b表达型载体中，转化BL21-plus宿主菌，用 0. ImM的IPTG进行诱导表达，表达菌经超声破碎后分离得到上清，将分离得到的上清使用 0. 22um孔径的滤膜过滤，再使用镍柱进行亲和纯化，0. 5M的咪唑缓冲液洗脱，获得的目的 蛋白HABP-mKate。目的蛋白经聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定，纯度大于90%，测定蛋白质浓度 并计算得到的产率为2mg/L。本发明人还公开了融合蛋白HABP-mKate在检测肿瘤组织透明质酸表达量的应 用。具体的方法是将肿瘤组织的石蜡切片经脱蜡和PBS洗涤后，与lug/ml的HABP-mKate 在4°C中孵育过夜，经PBS洗涤四遍后用荧光显微镜观察，用Spot软件进行图象分析。对照 组分别为相同浓度的HABP和mKate。本发明利用基因优化的手段对HABP和mKate的基因序列使用基因优化软件对其 优化，在不改变基因所编码的蛋白质序列的情况下，对上述基因进行大肠杆菌所使用的密 码子进行基因偏向性优化，优化后的基因应用PCR的方法加以连接成一个融合蛋白基因， 同时在上述两个优化后基因之间用比较柔软的linker加以连接(GGGGSGGGGSGGGGGS)(图 2)。为了方便我们后期的基因克隆，我们在PCR引物的两端分别加上特异性的限制性酶切 位点。另外，为了方便纯化，我们选用PET-15b做克隆载体，这样我们就可以利用载体上的6 个组氨酸的标签进行纯化(图1)。纯化得到的重组蛋白进行12% SDS-PAGE凝胶分析(见 图3)，HA结合能力分析，分析性凝胶过滤试验检测HABP-mKate与HA复合物的形成，活体细 胞染色以及组织切片染色等方法验证了该融合蛋白对HA有特异性的结合，并且融合表达 的mKate在激发光下仍旧可以发出红色荧光。本发明利用分子克隆的手段结合基因优化，在大肠杆菌中可溶性表达的融合蛋白 HABP-mKate，不仅保持了对HA的结合能力，而且同时具有红色荧光蛋白的特性，可直接用 于检测肿瘤组织中的HA的表达，与其他的检测HA的方法相比，具有制备简便，成本低及检 测灵敏和特异。
图1基因表达载体PET_15b的限制性酶切图谱图2. HABP-mKate融合蛋白构建的模式3. 12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析融合蛋白HABP-mKate的表达以及纯化情况。 12% SDS-PAGE分析纯化的融合蛋白HABP-mKate，M 标准的SDS-PAGE marker,泳道1 细胞 裂解液，泳道2 细胞裂解液的沉淀，泳道3 细胞裂解液的上清，泳道4 纯化的目的蛋白。图4.融合蛋白HABP-mKate的吸收光和发生光波长图5.融合蛋白HABP-mKate对HA的结合能力分析。剂量依赖的HABPiKate对固 定在微孔板上的HA的结合；为空中同时加入游离的轻分子量的HA24与HABP-mKate竞争结合HA;空白对照。图6.融合蛋白HABP-mKate对特异表达HA的4T1细胞的结合能力分析。 HABP-mKate对表达HA的4T1细胞的染色(I)和三组对照(II)加入透明质酸水解酶，(III) 加入游离的中分子量的(HW-HA) ； (IV)加入mKate作为对照。图7.融合蛋白HABP-mKate对特异表达HA的组织C26的结合能力分析。 HABP-mKate对表达HA的c26组织的染色分析(1)和5组对照(2)加入硫酸软骨素；(3) 加肝素；⑷加透明质酸水解酶；(5)加入游离的中分子量的(HMW-HA) ； (6)加入mKate作 为对照。图8.不同剂量的融合蛋白HABP-mKate对HA结合量的分析。不同剂量的融合蛋白 HABP-mKate 1 μ g/ml (Al)，10 μ g/ml (A2)，25 μ g/ml (A3)对 HA 结合量的分析和只加 mKate 的对照(Bi，B2，B3)。图9是HABP-mKate稳定性实验。
具体实施例方式本发明利用基因克隆的方法，把HABP的基因序列(NC_000068. 6)和红色荧光蛋白 mKate (EU383029. 1)相融合，利用基因优化的方法，在大肠杆菌中生产出特异结合HA的融 合蛋白HABP-mKate，实验表明HABP-mKate对HA有很强的特异结合能力，同时HABP-mKate 在相应的激发波长下可以发出红色荧光，大大方便了直接观察。实施例一融合蛋白HABP-mKate的制备1.基因的优化和合成对HABP和mKate的氨基酸序列进行连接，中间加入linker (见图2)，然后把连 接后的HABP-mKate氨基酸序列(SEQ ID NO. 2)输入到IDT基因优化软件(http://www. idtdna. com/)对其进行密码子的偏向性分析(大肠杆菌)，选择大肠杆菌表达系统中常用 的密码子，对该氨基酸序列进行优化，得到HABP-mKate氨基酸序列相对应的基因序列(SEQ ID NO. 1)。该基因序列输入 gene2oligo (http://berry. engin. umich. edu/gene2oligo/) 后得到相对应的Oligo，这些Oligo经重叠PCR的方法体外合成HABP-mKate融合基因，在 HABP-mKate融合基因的两侧选择设计PCR引物，并用化学合成法合成两条，分别为Pl TTCATATGGGTGTTTATCACCGCG (5-引物含 Ndel 限制性酶切位点)，P2 :TTGGATCCTTATTTATGGCCCAGTTTAGAGGGCAG (3-引物含 BamHl 限制性酶切位点)， 以上述重叠PCR的产物为模板，用引物P1、P2以扩增条件为95°C ;30秒、59°C 40秒、72°C 55 秒，30个循环PCR扩增HABP同时在其两端添加相应的酶切位点。最后连接好的HABP-mKate 融合基因克隆到PET_15b(Novage ；San Diego, CA)的Ndel和BamHl的两个限制性酶切位点 之间，重组质粒所含基因HABP-mKate序列经测序证实与优化后的HABP-mKate基因结果一 致(SEQ ID NO. 1)。2.目的基因的可溶性表达我们把带有目的基因的克隆，转化到BL21_Codon plus (DE3) -RIPl (Stratagene LaJolla, CA)，等到0D600达到0. 6和0. 9之间时，用终浓度是0. ImM的IPTG进行低温过夜 诱导(23摄氏度)。3.目的蛋白的纯化
诱导的含有目的蛋白的细菌被离心收集，超声破菌，离心收集上清。为了提高目 的蛋白的纯化纯度，我们对传统的纯化his融合蛋白的方法进行了相关的改进，在诱导表 达后的大肠杆菌上清中加入β-巯基乙醇(使终浓度为5mM)。然后利用含有300mMNaCl， 20mM Tris-Hcl和40mM的咪唑缓冲液把目的蛋白结合到HIS Trap FF亲和柱子上，让后用 含有300mM Nacl, 20mM Tris-Hcl和500mM的咪唑缓冲液把目的蛋白洗脱下来。最后用脱 盐柱去除咪唑，把目的蛋白溶解在PBS缓冲液中备用。4.融合蛋白HABP-mKate的吸收光和发生光波长分析为了验证我们制作的融合蛋白中的mKate的吸收光波长以及发射光波长是否发 生改变，我们对纯化出的HABP-mKate进行了分析。实验结果如图4，表明HABPiKate具有 585nm的吸收光波长和620nm的发生光波长。实施例二1.融合蛋白HABP-mKate对HA的结合能力分析为了检测融合蛋白HABP-mKate对HA的特异性结合能力，我们把浓度lmg/ml的HA 蛋白(Sigma，St Louis, M0)在室温的条件下过夜包被到微孔板上，接着每孔用PBS洗涤三 遍之后用0. 5%的casein室温封闭2小时。这时我们在上述孔中分别加上由实施例一制得 的 HABP-mKate (0. 05-10ug/ml), HABP-mKate 和自由的低分子量的 HA (HA24)(来源于 sigma 公司)以及和空白作对照，结果如图5，只有HABP-mKate时0D650高达0. 45，然而当有HA24 存在时或者空白对照的0D650仅仅达到0. 1左右，说明融合蛋白HABP-mKate对HA有特异 的结合能力。2.融合蛋白HABP-mKate对特异表达HA的4T1细胞的结合能力分析为了在细胞水平上进一步的验证融合蛋白对HA有特异的结合能力，我们培养特 异性表达Ha的4T1细胞株(UCSF cell culture facility)。当我们把融合蛋白添加到 细胞培养液中时，发现融合蛋白HABP-mKate可以结合到4T1细胞上。为了进一步验证 HABP-mKate对细胞的结合是HABP-mKate与细胞表达的HA的特异的结合我们设计了两个对 照组。如图6所示，当在细胞的培养液中添加透明质酸溶解酶或者处于自由状态的大分子 量HA时，可以一定程度上的竞争HABP-mKate对细胞表达的HA的特异结合，同时，我们在上 述细胞培养液中只添加mKate时，也没有发现mKate对HA的特异性结合，说明HABPiKate 对细胞表达的HA具有特定的结合能力。3.融合蛋白HABP-mKate对特异表达HA的组织C26的结合能力分析本发明利用组织化学染色说明采用HABP-mKate检测组织中HA表达的可行性。所 用组织为C26结肠癌组织(由华中科技大学医学院免疫学系沈关心教授赠送)，经脱腊后与 lug/L的HABP-mKate/PBS —起4°C孵育过夜，第二天用PBS洗涤四次，每次1分钟，直接在荧 光显微镜下观察。对照组分别为(2)HABP-mKate和硫酸软骨素(lmg/ml) ； (3)HABP-mKate和肝素(lmg/ml)； (4) HABP-mKate 和透明质酸酶(300U/ml) ； (5) HABP-mKate 和高 分子量透明质酸(HMW-HA，10mg/ml) ； (6)单一 mKate，操作步骤同HABP-mKate。如图7所示，在实验组中发现HABP-mKate对表达HA的结肠癌组织C26有较强的 结合能力，且这种结合能力不被HA的类似物如高浓度硫酸软骨素，肝素破坏；只有当结肠 癌组织预先用透明质酸酶处理后，组织中的HA被破坏，或额外加入高浓度的HA作为竞争物 的情况下，HABP-mKate结合C26癌组织中的HA能力才大大下降，荧光显微镜下显示组织切
6片的红色荧光大大下降，表明HABP-mKate可特异性结合c26组织中的HA分子，这种结合能 力不受HA类似物如硫酸软骨素、肝素等的干扰。4.融合蛋白HABP-mKate检测HA敏感性分析为了判断利用HABP-mKate检测组织中HA的敏感性，分别利用三个不同的浓度 HABP-mKate对人脐带组织切片(由南京鼓楼医院病理科提供)进行染色分析将人脐带 组织冰冻切片经PBS洗涤三次后，分别与1 μ g/mlUO μ g/ml、25 μ g/ml的HABP-mKate或 mKate在4°C孵育过夜，第二天用PBS洗涤四次后在荧光显微镜下观察，结果如图8所示，即 使低的浓度的HABP-mKate (1 μ g/ml)就能够观察到较强的红色荧光，且随着HABP-mKate浓 度的增加，结合人脐带组织的荧光越强，表明HABP-mKate对HA的结合不仅具有特异性，同 时具有高度灵敏性，在极低浓度下如1 μ g/ml就显示足够的红色荧光，而没有HABP作靶向 的mKate即使在高浓度也不能结合人脐带组织中的HA，荧光显微镜下表现为无或仅有微弱 S^yt ο ο融合蛋白HABP-mKate检测HA高敏感性为HABPiKate作为检测HA的常规试剂奠 定了基石出。实施例三HABP-mKate的荧光稳定性试验为了判断HABP-mKate作为检测HA试剂的可行性，必须检测HABPiKate的荧光稳 定性步骤如下1.先摇IOOOml的含有HABP-mKate基因的细菌，0. IM IPTG诱导表达室温过夜，收 集后的细菌用PBS悬浮，经超声粉碎后离心获得上清，上清再经0. 45um的滤器过滤。所得 上清经镍离子柱纯化，PBS/O. 005M咪唑洗涤，PBS/O. 5M咪唑洗脱，洗脱后的蛋白质经透析 (PBS, IOKda的膜)后测定蛋白质浓度(0D280nm)，为0. 2mg/ml2.将浓度为0. 2mg/ml的HABP-mKate用PBS稀释到终浓度为10 μ g/m,取100 μ 1 置96孔板上，96孔荧光读板机读荧光值；3.同时将0. 2mg/ml的HABPiKate放于4°C，无遮光，半年后按上叙步骤再次测定 荧光强度；两次的荧光强度如图9所示，HABP-mKate的荧光强度在半年之内没有减弱，表明 HABP-mKate除可特异性结合组织中天然的HA外，还具有较强的稳定性，为HABP-mKate的更 大范围应用提供了依据。
权利要求
一种融合蛋白HABP mKate，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种制备权利要求1所述的融合蛋白HABP-mKat的方法，其特征在于，先通过基因优 化软件对HABP和mkate的基因序列进行优化，优化后的基因序列使用重叠PCR的方法体外 合成，并在两端添加相应的酶切位点，克隆至PET-15b表达型载体中，转化BL21-plus宿主 菌，用0. ImM的IPTG进行诱导表达，表达菌经超声破碎后分离得到上清，将分离得到的上清 使用0. 22um孔径的滤膜过滤，再使用镍柱进行亲和纯化，0. 5M的咪唑缓冲液洗脱，获得的 目的蛋白HABP-mKate。
3.权利要求1所述的融合蛋白HABP-mKate在检测透明质酸中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种融合蛋白HABP-mKate及其制备方法和应用。所说的融合蛋白HABP-mKate，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述的融合蛋白HABP-mKat的制备是先通过基因优化软件对HABP和mkate的基因序列进行优化，优化后的基因序列使用重叠PCR的方法体外合成，并在两端添加相应的酶切位点，克隆至PET-15b表达型载体中，转化BL21-plus宿主菌，诱导表达，表达菌经超声破碎后分离得到上清，将分离得到的上清使用滤膜过滤，再使用镍柱进行亲和纯化，0.5M的咪唑缓冲液洗脱，获得的目的蛋白HABP-mKate。所说的融合蛋白HABP-mKate可用于检测透明质酸。
文档编号C12N15/70GK101899118SQ20101018514
公开日2010年12月1日 申请日期2010年5月17日 优先权日2010年4月22日
发明者曹利民 申请人:曹利民