生产涎化低聚糖的方法

专利名称：：生产涎化低聚糖的方法
技术领域：
：本发明涉及一种大规模体内合成涎化低聚糖的方法用一个培养基培养一种微生物，可选地包含一个外源前体如乳糖，其中所述微生物包含编码CMP-Neu5Ac合成酶、唾液酸合酶、GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶和唾液酸转移酶的异源基因，其中编码唾液酸醛縮酶和ManNac激酶(MwKJ)的内源基因被敲除或者灭活。本发明也涉及这种微生物，其可以产生内部激活的唾液酸。
背景技术：
：N-乙酰神经氨酸(Neii5Ac)是氨基糖的唾液酸家族中最常见的成员。Neu5Ac经常作为末端糖被发现于细胞表面碳水化合物复合物，并且在很多生物过程例如细胞黏附以及毒素和病毒结合(Varki，1993)中扮演重要角色。Neu5Ac也是神经节苷脂的碳水化合物部分的一个主要成分，其在脑组织中非常丰富，在很多病理过程中被涉及到(Zhang&Kiechle，2004)。由于其重要的生物学功能，含有低聚糖的唾液酸吸引了相当大的兴趣，研发了很多方法来合成这种结构来进行基础研究以及潜在的治疗应用。但是，迄今还没有达到大规模的生产涎化低聚糖。由于很多的保护和去保护步骤，化学合成是不实际的，很多的努力被放在酶学和生物技术方法。唾液酸转移酶使用CMP-Neu5Ac作为活化的糖-核苷酸，通过鉴定在A"//中有很好表达的细菌唾液酸转移酶基因和模拟糖核苷酸生物合成的自然途径的多酶系统的设计，酶学合成涎化低聚糖的高效过程的发展成为可能(Gilbert等人，1998)。后来由于使用了活体细菌细胞来生产涎化低聚糖而产生了一个显著的改进(Priem等人，2002)。在这个方法中，涎化乳糖通过培养代谢工程化的大肠杆菌(&c&n'cWaco/D菌株细胞直接生产，该菌株过度表达a-2，3-唾液酸转移酶和CMP-Neu5Ac合酶的脑膜炎双球菌(A^^en'amew'"g"/cfoJ基因。该细菌生长于高细胞密度，以甘油作为碳源和能量源，提供外源的乳糖和Neu5Ac作为涎化乳糖合成的前体。在生长过程中，乳糖和Neu5Ac被￡.co//卩-半乳糖苷和Neu5Ac透性酶活性地内在化。为了防止乳糖和Neu5Ac被分解代谢，使用了无P-半乳糖苷酶和Neu5Ac醛縮酶的突变菌株。乳糖和Neu5Ac在细胞质中积聚，其中Neu5Ac被转化成CMP-Neu5Ac以进一步转移到乳糖上形成涎化乳糖(我们的欧洲专利EP1194584)。通过另外表达合适的糖基转移酶基因，这个系统被应用于神经节苷脂GM2和GM1的碳水化合物部分的生产(Antoine等人，2003)。多涎化的低聚糖(GD3和GT3糖)也通过这个方法及使用编码双功能a-2,3-和a-2，8-唾液酸转移酶的弯曲菌(。mpy/o6ac^)氾基因来生产(我们的美国专利申请US60/6卯，837和Antoine等人，2005)。通过这种微生物学方法大规模生产涎化低聚糖需要相当数量的唾液酸作为前体。唾液酸可从自然来源例如牛和鸡蛋黄中分离，但是产量较低，并且该方法不适合于大规模生产。唾液酸通常是以N-乙酰-甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸盐作为底物，由唾液酸醛縮酶通过酶法合成的。为了降低成本，ManNAc通常由N-乙酰葡萄糖胺的化学或酶学差向异构化来制备，N-乙酰葡萄糖胺是比ManNAc更便宜的底物(Lee等人，2004;Maru等人，1998)。虽然有这些改进，唾液酸成本仍然相对较高，这个成本阻碍了涎化低聚糖生产的较经济系统的发展。同时，像E.coZ/Kl和脑膜炎双球菌这样的菌株也能够产生CMP-Neu5Ac，但他们是病原性的，由于安全原因不能被用于生物技术过程。大多数其它细菌，包括￡.0^102，没有生物合成CMP-Neu5Ac的酶学机制，本发明的目标是，遗传工程操作非病原性菌株，其能够由内源UDP-GlcNAc产生CMP-Neu5Ac。按照本发明，我们设计了一个新的微生物系统来低成本地大规模生产涎化低聚糖，而不需要外源提供唾液酸。本发明的代谢工程化的微生物是活的、非病原性的，并能用于大规模的和工业培养过程。它们具有最优化的改造的途径，并去除了无效代谢循环，使得可以生物合成活化的CMP-Neu5Ac来作为体内唾液酸供体以形成涎化低聚糖。
发明内容本发明提供了一种通过发酵培养微生物生产涎化低聚糖的方法。特别地，本发明涉及一种合成带有一个或几个唾液酸残基的低聚糖的方法，而不需要向培养基中加入任何外源唾液酸，包括但不限于r神经节苷脂的低聚糖半体，选自GM3(3，涎化乳糖，Neu5Aca-3Gal|3-4Glc)以及包含GM3基序的低聚糖，GD3Neu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-4GlcGT3(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gaip-4Glc)GM2GalNAc(3隱4(Neu5Aca國3)Gaip-4GlcGM1Gal卩-3GalNAcf3-4(Neu5Aca隱3)Gal(3-4GlcGDlaNeu5Aca-3Gal|3-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Galp-4GlcGTlaNeu5Aca-8Neu5Aca-3Galj3-3Ga脆cP-4(Neu5Aca-3)Galp-4GlcGD2GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal|3-4GlcGT2Ga脆c卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca陽8Neu5Aca3)Gal(3陽4GlcGDlbGalp-3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGTlbNeu5Aca-3Gaip-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal|3-4GlcGQlbNeu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGTlcGal卩陽3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGQlcNeu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal(3-4GlcGPlcNeu5Aca-8Neu5Aca-3Galp-3GalNAcp-4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Galp-4GlcGDlaNeu5Aca-3Gal(3-3(Neu5Aca-6)GalNAc卩-4Gal(3-4GlcFucosyl-GMlFuca-2Gaip-3Ga脆c(3-4(Neu5Aca-3)Gal(3-4GIc通过将以上低聚糖半体与神经酰胺反应，所有的这些都可延伸至相应的神经节苷脂的生产。其它的涎化糖包括-(6，涎化乳糖，Neu5Aca-6Galp-4Glc)以及包含6，涎化乳糖的低聚糖-SGG六糖(Neu5Aca-3Gal卩-3GalNAcP-3Galct-4Gal卩-4Gal)-涎化四糖(Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc)-五糖LSTD(Neu5Aca-3Gaip誦4GlcNAc卩-3Gaip-4Glc)在一个特别的方面，本发明的过程基于活性摄入一个外源前体，例如单、双或三糖，更特别地，选自乳糖、半乳糖、卩-半乳糖苷和a-半乳糖苷例如globotriose(Gala-4Gal卩-4Glc)的外源性前体，细胞生长于另外一种碳底物，例如甘油或葡萄糖。"外源性前体"是指，与低聚糖的生物合成途径相关的、根据本发明被细胞内在化的化合物。同时提供了代谢工程化的微生物，其可以特别地产生以上涎化低聚糖而没有副产物，例如GA1、GA2、GA3、GA4和GA5;以及，为特异性生产GM1，分离自表达类似GM1神经节苷脂的脂低聚糖结构的空肠弯曲菌(C;/々wm')菌株的《///基因的应用，例如空肠弯曲菌菌株NCTCAccessionNo111168。图1显示了以代谢工程化的￡.^//菌株生产涎化乳糖。图2显示了以代谢工程化的菌株生产GM1糖时副产物的产生。图3显示GM2糖生物合成中副产物的形成。图4显示了UDP-Gal生物合成途径。图5显示了GD2糖生物合成中副产物的形成。图6显示了以唾液酸转移酶生产GTla的策略。图7显示了从外源乳糖生产LSTD糖(Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNacP-邓-4Gal)的代谢工程化途径。图8显示了从夕卜源globotriose生产SGG六糖(Neu5Aca-3Gaip-3GalNAc(3-3Gala-4Gal(3-4Gal)的代谢工程化途径。图9显示了生产涎化四糖(Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNac(3-4GlcNAc)的代谢工程化途径。图10是一个以持续乳糖饲养的DC7菌株的高细胞密度培养物的细胞内和细胞外部分的TLC分析。第一道乳糖、lacto-iV-neotetraose(LNnT)、lacto-^-neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3，4，5,6，7道加入乳糖后第0，7，23,31，47,54小时后所提取的细胞内部分。第8，9，10，11，12，13道:加入乳糖后第0，7，23，31，47，54小时后所提取的细胞外部分。涎化乳糖(2)以前已经证明如四糖LNnT—样迁移。图11显示了以持续乳糖词养的DC7菌株的高细胞密度培养物的涎化乳糖生产。(A)累积加入的乳糖，(口)细胞内涎化乳糖，(國)细胞外涎化乳糖，(-)细菌生长。图12是由含有pUC18-cst11和pBBR3-SS质粒的NF03菌株的高细胞密度培养物生产的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为3g/L。第1道.乳糖、lacto-//-neotetraose(LNnT)、lacto國7V"neohexaose(LNnH)禾示准溶液(每个为2mg/ml)。第2和3道加入乳糖后第7和24小时后所提取的细胞内部分。第4禾Q5道加入乳糖后第7和24小时后所提取的细胞外部分。图13是DC15菌株(pBS-cgtAII誦nst，pBBR3-SS-wbpP,pSU-cgtB)的高细胞密度培养物生产的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为5g/L。第1道孚L糖、lacto-7V-neotetraose(LNnT)、lacto-iV誦neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第7，20，30，44小时后所提取的细胞内部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第7，20，30，44小时后所提取的细胞外部分。涎化乳糖(1)和GM1糖(3)分别和LNnT和LNnH—样迁移。图14是DC21菌株(pBS-cgtAII-nst，pBBR3-SS-gne,pSU-cgtB)的高细胞密度培养物生产的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为5g/L。第1禾卩10道乳糖、lacto画7V陽neotetraose(LNnT)、lacto-iV-neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3,4，5道加入乳糖后第5，20，28，44小时后所提取的细胞内部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第5，20，28，44小时后所提取的细胞外部分。涎化乳糖(1)和GM1糖(3)分别和LNnT和LNnH—样迁移。图15是DC22菌株(pBS-cgtIII-cstAII,pBBR3-SS-gne，pSU-cgtB)的高细胞密度培养物生产低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为5g/L。第1禾口10道乳糖、lacto-iV-neotetraose(LNnT)、lacto腸iV-neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第7,20，30，44小时后所提取的细胞内部分。第6,7，8，9道加入乳糖后第7，20，30，44小时后所提取的细胞外部分。涎化乳糖(1)和GM1糖(3)分别和LNnT和LNnH—样迁移。图16是ZWT菌株(ZLKA,pBS-nst，pBBR3-SS-gne,pWKS-cgtAII)的高细胞密度培养物生产低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为5g/L。第1道乳糖、lacto-TV-neotetraose(LNnT)、lacto-7V-neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3，4道:加入乳糖后第0，7，22'小时后所提取的细胞内部分。第5，6，7道加入乳糖后第0，7，22小时后所提取的细胞外部分。图17是ZWU2菌株(ZWU,pBS-nst，pBBR3-SS-gne，pWKS-cgtAII)的高细胞密度培养物生产低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为5g/L。第1道孚L糖、lacto-iV-neotetraose(LNnT)、lacto画iV-neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第0，7，22，30小时后所提取的细胞内部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第0,7，22，30小时后所提取的细胞外部分。图18显示了分离自对照菌株ZWT(A)和ga/f7突变菌株ZWU2(B)的细胞内部分的化合物(2)的ESI质谱，峰为对应于GM2糖的m/z835和对应于半乳糖苷化类似物(GA2糖)的m/z794。图19是分离物的TLC分析，其来自一升ZWU1菌株培养物的细胞内部分的分离物。分离以0-1M的NaHC03梯度在Dowexl(HC(V形式)上进行。每个管的体积是10ml。分部A，B，C和D的产量分别是0.5g，0.85g，0.6g和1.2g。图20是NF17菌株(ZLKA，pBS陽cgtA-cstn,pSU-cgtB，pBBR陽SS-gne)的高细胞密度培养物生产的低聚糖的TLC分析。乳糖的最初浓度为5g/L。第1禾B10道乳糖、lacto-7V-neotetraose(LNnT)、lacto-iV隱neohexaose(LNnH)标准溶液(每个为2mg/ml)。第2，3，4，5道加入乳糖后第7，22，30，46小时后所提取的细胞内部分。第6，7，8，9道加入乳糖后第7，22，30，46小时后所提取的细胞外部分。遗传材料来源披露表l本发明中所用的基因、质粒、大肠杆菌(Esc/zeWcWflco//)菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>发明详述在第一个实施方式中，本发明涉及一种生产包括至少一个唾液酸残基的低聚糖的方法，以下称为涎化低聚糖，该方法包括这些步骤在培养基中培养一个微生物，可选地包含外源前体，其中所述微生物能够生产被内部激活的唾液酸，并包含编码CMP-Neu5Ac合成酶、唾液酸合酶、GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶和唾液酸转移酶的异源基因，其中编码唾液酸醛縮酶和ManNac激酶(7Va"v4J的内源基因被敲除或者灭活。在上述方法中以及基于末点，异源唾液酸转移酶可能选自例如由"W编码的a-2，3-唾液酸转移酶，a-2，3a-2,8-唾液酸转移酶和a-2，3-唾液酸转移酶(cW///)或a-2,6-唾液酸转移酶。异源CMP-Neu5Ac合成酶可能是^"，异源唾液酸合酶可能是"w^，异源GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶可能是^wC。wewzl，"ewS和恥wC基因可分离自在其细胞被中含有涎化结构的细菌菌株，例如空肠弯曲菌菌株ATCCAccessionNo.43438."朋r，wa"^，"awX"和"朋五基因是同一操纵子的部分，由DNA结合蛋白NanR调控并由Neu5Ac诱导(Kalivoda等人，2003)。因此，本发明的微生物也可以是"tmXE4r-。基因工程化的过度表达"o/5C4基因的菌株合成CMP-Neu5Ac过程中，作为中间体的Neu5Ac的生产因此可以诱导唾液酸代谢的途径，并且产生两条无效循环而减少细菌的CMP-Neu5Ac生物合成。第一个无效循环来自唾液酸合酶NeuB活性和唾液酸醛縮酶NanA的结合。第二个无效循环来自UDP-GlcNAc2差向异构酶NeuC和催化从ManNAc形成UDP-GlcNAc的四个酶NanKNanENagAGlmM和GlmU的组合作用。根据这里所建议的方法，Neu5Ac和ManNAc的降解被防止。这可通过破坏菌株中用于低聚糖生产的和Ma"《基因来有利地实现。在一个特定实施方式中，m^r，加"尺和"a"五基因被敲除或灭活。例如，这可通过除去所有的操纵子来实现。在一个优选的实施方式中，以上的微生物编码一个可促进乳糖摄入的蛋白并缺少代谢乳糖的酶。例如，在E.coli中，优选地，细胞优选为iacF+(p半乳糖苷透性酶)，JLmZ+$-半乳糖苷酶)和可选为(a半乳糖苷酶)。在另一个优选的实施方式中，培养基包含外源前体，选自例如乳糖、半乳糖、P-半乳糖苷酶和a-半乳糖苷酶例如globotriose(Gala-4Gal卩-4Glc)。本发明也涉及上述微生物以及一个含有上述微生物和选自乳糖、半乳糖、P-半乳糖苷酶和a半乳糖苷酶例如globotriose(Gala-4Gal卩-4Glc)的细胞培养基。定义术语"唾液酸"是指9碳的羧化糖家族的任何成员。最常见的唾液酸家族的成员是N-乙酰神经氨酸(2-酮-5-乙酰胺-3,5二脱氧-D-甘油画D-galactononulopyranos-l-onicacid(通常简写为Neu5Ac，Neu5Ac或NANA)。该家族第二个成员是N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中Neu5Ac的N-乙酰基团被羟基化。唾液酸家族的第三个成员是2-酮-3-脱氧-nonulosonicacid(KDN)(Nadano等人，(1986)乂5/o/.C7zew.261:11550-11557;Kanamori等人，《/S/o/.C/2ew.265:21811-21819(1990))。还包括，9-位取代的唾液酸例如9画氧-C广CV酰基-Neu5Ac，像9-氧-乳酰基-Neu5Ac或9-氧-酰基-Neu5Ac，9-脱氧-9-氟-Neu5Ac和9-叠氮-9-脱氧-Neu5Ac。对唾液酸家族的综述，可参见，例如，Varki，G^co&'o/ogy2:25-40(1992);爿cz'^:Ozew^/^Afeftafeo/z'smawdFwwc"o"，R.Schauer，Ed.(Springer國Verlag，NewYork(1992))。在涎化程序中唾液酸的合成和使用在国际申请WO92/16640中被公开，公布日为1992年10月1日。术语"双功能空肠弯曲菌(0^/^/o6ac妙CstII唾液酸转移酶"是指同时表现出a-2,3和a-2，8-唾液酸转移酶活性的唾液酸转移酶。在一些实施方式中，使用了来自ATCCAccessionNo.43438的CstII唾液酸转移酶。糖基转移酶的"受体底物"或"受体糖"是一个低聚糖半体，可以作为特定的糖基转移酶的受体。当受体底物与相应的糖基转移酶和糖供体底物和其它必要的反应混合物,成分接触时，反应混合物被温育足够长的时间，糖基转移酶把糖残基从糖供体底物转移到糖受体底物。例如，本发明的方法中所用的唾液酸转移酶的一个受体底物为乳糖Gaipi，4-Glc.糖基转移酶的"供体底物"是活化的核苷酸糖。这种活化的糖通常由糖的尿苷、鸟苷和胞啶单磷酸衍生物(分别为UMP，GMP和CMP)组成，或糖的双磷酸衍生物(分别为UDP，GDP和CDP)，其中单磷酸核苷或双磷酸核苷作为离去基团。例如，本发明的方法中所用的唾液酸转移酶的一个供体底物是CMP-Neu5Ac。"培养基"是指可用来支持本发明的方法所用的微生物生长的任何液体、半固体或固体媒介。在一些实施方式中，微生物为细菌，例如￡.co//。微生物的培养基是已知的，参见，例如，Sambrook等人和CurrentProtocolsinMolecularBiolopgy，F.M.Ausubel等人编，CWra^/Votoc,s，GreenePublishingAssociate,Inc.禾口JohnWiley&Sons,Inc.,合资(1998Supplemental)(Ausubel)。培养基可以是富培养基，例如Luriabroth或terrificbroth，或合成或半合成培养基，例如M9培养基。在一些优选实施方式中，生长培养基包含乳糖和唾液酸。-"商业规模的"是指在一个单独反应中对诞化糖产物的克数量级的生产。在优选的实施方式中，商业规模的是指生产大于大约50，75,80，90，或100，125，150，175或200克。术语"可操作的连接"是指一个核酸表达控制序列(例如启动子，，信号序列或转录因子结合序列的排列)和第二个核酸序列的功能性连接，其中表达控制序列影响对应于第二个序列的核酸的转录和/或翻译。这里所用的"异源的多核苷酸"或"异源基因"是指对特定宿主细胞来说为外源的，或者，如果是同源的，则经过对其原始形式的修饰。因此，一个细胞中的异源唾液酸转移酶基因包括对特定宿主细胞是内源、但经过修饰的基因。对异源序列的修饰可能这样产生例如以一个限制性酶处理DNA以产生DNA片段，其能够被可操作地连接到启动子。一些技术例如定点诱变对修饰异源序列也是有用的。"重组表达框"或简单的"表达框"是一个由重组或合成而产生的核酸结构，具有核酸元件，其可以影响与这些序列兼容的宿主的结构基因表达。表达框至少包括启动子，可选的转录终止信号。通常，重组表达框包括一个待转录的核酸(例如，一个编码所需要的多肽的核酸)和一个启动子。也可使用另外的必要的或在影响表达中有用的因子。转录终止信号、增强子和其它影响基因表达的核酸序列也可以被包括在表达框中。当多于一个的异源蛋白在微生物中被表达时，编码蛋白的基因可以在一个单独表达框中被表达或在相互兼容的多个表达框中被表达而保持在同一细胞中。如此处所用，表达框也包括被插入到宿主微生物染色体中的核酸结构。技术人员了解，将核酸插入到染色体中可通过同源重组实现。一个表达框可被构建来生产多于一个蛋白。该蛋白可被一个单一启动子序列调控，例如，操纵子。或者，多个蛋白可被具有单独的启动子和核糖体结合位点的核酸编码。术语"分离"是指材料充分地或实质上从和生物活性分子相互作用的成分脱离。对于本发明的细胞、糖、核酸和多肽，术语"分离"是指材料充分地或实质上从通常伴随该材料(如自然状态下所发现)的成分脱离。通常，本发明的分离的糖、低聚糖、蛋白质或核酸为至少大约50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%或85%纯，通常为至少90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97°/。，98°/。或99%纯，以银染的凝胶上的带亮度所测或其它测定纯度的方法所测。纯度或同质性可通过很多本领域已知的方法来指示，例如蛋白或和核酸样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后通过染色显色。对于一些目的，需要高分辨率，使用HPLC或类似的纯化方法。对于低聚糖，例如，涎化产物，纯度可用例如薄层色谱、HPLC或质谱来测定。术语"同一的"或"同一性"百分率在两个或多个核酸或多肽序列的情况下，是指两个或多个序列或亚序列，当通过下面的一种序列比对算法或通过外观检查被比较并作最大相关性排列时，具有相同的、或者具有特定比例的相同的氨基酸残基或核苷酸。词组"实质上相同"，在两个核酸或多肽的情况下，是指两个或多个序列或亚序列，当通过下面的一种序列比对算法或通过外观检査被比较并作最大相关性排列时，具有至少60%，优选为80%或85%，最优选为至少90%，91%，92%，93%，94%，95°/。，96%，97%,98%或99%的核苷酸或氨基酸残基的同一性。优选地，实质上同一性存在于长度为至少大约50.个残基的序列的区域，更优选的在至少大约IOO个残基的序列的区域，最优选地，该序列在至少大约150个残基上实质上相同。在最优选的实施方式中，序列在编码区域的整个长度实质上相同。对于序列比对，通常一个序列作为参考序列，测试序列与之比较。当使用一个序列比对算法时，测试和参考序列被输入计算机，如果必要，亚序列坐标被指定，序列算法程序参数被指定。然后序列比对算法基于所指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分数序列对比的最优化排列可这样实现，通过例如，Smith&Waterman的本地同源算法^^.Ma仇2:482(1981)，Needleman和Wunsch的同源算法，《/Mo/.￡z'o/.48'.443(1970)，Pearson和Lipman的寻找相似性方法，Proc.iVfl"，JcW.Sc/.U&485:2444(1988)，对这些算法的计算机化应用(WisconsinGenetics的软件包中的GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr"Madison,WI)，或者通过夕卜观检査(大体上可参见，CWe加/Votoco/sM/ecw/ar5油gy,RM.Ausubel等人编,Cw^re/^'GreenePublishingAssociate,Inc.和JohnWiley&Sons,Inc.，合资(1995Supplemental)(Ausubel))。适合于测定序列同一性百分率和序列相似度的算法的实例为BLAST和BLAST2.0算法，在Altschul等人(1990)/Mo/.215:403-410和Altschuel等人(1977)Wwc/e/c爿c^及仏25:3389-3402中分别有描述。实现BLAST分析的软件可通过NationalCenterforBiotechnologyInformation(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获f寻这个算、法包括，首先通过鉴定队序列中的W长度的短单词来鉴定高分值序列对(HSP),当与数据库序列中相同长度的一个单词比对时，其可匹配或满足正值阙值的分值T。T是指临近单词分值阙值(Altschul等人，如上)。这些最初的临近单词命中作为启动寻找更长的包含他们的HSP的种子。单词命中然后在两个方向沿着每个序列被延伸，只要累积比对分值可被增加。对于核苷酸序列，累积分值以M参数(一对匹配残基的奖励分值；总是大于0)和N(不匹配残基的惩罚分值；总是小于0)来计算。对于氨基酸序列，用一个分值矩阵来计算累计分值。当，累积比对分值从其所达到的最大值下降数量X;—个或多个负分值残基比对的积累导致累积比对分值到达零或零以下；或者，达到任何一个序列的末端时，在每个方向的单词命中延伸被中止。BLAST算法参数W，T和X决定了比对的敏感性和速度。BLASTN程序(对核苷酸序列来说)使用一个单词长度(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N二4作为默认，以及对两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用一个单词长度(W)为3，期望值(E)为10以及BLOSUM62分值矩阵作为默认(参见Henikoff&Henikoff,iVoc.A^/Jc^/.5W.89:10915(1989))。除了计算序列同一性百分率，BLAST算法也进行连个序列间相似度的统计学分析(参见，例如，Karlin&AltschuliVoc.Ato/.A^d5W.90:5873-5787(1993))。BLAST算法所提供的一个相似度测量为最小总概率(smallestsumprobability)(p(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间机会性发生匹配的概率的指示。例如，在一个对比中，当测试核酸相对于参考核酸的最小总概率小于大约0.1，更优选地小于大约0.01，最优选地小于大约0.001时，此核酸被认为是与参考序列相似。一个特定的多核苷酸序列的"保守性修改的变异"是指那些编码相同的或实质上相同的氨基酸序列的多核苷酸，或者如果该多核苷酸不编码氨基酸序列，则指实质上相同的序列。由于遗传密码的简并性，很多的功能上相同的核酸编码任何给定的多肽。例如，密码子CGU,CGC,CGA，CGG，AGA和AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在任何精氨酸被一个密码子指定的位置，可以将密码子更改为以上任何相应的密码子而不改变所编码的多肽。这种核酸变异为"沉默取代"或"沉默变异"，为"保守性修改的变异"的一类。除非另外指出这里描述的每个编码一个多肽的多核苷酸序列也描述了每个可能的沉默变异。因此，沉默取代是每个编码一个氨基酸的核酸的暗示特征。技术人员会认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常为蛋氨酸的唯一密码子)都可以通过标准技术被修改而产生一个功能上相同的分子。在一些实施方式中，编码酶的核苷酸序列在一个特定()中优选地被最优化表达。类似的，在一个氨基酸序列中，一个或几个氨基酸的"保守性氨基酸取代"，经不同的具有高度相似特性的氨基酸取代后，容易被鉴定为与特定的氨基酸序列，或者与编码一个氨基酸的特定核酸序列高度类似。任何特定序列的此种保守性取代变异是本发明的一个特征。在一个编码的序列中改变、加入或敲除一个单独氨基酸或很小比例的氨基酸(通常小于5%，更通常为小于1%)的个别的取代、敲除或增加为"保守性修改的变异"，其中的改变导致一个氨基酸被一个化学上相似的氨基酸所取代。提供功能上相似的氨基酸的保守性取代表在本领域是已知的，参见例如，Creighton(1984)/Vo^/ra,W.H.FreemanandCompany。双功能的唾液酸转移酶如上所注意的那样，本发明的方法中使用了双功能的唾液酸转移酶。编码这种酶的核酸分离自空肠弯曲菌，在U.S.专利号6,699,705和6,503,744和WO/02074942中有揭露。可以作为双功能的唾液酸转移酶来源的示例性空肠弯曲菌菌株包括OH4384(核酸序列在GenBankaccessionsAR271700和AX934425可以找到)，OH4382,O:IO(核酸序列在GenBankaccessionsAR271701(SEQIDNo1)，AX934427(SEQIDNo2)可以找到)，0:23和0:41(核酸序列在GenbankaccessionsAR271702(SEQIDNo3)禾卩AX934429(SEQIDNo4)可以找到)。应该理解，如上所定义的、对SEQIDNol，2，3，4的保守性修改的变异在这里也可以应用。宿主细胞本发明的重组细胞大体上这样制备:,U作或者获得一个编码特定感兴趣的酶的多核苷酸，将该多核苷酸置于启动子和其它合适控制信号控制的表达框中，然后将该表达框引入细胞。使用很多的方法可使多于一个的酶在同一个宿主细胞中被表达。例如，一个单独的染色体外载体可包括多个表达框，或者多于一个的兼容性染色体外载体可被用来保持宿主细胞中的表达框。表达框也可以通过本领域技术人员己知的方法被插入宿主细胞的染色体中。技术人员将会认识到，也可以将染色体外载体中的表达框和插入宿主细胞染色体的表达框结合起来使用。对宿主细胞的其它修改，如以下详细描述，可被用来增强所需要的低聚糖的生产。例如，该微生物可以是LacY+，以允许乳糖的活性运输。宿主细胞不需要是NanT+，因为根据本发明，唾液酸为内在产生。本发明的重组细胞大体上为微生物，例如，酵母细胞、细菌细胞或真菌细胞。合适的细胞的例子包括，例如，固氮细菌属(^zoto6w^(例女口棕色固氮菌(Av/"e/awA7)、假单胞菌属(/wez^fowo"os5^.)、根瘤菌属(i/^o6/wm^.A欧文氏菌属(五rvW"/as;.)、杆菌属(5acz7/ws链霉菌属(5^e/tomyces5^.)、埃希氏菌属C&c/^r/c/n'asp.)禾口克雷伯氏菌属(A7e^z'e^)，及众多其它的。细胞可以是任何类，包括酵母属(Saccharomyces)(例如酿酒酵母(51.cewv/w'ae))，假丝酵母属(Candida)(例如产朊假丝酵母(C.W!7&)、全细胞近平滑假丝酵母(C.para;^7o^)、克鲁斯假丝酵母(C.Arw^/)、多变假丝酵母(Cvem^7/s)、解脂假丝酵母(C./*o/W^)、涎沫假丝酵母(C.z^/"朋W^)、高里假丝酵母(C.gw/〃fmno"^)、白假丝酵母(C.a/6/cara)和土生假丝酵母(C./mm/co/a))，毕赤酵母属(Pichia)(例如粉状毕赤酵母(P/an'"wa)和奥默毕赤酵母(Po/zmm'))，球拟酵母属(Torulopsis)(例如白色球拟酵母(TOwAWfl)、圆球形球拟酵母(7:w/2flen'ca)、木质球拟酵母(j;x少/z'"m)、无名球拟酵母(7:/awato)和多变球拟酵母(J!vera加7/力)，德巴利(氏)酵母属(Debaiyomyces)(例如亚球形德巴利酵母(D.sw6g/ob(ww力、(Z).ca"to"////)、球形德巴利酵母(Z).g/oZjoswj)、汉逊德巴利酵母(D./wme"//)和日本德巴利酵母(DJ^o"/cw))，接合酵母(Zygosaccharomyces)(例如，鲁氏接合酵母(Zrawx/z')和拜氏接合酵母(Z.6m7//)),克鲁维酵母属OGuyveromyces)(例如马克思克鲁维酵母(K/mw^am^))，汉森酵母属(Hansenula)(例如异常汉森酵母(Ha"o附fl/a)禾H/fja&m')和酒香酵母属(Brettanomyces)(例如及/aw6/c^和异常酒香酵母(及a"owa/w5))。￡."//中所用的启动子包括17、trp或lambda启动子。同时提供了核糖体结合位点及优选地，一个转录终止信号。对于除了￡."//的原核细胞中异源蛋白的表达，需要一个能在特定的原核物种中作用的启动子。这样的启动子可由克隆自该物种的基因获得，或者使用异源启动子。例如，一个杂交的trp-lac启动子除了在Eco//还在杆菌属(B"a7/w)中作用。转化除E.coli之外的原核细胞的方法是已知的。例如，可被用来转化杆菌属的方法和表达蛋白的启动子在美国专利号6,255,706和美国专利号6,770,475中有教导。在酵母中，常规的启动子包括GAL1-10(Johnson和Davies(1984)Mo/.4:1440-1448)、ADH2(Russell等人(1983)所o/.258:2674-2682)、PH05(￡雄(9J(1982)6:675-680)以及MFa(Herskowitz禾口Oshima(1982)7TzeAfo/ecw/ar5/。/o^。/Kost5"acc/2flrra，ces(编者Strathern，Jones和Broach)ColdSpringHarborLab"ColdSpringHarbor,N.Y.pp.181-209)。另外一个适合应用于酵母的启动子是ADH2/GAPDH杂交启动子，如Cousens等人，Ge"e61:265-275(1987)所描述。对于丝状真菌，例如，曲霉真菌(Aspergillus)的菌株(McKnight等人，美国专利号4,935,349)，可用的启动子的例子包括，来自构巢曲霉"w^g///^"/^/a似)糖分解基因的启动子，例如ADH3启动子(McKnight等人，4:2093-2099(1985))和/p/A启动子。合适的终止子的例子为ADH3终止子(McKnight等人)。在一些实施方式中，多核苷酸被置于可诱导的启动子的控制下，其是这样的启动子指导基因的表达，该基因表达的水平可被在环境的或发展的因素例如温度、pH、无氧或有氧条件、光、转录因子和化学物所改变。这样的启动子这里被称为"可诱导"启动子，其可以允许对糖基转移酶或核苷糖合成中有关的酶的表达时间进行控制。对于￡."//和其它细菌宿主细胞来说，可诱导启动子对本领域技术人员是已知的。这些包括，例如，/^启动子。一个特别优选的在原核细胞中表达的可诱导启动子是双启动子，包括一个/M启动子成分，连接到取自编码半乳糖代谢中有关酶的基因的启动子成分(例如，来自UDP-半乳糖-4-差向异构酶基因(g"/E)的启动子)。对于其它有机体的可诱导启动子在本领域技术人中也是已知的。这些包括，例如，树胶醛糖启动子、lazZ启动子、金属硫因启动子和热击启动子，以及其它很多。多核苷酸结构的构建大体上需要使用可以在细菌中复制的载体。商业上可获得很多从细菌中分离的质粒的试剂盒。对于其正确的应用，按照生产商的说明即可(参见，例如，EasyPrepJ，FlexiPrepJ二者均来自PharmaciaBiotech;StrataCleanJ，来自Stratagene;以及QIAexpressExpressionSystem,Qiagen)。分离和纯化的质粒可被进一步操作以生产其它的质粒，并用于转染细胞。也可以在链霉菌属和杆菌属中克隆。经常在表达载体中插入选择性标记以构建本发明的细胞。这些基因编码一个基因产物，例如一个蛋白，在选择性培养基上对于经转化的细胞的生存或生长是必须的。没有经包含选择性基因转化的宿主细胞在该培养基上不能生长。典型的选择性基因编码对抗生素或其它毒素产生抗性的蛋白，例如安比西林、新霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素。或者，选择性标记可能编码补充营养缺陷型或提供培养基复合物中没有的关键营养成分的蛋白，例如为细菌编码D-丙氨酸消旋酶的基因。通常，载体含有一个选择性标记，可在例如E.co/z'或其它细胞中作用，其中该载体在被引入靶细胞前被复制。一些选择性标记对本领域技术人员是己知的，在例如之前Sambmok等人中有描述。细菌细胞中优选使用的选择性标记是卡那霉素抗性标记(Vieira和Messing，Ge恥19:259(1982))。使用卡那霉素选择比例如安比西林优越，因为安比西林在培养基中被P，内酰胺酶迅速降解，因此除去了选择压力从而允许培养物中不含载体的细胞过生长。含有以上所列的一个或多个所列成分的合适载体的构建可使用如上所列参考文献中所描述的标准的连接方法。分离的质粒或DNA片段被切割，加尾并以需要的形式重连，从而产生需要的质粒。为了确定所构建的质粒中的正确的序列，该质粒可通过标准技术例如限制性内切酶消化和/或根据异源方法来测序来分析。达到这些目的的分子克隆技术在本领域是已知的。很多的适合重组核酸构建的克隆和体外扩增方法对技术人员是已知的。很多的适合构建本发明的重组细胞的普通载体在本领域是已知的。对于细菌中的克隆，普通的载体包括源自pBR322的载体例如pBLUESCRIPTTM,以及源自X噬菌体的载体。在酵母中，载体包括酵母整合质粒(例如Yip5)和酵母复制质粒(YRp系列质粒)和pGPD-2。将表达载体导入所选宿主细胞的方法不是特别重要，这些方法对本领域技术人员是已知的。例如，表达载体可通过氯化钙转化被导入原核细胞，包括可通过磷酸钙处理或电转化导入真核细胞。其它的转化方法也是适合的。优选的实施方式3'涎化乳糖的生产3'涎化乳糖的生产可通过如上定义的代谢工程化的菌株实现，该菌株表达编码包含a-2,3唾液酸转移酶活性的酶，例如使用乳糖作为受体的a-2,3唾液酸转移酶或双功能的a-2,3和a-2，8唾液酸转移酶的基因。如所指出的，这个菌株不含唾液酸醛縮酶，ManNAc激酶和p-半乳糖苷酶活性，并表达编码CMP-Neu5Ac合成酶、一种唾液酸合酶、一个GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶的异源基因。对于涎化乳糖的大规模生产，这个菌株可在便宜的底物例如葡萄糖或甘油上以高细胞密度培养，并以乳糖饲养，乳糖会被乳糖透性酶内在化并被重组唾液酸转移酶使用从如图1所示的UDP-GlcNAc中外源产生的CMP-Neu5Ac所涎化。6'涎化乳糖的生产这里，唾液酸转移酶基因是一个编码a-2,6唾液酸转移酶的基因，例如来自美人鱼发光杆菌(p/zo/o6""en.Mwdawwe/a)(Yamamoto等人，1998)的基因，其导致6，涎化乳糖(Neu5Aca-6Gal(3-4Glc)。GD3和GT3糖的生产GD3(Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal卩-4GlcCer)是在高等脊椎动物包括人中大多数正常组织所发现的少数神经节苷脂。已经表明在一些病理情况例如癌症(神经胶质瘤，黑素瘤)中GD3水平升高，在肿瘤形成中具有重要作用(Zeng等人，C""cw7m，60:6670(2000)。因此大规模低成本的生产GD3具有重要意义。为此目的，以上所述的异源唾液酸转移酶基因被选自一个编码双功能a-2，3和ct-2,8唾液酸转移酶的基因，例如来自空肠弯曲菌(02mpy/okicferGilbert等人，2002，保藏于ATCCAccessionNo.43438)的基因，并导致GD3和GT3糖的生产。双功能唾液酸转移酶多肽催化来自经内在产生的活化唾液酸分子的sialyl半体转移至Neu5Aca-3Gal|3-4Glc(GM3)以形成Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal(3-4Glc。这个反应可进一步延伸而生成GT3，其为C系列神经节苷脂的前体，是成年鱼类脑中的主要成分，在高等脊椎动物胚胎脑组织中被发现很丰富(Letinic等人A^^Ywc^7ce，86，1(1998))。他们也被发现于各种神经外胚层肿瘤，因此具有潜在的可以很容易获取GT3低聚糖的很大的兴趣。为了这个目的，本发明这里进一步包括培养该微生物从而双功能的空肠弯曲菌唾液酸转移酶多肽催化来自经内在产生的活化唾液酸分子的sialyl半体转移至Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal|3-4Glc(GD3)以形成Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca-3Gal(3-4Glc(GT3)。GM1糖的生产如图2所示，以上所示的生产涎化乳糖的系统(同时参见图l)，通过表达另外的j3-l，4GalNAc转移酶和|3-1，3半乳糖基转移酶，可被延伸至神经节苷脂GM1的碳水化合物部分的生产。这里，本发明的微生物如图1所示并进一步包含编码P-l，4GalNAc转移酶和卩-1,3半乳糖基转移酶的异源序列。在这个实施方式中，p-l,4GalNAc转移酶转移一个UDP-GalNAc残基到涎化乳糖(GM3)以形成GM2，卩-1,3半乳糖基转移酶转移一个半乳糖基到GM2以形成GM1.菌株例如K12可能不能自然产生UDP-GalNAc。这种情况下，本发明的菌株可由一个编码UDP-GalNAc4差向异构酶的基因补充，，例如来自绿脓杆菌(户aen/g/raosa)的w6;尸基因(Creuzenet等人2000)和来自C."/的基因(Bernatchez等人2005)。GM1糖具有一个末端非还原半乳糖，这个结构可被用来作为a-2,3唾液酸转移酶的受体以产生GDla糖。GDla糖除了涎化乳糖具有同样的末端非还原二糖结构，可被用于P-l,4GalNAc转移酶的受体以形成七糖中间体，可被半乳糖苷化为八糖，以GA1代表(Gaip-3GalNAcp匿4(Neu5Aca-3)Gal卩-3GalNAcp-4(Neu5Aca-3)Galp画4Glc如图2.GDla和其较大的衍生物的形成减少了GM1糖的产量，本发明的一个特别的实施方式为减少或消除这些副产物的形成。为此目的，我们发现一种不能用GM1作为受体的a-2，3唾液酸转移酶。C."/NCTC111168菌株表达类似GM1神经节苷脂的脂低聚糖结构(Linton等人2000)。这个脂低聚糖外核心结构被Linton等人(2000)称为外核心VI。Cm'NCTC111168菌株含有一个叫做^〃//的基因，其编码的一个蛋白，与来自其它C."/菌株的表达GDla类似物的唾液酸转移酶(CstII)表现出53%的序列同一性(Gilbert等人2002)。CstIII蛋白的唾液酸转移酶活性使得可以将GM1糖作为唯一低聚糖产物有利地生产。因此，在一个优选实施方式中，本发明考虑到上述方法来特异性生产GM1，其中异源唾液酸转移酶为"////基因编码的a-2，3唾液酸转移酶，分离自表达类似GM1神经节苷脂的脂低聚糖结构的C.m'菌株，例如C.m'NCTCAccessionNo.111168菌株。GM2糖的生产以上所述的生产涎化乳糖的系统，通过表达另外的(3-l，4GalNAc转移酶和UDP-GlcNAc4差向异构酶，可被延伸至神经节苷脂GM2的碳水化合物部分的生产。以前曾经报道，来自的CgtAP-l,4GalNAc转移酶表现出卩-1，4半乳糖基转移酶副活性，其导致GM2糖类似物的生产，在图3中指明为GA2(Antoine等人2003)。GA2糖含有一个末端非还原含乳糖，我们已经发现这个半乳糖可以作为唾液酸转移酶的受体以产生双涎化的四糖(GA5,图3)，其可被非常活跃的CgtAIip-l，4GalNAc转移酶转化成五糖GA4或GA3(图3)。副产物GA2，GA3，GA4和GA5降低GM2糖的产量并使其纯化更难。因此除去这些副产物的形成在本发明的范围内。P-l,4半乳糖基转移酶副活性可通过使用不能生产UDP-Gal的突变体有利地抑制。如图4所示，这样的突变体可通过打乱以下三个基因中的一个来获得编码UDP-葡萄糖差向异构酶的ga/五基因，编码UDP-Glc焦磷酸化酶的g"/t/基因，以及编码葡萄糖磷酸变位酶的p^2基因。因此，本发明针对如上所定义的生产涎化低聚糖的方法，可延伸至生产神经节苷脂GalNAc卩-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc(GM2)的碳水化合物部分，其中该微生物进一步包含编码(3-l,4GalNAc转移酶，例如来自其它C"/O:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgM7/基因，和一个UDP-GlcNAc4差向异构酶的异源序列，其中该微生物的以下三个基因中至少一个被敲除或灭活，以打乱UDP-Gal的外源生产编码UDP-葡萄糖差向异构酶的g"/五基因，编码UDP-Glc焦磷酸化酶的ga/t/基因，以及编码葡萄糖磷酸变位酶的pgm基因，所述打乱可避免副产物礼物GA2，GA3，GA4和GA5的产生。GD2糖的生产通过表达使用GD3糖作为受体的另外的编码UDP-GlcNAc4差向异构酶和|3-1，4GalNAc转移酶的异源基因，生产GD3糖的系统可被延伸至神经节苷脂GD2的碳水化合物部分的生产，例如来自Cm'O:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgtAII蛋白。在这个系统中，CstII唾液酸转移酶和CgtAIIGalNAc转移酶共同竞争使用涎化乳糖作为受体(图5)。为了促进GD2糖的生产，我们在培养的第一阶段减少了(^"//的表达(以使涎化乳糖大部分被转化为GD3糖)，然后在第二阶段增加cgMJ/的表达以把GD3转化成GD2.这可以通过将cg"//基因置于一个启动子的控制之下，其独立于控制其它基因的启动子。CgtAI1蛋白的(3-l，4-半乳糖苷转移酶副活性会导致半乳糖苷化的类似物，例如如图5所代表的化合物GA2，:GA5和GA6的产生。虽然对这些低聚糖可能也有兴趣，但是，利用如上所述的不能为生产GM2而产生UDP-Gal的突变菌株来防止这些副产物的形成，从而特异性的生产GD2，也落在本发明的范围内。GDlb，GTlc，GTlb,GQlb，GQlc和GPlc糖的生产GDlb糖(Gaip-3GalNAc卩-4(Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal卩画4Glc)和GTlc糖(Gaip-3GalNAcP画4(Neu5Aca-8Neu5Aca-8Neu5Aca3)Gal(3-4Glc)的生产可通过组合如上所述的GD2糖生产系统中的基因以及另外的表达P-3Gal转移酶的基因来实现。这里，微生物进一步包含异源序列，其编码UDP-GlcNAc4差向异构酶，以GD3和GT3糖为受体的卩-1，4GalNAc转移酶，例如来自Cm'0:36菌株ATCCAccessionNo43456的CgtAII蛋白，以及P-l,3-半乳糖苷转移酶，例如来自0>"/0:2菌株NCTCAccessionNo11168的cg诏基因。生产GDlb和GTlc的系统可通过表达编码能够以GDlb和GTlc作受体的唾液酸转移酶的基因而延伸至GTlb，GQlc,GQlb和GPlc的生产。GDla和GTla糖的生产.图6显示了GTla糖的生产策略，依赖于为双功能唾液酸转移酶c^7/基因与编码p-l，4GalNAc转移酶而不以GD3糖作受体的eg"基因的共表达，末端产物为GD3，GDla和GTla糖。这里，本发明涉及按以上所述的生产涎化低聚糖的方法，其应用与生产特异性的Neu5Aca-3Gal卩-3Ga隨c卩-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc(GDla)和Neu5Aca-8Neu5Aca誦3Gal卩-3Ga脆cp陽4(Neu5Aca陽3)Gaip-4Glc(GTla)，其中该微生物包含异源序列，其编码双功能a-2,3和a-2，8唾液酸转移酶，例如来自Cm'菌株ATCCAccessionNo43438的cW基因，卩-1,4-GalNAc转移酶，例如来自O:36菌株ATCCAccessionNo43456，不以003糖作受体的0^"//基因，以及P_l，3Gal转移酶，例如来自O:2菌株NCTCAccessionNo111'68的基因。LSTD(涎化-LNiiT)和涎化-路易斯X(sialyl-iewisX)低聚糖的生产已经被描述，四糖LNnt(Galp-4GlcNAcP-3Gal(3-4Glc)可通过代谢工程化的表达分别编码P-l，3GlcNAc转移酶和(3-l,4-半乳糖苷转移酶的/g"和/g诏基因的菌株由外源乳糖产生(Priem等人，2002)。通过在如图7所示的nanK-，nanA-菌株中表达另外的"Wh和wew万C4基因，以上生产涎化低聚糖的系统可被延伸至生产五糖LSTD(Neu5Acct-3Gaip-4GlcNAc卩-3Gaip-4Glc)。合成LSTD的系统可与被描述(Dumon等人2004)来生产在其非还原末端携带涎化路易斯X基序(Neu5Aca-3Gaip-4(Fuca-3)GlcNAcp)的低聚糖盐藻糖基化系统。由此，该微生物进一步包含异源基因，其编码a-l，3-fiicosyl转移酶，例如幽门螺杆菌(He/fcc^acto";^/on'/w")(例如SEQIDNo18-来自幽门螺杆菌ATCCAccessionNo26695)以及/^B(例如SEQIDNo19-来自幽门螺杆菌ATCCAccessionNo26695)。涎化半乳糖基红细胞糖苷(SGG)六糖的生产涎化半乳糖基红细胞糖苷(Neu5Aca-3Gaip-3GalNAc卩-3Gala-4Gal卩-4Glc)被发现为尿路致病性大肠杆菌的优选结合受体(Stapleton等人1998)，其潜在可被用为抗感染制剂。最近有描述利用外源加入的唾液酸从globotriose生产SGG六糖(我们的美国专利申请US60/711,406，利用代谢工程化的微生物高效生产globosides糖)。SGG六糖的生产可由表达(i)编码GalNAc转移酶和半乳糖基转移酶活性的流感嗜血杆菌(//^mo;M^/"yZwewzae(rd菌株)的lgtD基因；(ii)似/唾液酸转移酶(a-2,3唾液酸转移酶，例如来自脑膜炎双球菌(iV.wem'"g/"6fcMC58菌株，GenBankaccession号60660-SEQIDNo5，protein—id为AAC44541.1國SEQIDNo6)，其催化sialyl半体从活化的唾液酸分子转移到globopentaose以形成涎化半乳糖基红细胞糖苷(SGG)六糖；(iii)CMPNeu5Ac合酶的基因和(iv)UDP-GlcNAc差向异构酶的H^尸基因的加"J-weM-菌株来实现。这个系统可被修改为不加入唾液酸而工作，通过使用脂"尺-wa^4-we"-菌株并另外表达"e"》C基因，如图8所示。在一些实施方式中，该微生物被操作以加强受体糖转运进细胞。这里，当乳糖或globotriose为受体糖时，可以使用表达或过度表达LacY透性酶的￡."//细胞。因此本发明包含以上的方法，其中微生物在一个培养基上培养，其含有globotriose,并且为Zacr+，A/e/J-，wawr+，wa"J-,w""ii:-，包含异源基因，a-2,3-唾液酸转移酶和UGP-GlcNAcC4差向异构酶的基因，以及"e"BC基因。'本发明也提供了一些方法，其中第一个微生物被用于制备红细胞糖苷脂。如上面提到的，培养基可能包括乳糖或globotriose,但是不需要在配置中提供唾液酸，因为它被内在地产生。当使用globotriose时，本发明也考虑到一套两个不同的微生物，所述第一个微生物在一个含有乳糖，并且为丄ac;r+，丄azZ-,Me"-，含有异源/^C基因以产生globotriose(a-l,4Gal转移酶可被脑膜炎双球菌，淋球菌(JV.gwwT^^e)，流感嗜血杆菌的丄gfC基因编码，更特别的，脑膜炎双球菌Ll(126E)GenBankaccession号U65788漏SEQIDNo7，protein—id为AAB48385-SEQIDNo8)的培养基上培养；第二个微生物在含有globotriose，并且为￡ocr+，MeL4-謂r+，画^-,顏K画，包含异源的/g/A涵/7尸和"W基因以及"e"SC基因的培养基上培养。/g①基因编码卩-3GalNAc转移酶以催化半乳糖半体从UDP-Gal到globotetraose的转移以形成globopentaose(p-3Gal转移酶活性)。例如，可以使用来自流感嗜血杆菌HI1578的/g^)基因，GenBankaccession号U32832-SEQIDNo9，protein—id=AAC23227-SEQIDNo10。涎化半乳糖的生产近来已经证明，缺少半乳糖激酶活性的^z/《突变可以使用外源半乳糖作为受体来合成具有耒端还原半乳糖的低聚糖(Dmnon等人2005)。如上所述的生产涎化低聚糖的方法可被有利地用于生产二糖涎化半乳糖(Neu5Aca-3Gal)，通过在ga/《-,加"J-和nanK-(或mwii^4r-)，表达唾液酸转移酶基因和"w》C4基因的含有半乳糖的培养基上培养微生物。具有末端还原半乳糖的涎化低聚糖的生产合成涎化半乳糖的方法可适用于上面提到的所有涎化结构的类^l物的生产。使用半乳糖而不是乳糖作为受体会导致缺少末端葡萄糖残基的类似物的形成。具有末端乳糖或半乳糖带有潜在化学官能团的涎化低聚糖的生产糖透性酶的广特异性可用来内在化带有潜在化学官能团的乳糖或半乳糖，以产生可结合的低聚糖。这个策略己被成功应用于带有烯丙基或丙炔基糖苷的GM2和GM3神经节苷脂的低聚糖部分的合成(Fort等人2005)。炔官能团使得在水溶液中可能加入叠氮，烯官能团可被转化为醛以通过还原性胺化连接到蛋白，或者通过加入半胱胺可被转化成多功能胺。也可以使用其它的化学官能团例如叠氮化物或胺。所有这些乳糖或半乳糖衍生物可被有利地用于生产上面提到的所有涎化结构的可结合类似物。在还原末端具有壳质低聚糖的涎化低聚糖的生产已经表明，过度表达茎瘤固氮根瘤菌"zo^n'zoZn'wmcaw/^o^ra)的壳质低聚糖合酶的nodC基因的Eco/z'菌株，当以高细胞密度培养时，可以产生多于2g/L的壳质戊糖(Samain等人1997)。一旦在细胞质中产生，壳质戊糖可作为糖基转移酶的受体而识别末端非还原GlcNAc残基。通过共表达茎瘤固氮根瘤菌"^/C基因和(3-l,4-半乳糖基转移酶的脑膜炎双球菌/gW基因(Bettkr等人1999)，这个策略被用于六糖Gal(3-4[GlcNAcP-4]4GlcNAc的合成。这个六糖的末端N-乙酰乳糖胺基序为唾液酸转移酶的受体。涎化七糖Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAcP-4]4GlcNAc因此可在共表达"ocC,/gW,"W和wei^C4的突变菌株上被有利地生产。近期发展的一个减小其大小的策略为，在活体细菌中，壳质戊糖被NodC产生时即刻以壳质酶酶法催化(C(ttaz&Samain，2005)。我们已经发现在本发明的方法范围内可以防止较大的壳质戊糖引物的形成，例如，其可以通过使用来自环状芽孢杆菌的壳质酶基因显著增加靶结构的分子重量。如图9所示，本发明的方法能够以共表达m^C,c/zLi/g汲"W和"ew丑C4基因的"a","。W-菌-株形成四糖Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNAcp-4GlcNAc。因此，本发明涉及以上方法，或者没有向培养基中加入外源的方法，来生产末端具有壳质低聚糖结构的涎化低聚糖，例如涎化七糖Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAc(3-4]4GlcNAc，其中唾液酸转移酶是a-2，3唾液酸转移酶，例如脑膜炎双球菌的"W基因；该微生物进一步包含壳质低聚糖合酶例如茎瘤固氮根瘤菌"odC基因和(3-l,4-半乳糖基转移酶基因例如脑膜炎双球菌的/gW基因。它可以被延伸至涎化四糖Neu5Aca-3Gal(3-4GlcNAcP-4GlcNAc的生产，其中微生物进一步包含编码壳质酶，例如C/2"基因的异源序列。在另一个方面，本发明针对如上所定义的微生物以及细胞培养基，包含选自乳糖，半乳糖，P-半乳糖苷以及(i-半乳糖苷例如globotriose(Gala-4Gal(3-4Glc)的外源前体以及所述微生物。实施例1:朋"v4，"朋JL4和"朋虹7^突变株的构建所有的突变株构建自DC菌株(Dumon等人2005)，其为一个携带/^Z和突变的DH1菌株衍生体。因为所有的DH1菌株衍生体均为w"突变，他们被携带功能性w"基因和卡那霉素抗性的低拷贝质粒pEXT22转化，为包含DNA重组的基因失活程序恢复为瞬间RecA+表型。一旦该基因被破坏，可通过在没有卡那霉素下培养细胞及筛选RecA-表型来恢复质粒。AZL菌株通过使用自杀质粒pMAK705(Hamilton等人1989)灭活"a"^基因而构建子DC菌株，如以前所描述(Priem等人，2002)。为了从DC菌株构建ZLKA，使用以前描述的使用PCR引物来提供靶序列同、竭性的一步步骤(Datsenko&Wanner,2000)，"a"/^K4基因通过除去染色体DNA中一个3.339kb的片段被破坏。上游引物的序列为5'GCAATTATTGATTCGGCGGATGGTTTGCCGATGGTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQIDNo11);下游引物的序列为5'CTCGTCACCCTGCCCGGCGCGCGTGAAAATAGTTTTCGCATATGAATATCCTCCTTAG(SEQIDNo12).使用同样的程序来灭活AZL菌株中的mm尺基因以获取AZK菌株，只是所敲除的片段大小为0.537kb，上有引物的序列为GCTGCTTC(SEQIDNo13)。实施例2:"^BC4基因的克隆一个包含"ez^C4基因序列的2.995(kb)的DNA片段使用空肠弯曲菌菌株ATCC43438作模板经PCR扩增。在左侧引物加入一个ATpn/位点5'GGTACCTAAGGAGGAAAATAAATGAAAGAAATAAAAATACAA(SEQIDNO14)在右侧弓I物加入一个^o/位点5'CTCGAGTTAAGTCTCTAATCGATTGTTTTCCAATG(SEQIDNo15)。扩增片段首先被克隆进pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)然后亚克隆进入pBBRl-MCS3载体的《p"/和J^o/位点以形成pBBR3-SS。实施例3:由代谢工程化的菌株生产涎化乳糖涎化乳糖的生产以不同的包含ct-2，3唾液酸转移酶的脑膜炎双球菌"W基因的突变菌株和包含空肠弯曲菌的分别编码N-乙酰葡萄糖胺-6-磷酸-差向异构酶，唾液酸合酶和CMP-5Neu5Ac合成酶的"ewC，"ew5和we"基因的pBBR-3-SS质粒进行研究。涎化乳糖生产以细胞内和细胞外片段的比色定量来估计(表2)。结果表明，加"J突变的AW1和DC6而在在唾液酸操纵子没有突变的菌株，以相似的产率产生少量的涎化乳糖。两个携带naw夂和加W突变的突变株AZK1和DC7则都产生四倍数量的涎化乳糖。以不含乳糖温育的DC7对照培养物中检测不到唾液酸，表明高水平的总唾液酸对应于涎化乳糖的形成。.涎化乳糖生产的改进通过TLC分析得到确定，其表明对应于涎化乳糖的带，在DC7和AZK1提取物中比在DC6和AW1提取物中更深。表2基因工程化的生产涎化乳糖的菌株的高细胞密度培养物的细胞内和细胞外部分的唾液酸定量比色，<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>总唾液酸通过二苯胺方法(Werner&Odin，1952)来定量。除了不加乳糖的DC7对照培养，加入浓度为7.5g/L的乳糖后，温育培养物30小时。实施例4:以持续乳糖饲养大规模生产涎化乳糖通过将培养时间延伸到71小时，产量被提高。在加料分批培养期开始，以2g/L的浓度加入乳糖。最初以0.52g/L/h的输入率以高甘油饲养率持续加入5小时。乳糖输入率然后降至0.3g/L/h直至低甘油饲养的第二阶段的末期。TLC分析表明涎化乳糖(化合物2，图10)被持续产生，直至培养末期，而且涎化乳糖生产不受乳糖(化合物1)供给的限制，其在细胞—内部分的培养过程中均可以很小数量被检测到。唾液酸的定量比色表明涎化乳糖主要在培养物第一部分的细胞内部分积聚。细胞内涎化乳糖浓度然后上升稳定至10g/L左右，另外产生的诞化乳糖被分泌到细胞外介质，其积聚至最终浓度为15.5g/L(图11)。实施例5:涎化乳糖的纯化从1升来自如实施例4中所描述的DC7培养物中纯化涎化乳糖。在培养末期，通过离心把细胞外部分从细胞分离出来。通过加入强阳离子交换树脂(AmberliteIR120H"形式)使细胞外部分的pH值降低至3.00。这导致被离心所除去的蛋白的沉积。通过加入弱阴离子交换树脂(Dowex66自由基形式)，上清的pH值被调整为6.0，一半上清被加入至ijDowexl(HC03形式)柱(5x20cm)。涎化乳糖被Dowex1树脂保留，以蒸馏水洗涤后，以0-500mM连续NaHC03梯度洗脱。对另外一半上清重复同样的程序。收集含有涎化乳糖的洗脱部，通过AmberliteIR120(K形式)处理除去NaHC03直至pH为3.0。以NaOH调整pH值至6.0，并冻干涎化乳糖。对于细胞内部分的纯化，以热处理(UKTC，45分钟)浸透细胞，并以最初培养基相同的体积重悬。低聚糖自由扩散出细胞，离心后在上清中被恢复。涎化乳糖的纯化以和细胞外部分相同的程序进行。从一升DC7的培养物，纯化的涎化乳糖的产量为来自细胞外部分为9克，来自细胞内部分为6克。对纯化产物为涎化乳糖的鉴定通过质谱分析确认。实施例6:GD3和GT3糖的生产使用代谢工程化的、表达双功能a-2-3和a-2-8唾液酸转移酶的空肠弯曲菌^^//基因从外源乳糖和Neu5Ac生产GD3和GT3糖已经被描述(Antoine等人，2005)。这里我们研究了使用实施例3中描述的系统而不提供外源唾液酸来生产这两个低聚糖。产生GD3的菌株NF3是wa"ii^4r突变，其共表达c^7/和"ew5C4基因(表1)。NF3菌株在3g/i:的乳糖存在下以高细胞密度培养。TLC分析(图12)表明，乳糖被全部转化成3个化合物，推测为GM3(1)、GD3(2)和GT3(3)糖。菌株NF03培养物的细胞内部分通过离子交换树脂色谱在Dowexl上纯化，如实施例4所描述，三个含有GM3，GD3和GT3的低聚糖片段被分别分离。三种糖片段的产量分别是0.16g，0.75g和1.26g。鉴定通过对纯化片段的质谱分析确认。实施例7:使用脑膜炎双球菌唾液酸转移酶和绿脓杆菌UDP-GlcNAcC4差向异构酶生产GM1糖以前已经描述过，使用表达以下基因的代谢工程化的菌株从外源乳糖和Neu5Ac生产GM1糖(0a-2-3唾液酸转移酶的脑膜炎双球菌"M基因；(ii)编码P-l,4-GalNAc转移酶的来自空肠弯曲菌的O:19菌株OH4384的cgL4基因；(iii.)编码P-l,4-半乳糖基转移酶的来自空肠弯曲菌的O:19菌株NCTC11168的基因；(iv)编码UDP-GlcNAcC4差向异构酶的来自绿脓杆菌的w&户基因(Antoine等人，2003)。通过与MewBC4共表达cg",cg出和w"而不外源加入唾液酸来生产GM1糖的第一个尝试表明，限制步骤是通过CgtAGalNAc转移酶转化涎化乳糖为GM2糖。GalNAc转移酶已经被证明可以不同的形成存在，取决于弯曲杆菌菌株。克隆自OH4384菌株的cgL4形式被报告具有远低于来自ATCC4356菌株或NTCC11168菌株的特异性活性(Gilbert等人，2002;Varki，1993)。因此通过PCR从ATCC4356菌株的基因组DNA克隆了eg"//基因，然后和"W基因被亚克隆至pBluescript质粒，产生pBS-cgtAII-nst质粒(表l)。在pBBR-3-SS中，克隆自pBBRwbpP质粒(Antoine等人，2003)的vt^;尸基因位于"ew5C4基因下游，形成pBBR-SS-wbpP。克隆自pACT3cgtAB质粒的cg^(Antoine等人，2003)被克隆入pSU27-18质粒，产生pSU18-cgtB。通过以三个质粒pBS-cgtAII-nst，pBBR-SS-wbpP和pSU18-cgtB转化w^7A^4r突变菌株ZLKA来构建DC15菌株(表l)。如图13所示，DC15菌株没有积聚GM3糖(1),表明来自ATCC4356菌株的CgtAII比来自OH4384菌株的CgtA更加活跃。在培养末期，主要产物是化合物(5)，其比GM1糖和如GM2—样迁移的化合物(2)迁移更慢。在Dowexl上纯化后，质谱分析表明化合物(2)是GM2糖类似物，其在GalNAc的位置具有一个Gal残基，被进一步命名为'GA2糖(表3)，结构为Galp-4(Neu5Aca-3)GalJ34Glc。化合物(5)的质谱分析表明它是双涎化的八糖，通过两个糖残基(一个HexNAc，一个Hex)转移到GDla糖上而形成。由于这两个糖最有可能是被CgtAII和CgtB所加，后被命名为GA1糖的化合物(5)的结构，可能是Gal0-3GalNAce-4Neu5Aea画3GalP-3GalNAce-4(Neu5Aca-3)Gal0-4Glc(表3)。表3由于CgtAp-1，4-GalNAc转移酶的(3-1，4-半乳糖基转移酶活性而在神经节苷脂糖合成中作为副产物而形成的神经节苷脂糖类似物的结构<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>实施例8:使用脑膜炎双球菌唾液酸转移酶和弯曲杆菌UDP-GalC4差向异构酶(GNE)生产GM1糖GA2糖通过培养DC15来生产，因为CgtAII特别活跃，在缺乏UDP-GalNAc的情况下可使用UDP-Gal取代UDP-GalNAc作为糖供体。由于这种缺乏可能由于Wp户基因所编码的UDP-GlcNAcC4差向异构酶活性不足；研究了对空肠弯曲菌所编码的g恥基因的差向异构酶的利用。这个基因最近被表明活性高于WbpP(Bernatchez等人，2005)。Gwe基因由PCR克隆自空肠弯曲菌NCTCU168菌株的基因组DNA，在wewBC4基因下游亚克隆至pBBR-SS质粒。所产生的pBBR-SS-gne质粒被用于构建DC21菌株，其类似于DC15,除了表达而不是wbpP(表l)。如图14所示，另外的g"e基因的表达几乎完全破坏了异GM2糖的积聚，两个主要产物为GM1糖(3)和GA1糖(5)。GM1为瞬时积聚；其细胞内浓度在加入乳糖28小时候达到最大，然后由于化合物(5)的形成而降低。实施例9:使用空肠弯曲菌唾液酸转移酶CstIII生产GMl糖以空肠弯曲菌0:2菌株NCTC11168作模板通过PCR克隆cw///基因。棊因然后被亚克隆进入pBluescript质粒，在cg^4/i上游。产生的pBS-cstIII-cgtAII质粒被用来构建DC22菌株，其也表达cgf万和CMP-Neu5Ac合成的恥w5C4基因。TLC分析(图15)表明，GM1糖(3)几乎是培养末期DC22菌株细胞内部分所发现的唯一低聚糖。涎化乳糖(1)和GM2糖(2)几乎不能被作为中间体除去。如实施例5所描述，在Dowexl上纯化后，从一升培养物中GM1糖的产量为6g。实施例10:GM2糖的生产使用ZWT菌株研究GM2糖的生产，其与产生GM1的DC21菌株类似，除了不表达^W基因。如图16所示，乳糖在如GM2—样迁移的化合物(2)中被ZWT菌株迅速转化。令人惊奇的是，还产生了一个比GM2迁移慢的化合物(3)。通过Dowexl上色谱，化合物(2)和(3)纯化自ZWT菌株培养物的细胞内部分。质谱分析表明纯化的化合物(2)由GM2糖和GA2糖类似物的混合组成。片段B的ESI质谱在m/z1310和1269表现出两个峰。在m/z1310处的峰可能对应于源自后来被命名为GA3糖(表3)的六糖GalNAc卩-4(Neu5Aca-3)Gaip-4(Neu5Aca-3)Gaip-4Glc的准分子离子[(MT"Na-H)-H]'。在m/z1269处的第二个峰对应于源自Gaip画4(Neu5Aca-3)Gal卩-4(Neu5Aca-3)Gal卩-4Glc(被称为GA4糖)'的准分子离子[(M^a-H)-H]'。在图11中解释说明了GA3和GA4糖的形成Nst唾液酸转移酶的副活性似乎能够涎化GA2糖的末端非还原性Gal。由此产生的双涎化五糖(GA6糖)可作为CgtAII的受体被转化为GA3或者GA4糖。实施例ll:g"/C/突变的构建为了构建g"/U突变，用五xo/z'K12的基因组DNA作模板和以下两个引物通过PCR扩增了含有序列的1.88kb的DNA片段5，CAATGCCAAATATGGGGAAC(SEQIDNo16)和5'GCGGCCGCGTCTTTTCTGGCTAA(SEQIDNo17).扩增的片段被克隆至pCR4blunt-TOPO载体(Invi加gen)，一个位于galU序列中两个A^fe/位点之间的0.244kb的片段被A^/e/消化切割。截短的ga/t/基因被亚克隆至pK03载体的5^//A^/位点。在ZLKA菌株中按照pK03基因取代程序(Link等人，1997)进行^/t/的破坏，让步于ZWU宿主菌株。实施例12:通过w/r突变生产GM2糖ZWU2菌株与实施例10中所用的用于GM2糖生产的ZWT菌株类似，除了使用g"/t/菌株ZWU而不是ZLKA菌株作为宿主菌株(表1)。如图17所示，在ZWU2培养末期，没有检测到更多的副产物(3)。而且，质谱分析表明化合物(2)只是由GM2糖组成，在分离自ZWT培养物的化合物(2)中存在的GA2糖类似物，可被检测到(图18)。实施例13:GD2糖的生产第一个生产GD2糖的尝试由NF08菌株进行，其构建自以三个质粒pUC18-cstII，pBBR3-SS-gne,pWKS-cgtAII转化ZJJCA宿主菌株(表1)。对NF08产生的低聚糖的鉴定表明，主要的产物为GD2糖及其半乳糖基化类似物GA2糖。也形成了少量的GD2糖，但其被纯化为半乳糖苷化的类似物GA5和GA6的混合物(图5)。""//基因被亚克隆至阿拉伯糖启动子(Para)控制下的pBAD33质粒。通过这种方式《"//的表达可被调控，而独立于其它受P^启动子调控的基因。含有pBAD33-cgtAI1质粒而不是pWKS-cgtAII的NF09菌株在没有阿拉伯糖下先培养24小时，接着加入3g/L的乳糖。然后加入阿拉伯糖，菌株被培养另外24小时。这个策略能够有效的减少GM2糖的生产，同时GD2糖产量升高。但是，半乳糖苷化的类似物GA5或GA6仍热以相当的数量被生产。为防止这些很难从GD2分离的类似物的形成，研究了galU突变菌株ZWUl中GD2的生产。ZWU1菌株与NF09菌株类似，除了ga/f/菌株ZWU而不是ZLKA菌株被用作宿主菌株(表1)。在培养25小时后、几乎所有的涎化乳糖都消失后，加入阿拉伯糖以增加cgtAII的表达。Dowexl上对细胞内部分的纯化导致四个片段的分离(图19)。质谱分析表明片段A由GM2糖组成，片段B有GD2糖组成。片段C主要含有GD3，片段D含有GT2糖。检测不到半乳糖苷化的类似物，GD2作为主要产物被获得。实施例14:GDlb和GTl的生产cW/7和基因被克隆至同一pBluescript质粒(pBS-cstII-cgtB)。NF21菌株通过以pBS-cstII-cgtB质粒以及pBBR-SS-gne质粒和pBAD33-cgtAH转化ZLKA宿主菌株来构建。以实施例13中所描述的培养NF09菌株的促进GD2形成的条件以高细胞密度来培养NF21菌株。从一升NF21菌株培养物中产生的低聚糖首先以Dowexl(HC03)树脂纯化，以NaHC03梯度(0-1M)洗脱三个片段(A，B和C)。质谱分析表明，片段A(490mg)含有GD1糖，片段B(870mg)含有GD1糖和GA5或GA6类似物的混合物，片段C(960mg)含有GT1糖。在ToyopearlHW40S柱以100mMNaHCO3作洗脱液，通过分子排阻色谱从片段A和片段C中纯化出GDI和GT1糖。如表4所示，'HNMR分析表明GDI和GT1的末端半乳糖的H-l质子化学位移与末端半乳糖未被取代的GMla糖的H-l值非常接近。然而，由于其被唾液酸取代，GDla和GTla的末端半乳糖的H-l信号移动了4.62ppm。这些结果清楚地显示出NF21菌株产生的GDI和GT1糖具有GDlb和GTlc的结构。表4神经节苷脂糖在343°K下的NMR质子化学位移<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>实施例15:GTla糖的生产将两个基因cW//和eg"克隆至同一pBIuescript质粒以在突变的ZLKA宿主菌株中共表达cg诏和"e"万C基因(表l)。""/基因克隆与cgtA.下游以具有最大量表达的cgtA和较低表达的c^//以实现GD3形成的最小化。如图20所示，NF17培养物的TLC分析表明像涎化乳糖(1)和'GM1糖(3)—样迁移的化合物为瞬间产生。少量的如GD3一样迁移的化合物(2)在培养末期被恢复，但主要的终产物为比GM1迁移慢的化合物(4)和(5)。对纯化的化合物质谱分析表明化合物(4)和(5)具有分别对应于GDla和GTla的分子量。实施例16:涎化半乳糖的生产通过敲除GalK突变菌株GLK染色体中的mw^^4r基因来构建GLKA菌株(Dumon等人，2005)。通过以质粒pBS-nst和pBBR3-SS(表1)转化GLKA菌株而获得GLK7菌株。在3g/L的半乳糖存在下，以高细胞密度培养GLK7菌株导致形成一个二糖，其通过质谱分析为与涎化半乳糖相同。涎化半乳糖的产量通过总唾液酸定量比色估计为6g/L。实施例17:四糖Neu5Aca-3Gal卩-4GlcNAcp-4GlcNAc的生产在pBS-nst的五coiFX/"/位点从pBS-nodC质粒(Cottaz&Samain，2005)克隆茎瘤固氮根瘤菌nodC基因来构建pBS-nst-nodC质粒。以3个质粒pBS-nst-nodC,pBBR3-SS,pWKS-lgtB-chiA(表l)转化ZLKA菌株从而获得SN4菌株。以高细胞密度培养SN4菌株导致产生一个主要的低聚糖，其经质谱分析被鉴定为Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcJ3-4GlcNAc。参考文献Antoine，T.,Priem，B.,Heyraud,A.,Greffe，L，Gilbert,M.,Wakarchuk,W.W.，Lam，J.S.&Samain,E.(2003).Large-scaleinvivosynthesisofthecarbohydratemoietiesofgangliosidesGM1andGM2bymetabolicallyengineeredEscherichiacoli.Chembiochem4,406-412.Antoine,T.，Heyraud,A"Bosso，C.&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-8中的任一项所述的生产半乳糖基红细胞糖苷(Neu5Aca-3Gal卩-3GalNAc卩-3Gak-4Gal卩-4Gal)的方法，其中该微生物在含有globotriose且为丄Gcr+，Me"-,麵r+，麵j-画的培养基上培养，并且包含外源lgtD，例如来自流感嗜血杆菌(7foemo/7M^/"y/we"zaeHI1578，GenBankaccession号U32832的lgtD基因,a-2，3画唾液酸转移酶的基因和UGP-GlcNAcC4差向异构酶以及"edBC基因。28.根据权利要求1-8中的任一项所述的生产涎化半乳糖(Neu5Aca-3Gal)和带有一个末端还原半乳糖的涎化低聚糖的方法，其中该微生物为ga^-，mm丰amf(br加wA^47V,表达唾液酸转移酶的基因和we"5C4基因，并且在具有半乳糖的培养基上培养。29.根据权利要1所述的生产在其还原末端带有壳质低聚糖结构的涎化低聚糖的方法，例如涎化七糖Neu5Aca-3Gaip-4[GlcNAcp-4]4GlcNAc，其中唾液酸转移酶是a-2,3-唾液酸转移酶，例如脑膜炎双球菌"W基因，该微生物进一步包含壳质低聚糖合酶例如茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)"o^C基因和p-l，4半乳糖基转移酶基因，例如脑膜炎双球菌的扭万基因。化四糖Neu5Aca-3Gaip-4GlcNAcP-4GlcNAc的方法，其中该微生物进一步包含编码壳质酶，例如c/7"基因的外源序列。30<image>imageseeoriginaldocumentpage0</image>31.根据权利要求29或30所述的方法，其中没有向培养基中加入外源前体。32.根据权利要求11-31中的任一项所述的方法，其中该微生物在甘油或葡萄糖为碳底物上生长。33.如权利要求11-30中的任一项所定义的微生物。全文摘要本发明涉及大规模体内合成涎化低聚糖的方法，在培养基中培养微生物，培养基可选地包含外源前体例如乳糖，其中所述微生物包含编码CMP-Neu5Ac合成酶，唾液酸合酶，GlcNAc-6-磷酸2差向异构酶和唾液酸转移酶的异源基因，其中编码唾液酸醛缩酶(NanA)和ManNac激酶(NanK)的内源基因被敲除或灭活。本发明还涉及可以产生内部激活的唾液酸的这些微生物。文档编号C12N9/04GK101415834SQ200780012535公开日2009年4月22日申请日期2007年3月7日优先权日2006年3月9日发明者E·萨满申请人:国家科学研究中心