专利名称：在梭菌中的双交换同源重组的方法
技术领域：
本发明涉及，特别是通过利用双交换同源重组的，修改梭菌细胞的核酸的方法。
背景技术：
为了进行在病原体(即难辨梭状芽孢杆菌(C. difficile))中治疗靶标的探索，或者更有效地开发有益菌株的医疗或工业性质(癌症或生物燃料生产)，能够在预定位置有效并可复制地操纵微生物基因组的要求是有的。例如，为了去除(“敲除”)或变更内源性细胞功能，或为了通过增加一个或多个外源性活动(“敲入”)来扩展功能，可对微生物基因组进行特有的变更。在基因组操纵过程中，该宿主细胞重组机制经常是关键的。实质上，只要细胞内的两个独立的DNA分子共有共同DNA序列区域(即同源区)，其就可通过类坎贝尔机制 (Campbell-like mechanism) “重组”以形成单DNA分子。因此，被引入至靶(target)宿主生物体的染色体外元件(例如质粒(plasmid))可“整合(integrate)”进该宿主细胞基因组以产生“单交换整合子”。为了让单交换活动使宿主细胞基因失活，该被引入的DNA需要包围该基因的中间部分以致该染色体外元件整合进该靶基因的中部，从而打断该编码序列 (图1A，步骤1)。值得注意的是，由于在整合之后仍然留有促进该初始重组活动的DNA序列的同源区，所以在整合子之中的单交换在基因上是不稳定的。因此，第二重组活动是能够发生而导致该染色体外元件被切除和该靶基因的恢复，其本质上是该过程的逆向(图1A，步马聚2) ο利用修改染色体外元件中的同源DNA序列(即敲除盒)的设计，经由同源重组来生成基因上稳定的突变体是有可能的。如果该敲除盒被构建成对靶DNA序列进行期望的修改(即删除、插入或变更-如图IB中的*所显示)，并之后在旁侧的DNA序列与该靶序列的任一侧的DNA序列同源(即同源臂)，则能够发生“双交换活动”，借此两次独立的同源重组活动发生，各同源臂发生一次(图1B)。因为整体结果是引入在染色体外元件的已修改的等位基因实际上与存在于宿主细胞基因组中的野生型等位基因交换，所以双交换活动的过程常被称为“等位基因的交换”。因为重组活动发生的频率不高(常被估计为< 1X10_6)，所以检测出其中发生过两次独立的双交换的双交换重组体(即在图IB中)的可能性极小。因此，普遍的做法是通过分离第一情况中的单交换整合子(图1C)，接着随后分离该双交换整合子(图1D)来以逐步的方式生成双交换突变体。整合后的结果，在位于所插入质粒旁侧的染色体内，即在图1中所示的例子中为基因A B和C，存在DNA同源区域。这些复制区域之间的同源重组会导致该介入DNA的切除。如果重组发生在存在于基因B中突变的上游DNA区域之间，那么在质粒切除之后仍会保留在该染色体中的基因B的拷贝就是原始的野生型基因(图ID中的切除活动2)。然而， 如果重组发生在基因B中突变的下游区域和该复制区域之间，那么在质粒切除之后仍会保留在该染色体中的基因B的拷贝就是该突变基因(图ID中的切除活动1)。
虽然重组活动发生的频率是低的，但是只要该整合带有生长优势，单交换整合子就能够优先于野生型非整合细胞被选择。在最极端的情况下，如果该质粒复制子(Rep)是有缺陷的(即完全无功能性的)，那么当将抗生素抗性编码到该质粒上时，能产生抗生素抗性细胞的唯一方法是该质粒是否整合到该宿主细胞基因组中。类似地，如果该Rep区域是有缺陷的(即有功能，但不如宿主细胞染色体复制子)，那么质粒复制在抗生素存在的情况下会是在生长速度方面的限制因素。因此，该质粒整合到该宿主细胞基因组中的细胞在抗生素存在的情况下会占有生长优势。于是，只要所用的质粒复制子的效率适当地不如该宿主细胞染色体复制子，就能在合适的抗生素的选择下选择单交换整合子。生成单交换整合子后，在能否检测出导致质粒切除的少见的第二重组活动方面出现了实际的问题。在图ID中所示的方案中，这种活动是不可选择的。因此，必须通过适当的筛选来检测出这些活动。发生频率的不高使这过分费时。绕过这个问题的一个方法是使用负性或反向筛选标记。可把这种标记连同抗生素抗性标记包括在质粒骨架上(图幻。因此，由于该质粒通过单交换重组而整合，该标记会被纳入染色体内。负性筛选标记的特征是在某特定的限定条件下，其存在对细胞有不利影响，最明显的是致使细胞死亡或阻碍/抑制细胞生长。因此，通过在非许可条件下将图2中所生成的整合子接种，仅有可存活/生长的细胞是那些由于质粒切除而丢失该负性筛选标记的细胞(图3)。存活的细胞可接着为所需的切除活动而被筛选(图3)。最常用的负性筛选标记是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacB。当sacB 被引入至异源宿主(主要是革兰氏阴性菌)时，其在外源蔗糖存在的情况下会导使致死亡 (Kaniga et al. ， (1991)Gene 109 :137-141)。就梭菌而言，还未有对这种用作负性筛选标记的等同异源基因被描述过。梭菌(Clostridia)纲包括梭菌(Clostridiales)目、盐厌氧菌目和热厌氧杆菌目。梭菌目包括梭菌(Clostridiaceae)科，梭菌科包括梭菌(Clostridium)属。梭菌 (Clostridium)是最大的细菌属之一。其包括绝对厌氧、革兰氏阳性的产孢菌。近年来， 梭菌的所有主要的种的完整基因组序列都从至少一个代表性的菌株，包括丙酮丁醇梭菌 (C. acetobutylicum)、难辨梭状芽孢杆菌(C. difficile)、肉毒梭菌(C. botulinum)和产气荚膜梭菌(C.perfrmgens)，被测定。丙酮丁醇梭菌，连同其他良性代表，带有明显的潜力去成为针对癌症的治疗剂的传递载体。该纲的某些成员，例如热纤梭菌(C. thermocellum)和丙酮丁醇梭菌，可以商业规模地被用于化学燃料的生产。然而，该属因那些在人类和家畜中致病的成员，例如难辨梭状芽孢杆菌、肉毒梭菌和产气荚膜梭菌而得到最大的恶名。尽管该属在商业和医疗上是非常重要，但是在其有效利用方面，或对抗其所致疾病的合理方法的发展方面的进展因缺乏对该等生物体的生物学在分子层面上的基本理解而遇到严重阻碍。 这主要是缺少一些有效基因工具的后果。采用了一个方法来调整Fabret等人所述的枯草芽孢杆菌(B. subtilis)方法 (MolMicrobiol (2002)46 :25-36)以用于丙酮丁醇梭菌，该方法依靠宿主细胞对upp基因所编码的5-氟尿嘧啶的敏感性(由于5-氟尿嘧啶被尿嘧啶磷酸核糖基转移酶转化为 5-氟-dUMP)。Fabret等人^00 从丙酮丁醇梭菌基因组删除了 upp基因，使他们能将敲除载体上的UPP基因用作负性筛选标记。因此，可通过分离5-氟尿嘧啶抗性菌落来筛选质粒切除后upp基因的丢失。虽然这个方法极其有力，但其要求使用突变的宿主菌株，也就是为了 UPP基因的菌株突变体。使用在UPP中突变的菌株来进行病原体的毒性研究，其可取性是值得怀疑的。一般而言，当在分子层面上研究生物体的生物学时，以野生型背景开始是优选的， 因为所生成的任何重组菌株都能与野生型亲代菌株(就病原体例如难辩梭状芽孢杆菌而言，亲代菌株也可为临床上分离的菌株)直接地比较回去。由于野生型菌株和所生成的重组菌株是同基因的(被有意引入该重组基因中的基因修改除外)，其间的任何表型差异都能直接归因于所作的基因修改。以突变菌株开始的缺点就是包括在生成初始的“出发菌株” 所涉及的劳动。另一个缺点是技术人员必须在任何所进行的实验中将单突变(亲代)菌株与双突变(后代)菌株作出比较，然后必须推算回去以收集原始的野生型(临床)菌株的意义。在这情况中，更加难以确定地说所观察到的亲代和后代菌株之间的任何表型差异是否纯粹是由于后代菌株所携带的继发突变而致或是否在原发和继发突变之间有组合/协同效应而致。
发明内容
在本发明中，来自大肠杆菌的codA基因在梭菌中被用作异源的，负性或正性，筛选标记。令人吃惊的是，codA在梭菌中起作用并形成有力的负性，或正性，筛选标记，从而避免需要总是在突变的梭菌菌株，例如带有突变基因的菌株中进行操纵。该codA基因编码了催化胞嘧啶转化为尿嘧啶和氨的胞嘧啶脱氨酶。其还能催化无害的“前药” 5-氟胞嘧啶(FC)转化为高细胞毒性的药物-5-氟尿嘧啶(FU)。FU能以两种方式施加毒性i)通过抑制必要的嘧啶生物合成路径和/或ii)并入DNA和RNA分子。该codA基因被用作为基因操纵哺乳动物细胞和植物细胞的负性筛选标记。在典型意义上，其从未在原核生物中被用作成负性筛选标记(即用于进行特异性靶向的、限定的突变)。根据第一方面，本发明提供了在宿主梭菌细胞中双交换同源重组的方法，包含供体DNA分子和该宿主细胞的DNA之间的第一同源重组活动，以在该宿主细胞中形成第一重组活动的产物，其中该供体DNA分子包含codA基因和至少两个同源臂；以及在该第一同源重组活动的产物之内的第二重组活动，从而在宿主细胞中形成可通过该codA基因的丢失而可选择的该第二同源重组活动的产物。优选地，该宿主细胞的DNA包含该宿主细胞的染色体或质粒，最优选的是该宿主细胞的DNA包含该宿主细胞的染色体。优选地，该供体DNA分子进一步包含可选择的等位基因。优选地，该codA基因在本发明的方法中用作负性筛选标记。优选地，codA是用于本发明的方法中唯一的负性筛选标记。或者，由于该codA基因可被用来选出那些携带该基因的细胞(Wei and Huber (1996) The Journal ofBiological Chemistry 271 (7) :3812-3816)，所以其可用作正性筛选标记，而非用作负性筛选标记，其中不选择携带该基因的细胞。该第一同源重组活动的产物是进入该宿主DNA的该供体DNA分子的单交换整合子。该第一交换活动的产物可能并不一致，但视该供体DNA分子整合到受体DNA分子中的位置而定可包含不同的分子种。不过，可以不需要在不同的第一重组产物之间进行选择。可以的是第一重组活动的产物中不同的分子种各自能产生想要的第二重组活动的产物。甚至在第一重组活动的产物中不是所有可能的分子种也能产生想要的第二重组活动的产物的情况下，都可以是不想要的产物很少出现以致不需将它们选择出来。优选地，在第一供体DNA分子上的可选择标记在整合到该宿主DNA中时被表达。 通过该可选择标记的表达以作筛选，该第一同源重组活动的产物可被分离。优选地，该供体 DNA分子不在该宿主细胞内有效地被复制，以致即使该可选择标记被表达在该供体DNA分子上，表达水平也不足以使得这些细胞在基于该可选择标记的表达的第一同源重组活动的产物的筛选中被识别出来，或者该可选择标记在未整合的供体DNA上的表达所致使的菌落比那些为第一同源重组活动的产物的菌落生长得明显更慢，从而能够容易地区分该所需要的细胞。通过在将该供体DNA分子整合到该宿主DNA中时以codA基因的表达进行筛选，可替代地或额外地筛选出该第一同源重组活动的产物。这种细胞并不能生长在含有5-氟胞嘧啶的培养基上，5-氟胞嘧啶会被codA基因的产物转化为高细胞毒素的药物-5-氟尿嘧啶。供体DNA分子所编码的可选择标记，其允许选择整合子，可为除去毒素的毒的酶， 例如抗生素抗性酶或前药转化酶；荧光或有色的标记基因；营养缺陷的标记；或任何其他合适标记。合适的可选择标记基因可编码对抗生素(例如四环素、红霉素、新霉素、洁霉素、 奇霉素、氨苄青霉素、青霉素、氯霉素、甲砜霉素、链霉素、卡那徽素等等)、化学品(例如除草剂)、重金属(例如镉、汞、硒等)和其他介质(例如UV、辐射)的抗性，以及弥补受体生物体中染色体缺陷的基因(例如leuD、murA、manA)。典型地，该可选择标记基因在第一重组活动发生的宿主细胞带有生长或生存优势。优选地，该可选择标记基因不被保留在该第二重组活动的产物中。适当地，这可通过将可选择标记基因定位在该供体DNA分子提供重组的第一位点的同源臂的上游，或提供重组的第二位点的同源臂下游而达到。本发明的方法优选地包括选出该第一同源重组活动的产物的步骤。这可通过以下而达成(i)在带有被整合到宿主DNA中的可选择标记的细胞具有生长优势的条件下使细胞生长，和/或(ii)选择codA基因的表达所赋予的5-氟胞嘧啶的敏感度。本发明的方法优选地包括选择该第二同源重组活动的产物的步骤，这可通过使细胞在含有5-氟胞嘧啶的培养基中生长而达到，5-氟胞嘧啶对以显著水平表达codA基因的细胞有毒性。任何未经历第二同源重组，从而仍然带有整合到该宿主DNA内的codA基因的细胞将不能在5-氟胞嘧啶存在的情况下生长，并且仅那些切除了该供体DNA的细胞能够生长。识别出该第二同源重组活动的产物之后，接着可利用PCR或其他分析试验来识别哪些存活的细胞以理想的方式切除了该质粒/供体DNA分子，也就是将替代的等位基因引入至该宿主DNA。优选地，该供体DNA分子进一步包含在第一同源重组活动中被引入至该宿主DNA 的替代的等位基因。该替代的等位基因在该第二同源重组活动之后优选被保留在该宿主 DNA中。该替代的等位基因可将突变引入至宿主DNA中该相应的等位基因中；该突变可为插入、删除或任何其他适当的突变。例如，本发明的方法可被用于通过将无功能的替代的等位基因引入至该内源基因，或替代该内源基因，来使内生于宿主DNA的基因失活。替代地或额外地，该替代的等位基因也可称为被加至宿主DNA的“货物”DNA。可选择货物DNA以在宿主细胞赋予理想的表型，例如表达特定蛋白的能力。在货物DNA的选择上没有特别的限制。虽然对货物DNA的大小并没有特别的限制，但在实践上会受到供体 DNA分子的限制。视乎宿主细胞而定，对能被引入的供体DNA分子的大小可以有实践的限制。例如，在某些梭菌中，质粒的转化效率低，并且当质粒的大小增加时效率降低。技术人员能容易地用实验确定货物DNA的大小的上限，该上限可按宿主细胞和供体DNA分子而不同。 适当地，可引入至少 lbp，优选至少 1、2、3、4、5、10、15、20、50、100、1000、10，000、100，000 或 1，000，OOOkb 的货物 DNA0货物DNA可包含与宿主细胞同属，或不同属的基因或其他遗传物质。货物DNA也可以是完全合成的，或任何合成和天然遗传物质的组合。基因可用以，例如分解代谢路径或生物合成路径。优选地，供体DNA分子包含至少两个同源臂，一个同源臂供于在要交换的替代的等位基因上游的第一位点与该宿主DNA同源重组，和一个同源臂供于在要交换的替代物下游的第二位点与该宿主DNA同源重组。该宿主DNA优选地包含与该供体DNA分子的同源臂对应的同源臂，并且要与供体DNA分子中的替代的等位基因交换的等位基因位于该第一对应同源臂的上游或该第二对应同源臂的下游。同源臂提供第一重组活动中供体DNA分子和宿主DNA之间的同源重组，以及第二重组活动中的第一重组活动的产物之内的同源重组。对应的同源臂之间的同源程度必须足以允许同源重组发生。影响同源重组能否发生的因素是对应的同源臂之间的序列一致性和该些同源臂的碱基对的大小。典型地，对应的同源臂之间需要至少85%的序列一致性以发生同源重组。优选地，序列一致性为至少90%，更优选为至少95%，更加优选为至少98%， 最优选为100%。典型地，各同源臂的大小为至少10bp，更典型地为至少20bp、至少40bp、至少7^3ρ、至少IOObp、至少200bp或至少300bp。虽然这在实践上可能受供体DNA分子(其必须带有至少两个同源臂)的大小所支配，但对同源臂的大小并没有特别的上限。同源臂的大小可为Ikb般大、或长达2kb、长达5kb、长达10kb、甚至长达50kb、1 OOkb、1Mb、5Mb或 10Mb。如上所述，虽然第一重组活动的产物可能并不一致，但视乎供体DNA分子整合到宿主DNA分子的位置而定可包含不同的分子种。供体DNA分子中的各同源臂在宿主DNA中带有对应的同源臂。供体DNA分子中的同源臂和宿主DNA中对应的同源臂可被认为是一对。第一重组活动可通过该第一对同源臂或该第二对同源臂中的同源重组而发生。因此，典型地在一些宿主细胞中，该同源重组发生在第一对同源臂处，而在其他宿主细胞中， 该同源重组发生在第二对同源臂处，以致DNA的不同的分子种由该第一重组活动形成。两对同源臂都存在于该第一重组活动的产物中。如果第二重组活动发生在第一重组活动发生的同一对同源臂之间，供体DNA分子会被重组出，并且宿主DNA会被恢复至其原始形式。相比之下，该第二重组活动的想要的产物通过未在第一重组活动中重组的该对同源臂之间的同源重组形成。因此，虽然供体DNA 分子的两个同源臂都能用作与宿主DNA的同源重组，但是要理解的是，对于任何特定的供体DNA分子来说，仅一个同源臂会与宿主DNA进行同源重组，另一个同源臂会在该第一重组活动的产物中进行分子内同源重组。在特定的实施例中，也可有超过两对同源臂，例如可有三对同源臂。当在有两对同源臂的情况下，仅一个同源臂会与宿主DNA进行同源重组，另一同源臂会在该第一重组活动的产物中进行分子内同源重组。应当理解当一对同源臂经历同源重组时，同源重组的确切位点是不可预测的。如果该对的DNA序列是相同，同源重组的产物的序列也是相同，即使整合发生的确切位点是并不知道的。如上所述，即使如果该第一重组活动按供体DNA分子整合到宿主DNA中的位置而定能生成不同的产物，也可以不需要选走特定的第一重组活动发生在其中的宿主细胞。可以为第一重组活动有利于发生在所需的某对同源臂处，这能通过使供体DNA分子中的所需的同源臂长于供体DNA分子中的其他同源臂而达成。例如，所需发生第一重组活动处的同源臂的长度可长达约1200bp。供体DNA分子中的其他同源臂可为约300bp至约500bp。接着第一重组活动可更普遍地发生在约1200bp对同源臂处。该供体DNA分子可为任何适合用于双交换同源重组的DNA分子。优选地，在本发明的方法中，该供体DNA分子是质粒，尤其是非复制质粒、复制缺陷质粒或条件质粒。或者， 该供体DNA分子可为线性的，或其可为丝状噬菌体如M13。技术人员能容易地选择适合地与给定的宿主细胞一起使用的供体DNA分子，例如质粒。非复制质粒会包括那些不携带能够支持在预定受体宿主中质粒自主复制的“机械”的质粒。这些被设计用于革兰氏阳性的宿主的质粒被称为自杀载体会包括，例如，基于 ColEl复制子的质粒，但其缺少源自革兰氏阳性质粒的复制功能(例如pMTL30，Wilkinson and Young(1994). Microbiology 140，89—95)。复制缺陷质粒会携带仅低效地在预定受体宿主复制的功能。这种质粒的特点是会在其缺少任何形式的选择压力时在预定宿主中的分离不稳定性。例如，如果这种质粒带有编码抗生素抗性的基因，并且细胞生长在缺少该抗生素的培养基中，则会产生未接受到该质粒的复制拷贝的子细胞。而且，在抗生素存在的情况下，细胞群体的生长速度总体来说会降低，由于耐抗生素基因的无效分离。很多革兰氏阳性/大肠杆菌穿梭载体在其预定宿主中复制得不佳。例如，大多数的梭菌(clostridial)质粒在可分离性上是不稳定的(Minton et al (1993) In "The Clostridia and Biotechnology”，ed. DR Woods, pp. 119-150, Butterworths-Heinemann), 1 ^ pIM13(Harris et al(2002)J. Bacteriol. 184,3586-3597)和 pIP404 和 pCB 102(Purdy et al (2002) MolecularMicrobiology 46，439_52)。凭借滚环机制通过单链脱氧核糖核酸(ssDNA)中间体而复制的质粒是革兰氏阳性质粒的最常见的科。基于这种质粒的载体经常在可分离性上是不稳定的(Gruss and Ehrlich(1989)Microbiol Mol Biol Rev 53,231-241) 可将其他质粒有意地设计成具有所需的不稳定性，例如引入至PCB102复制子的r印H基因的移码 (Davis (1998) “Regulation of botulinum toxin complex formation in Clostridium botulinum，，，PhDThesis Open University)。条件载体代表了那些在确定的、非许可条件下不能复制的质粒。这种用于大肠杆菌的载体的例子包括ColEl-衍生质粒，其在polA突变体中并不复制(Gutterson andKoshland(1983)Proc Natl Acad Sci USA.80,4894-4898 ；Saarilahti andPalva (1985) FEMS Microbiol Lett. 26，27-33)，对温度敏感的 pSClOl 复制子(Hamilton et al (1989) JBacteriol 171，4617-4622)，和基于噬粒的载体(Slater et al (1993) J Bacteriol 175, 260-4262.) 0描述了用于革兰氏阳性细菌的对温度敏感、pir-依靠和 r印A-依靠的广宿主范围质粒((Biswas et al(1993)J Bacteriol. 175，3628-3635 ； Leenhouts et al (1996)MolGen Genet 253,217-224；Miller and Mekalanos(1988) J Bacteriol 170,2575-2583) 典型地，“自杀” /非复制质粒要求DNA转移的频率高从而为了需检测的稀少的重组活动；“不稳定的” /复制缺陷的质粒不要求DNA转移的频率高，反是依靠质粒复制和染色体复制之间的生长速率的差异；条件质粒不要求DNA转移的频率高，并且能由用户控制的变量例如温度来降低其复制速率。替代地，能通过在促进质粒丢失的条件下，例如就大肠杆菌而言为磷酸盐或硫酸盐限制的培养基(Jones et al (1980) Gen Genetl80，579-584 ； Caulcott et al(1987)J Gen Microbiol 133，1881-1889)，或就酿酒酵母而言为镁限制的培养基(0' Kennedy and Patching(1997) J Ind Microbiol Biotechnol 8，319_325)培养细胞来降低微生物中很多质粒的有效复制速度。如果该宿主细胞是难以转换的细菌，供体DNA分子为允许在细菌细胞例如大肠杆菌和宿主细胞中复制和繁殖的穿梭载体是方便的。额外地或替代地，供体DNA分子可含有允许从一个细菌细胞例如大肠杆菌接合转移到细菌宿主细胞的区域。Davis，I，Carter, G, Young, M and Minton, NP (2005) "Gene Cloning in Clostridia，，，In :Handbook on Clostridia(Durre P, ed)pages 37-52, CRC Press, Boca Raton, USA Φ 11^7 Φ W 转化和接合方法。宿主梭菌(Clostridia)细胞可为梭菌(Clostridium)属的种，包括丙酮丁醇梭菌、解纤维梭菌(C. cellulolyticum)、C. phytofermentans、热纤梭菌(C. thermocellum)、 拜氏梭菌(C. beijerinckii)、糖丁酸梭菌(C. saccharobutylicum)、糖乙酸多丁醇梭菌(C. saccharoperbutylacetonicum)、难辨梭状芽孢杆菌、肉毒梭菌、生孢梭菌 (C. sporogenes)、丁酸梭菌⑴.butyric·)和产气荚膜梭菌。梭菌纲的另一优选的种是高 ilmMiilf lif (Thermoanaerobacterium saccharoIyticum) 优选地，本发明的方法进一步包含在第一同源重组活动之前以供体DNA分子转化宿主梭菌细胞的步骤。优选地，本发明的方法包含通过由于codA基因丢失所赋予的表型改变来分离宿主细胞的进一步的步骤，该宿主细胞包含第二同源重组活动的产物，以提供被变更的分离的宿主细胞。该宿主细胞可通过引入该替代的等位基因而改变。因此，本发明提供了生成已变更的宿主细胞的方法，该方法包含提供宿主细胞和实施前述方法。因此，本发明包括通过本发明的方法所得到的已变更的宿主细胞。根据另一方面，本发明提供了载体(供体DNA分子)，例如质粒，其包含codA基因， 以及至少两个用于梭菌细胞转化的同源臂。优选地，该载体还包含可选择标记。该载体还可包含用于被插入替代的等位基因的克隆位点。该载体还可包含替代的等位基因。优选地，该载体在梭菌细胞中是非复制性的或复制缺陷的。优选地，当该载体被整合到梭菌细胞的DNA，优选为染色体时，codA基因和可选择标记(如存在)被表达出来。
优选地，codA基因用作负性筛选标记。或者，该codA基因可用作正性筛选标记。优选地，codA基因使得将被重组出该载体的细胞被识别出来。优选地，该载体不包含任何codA基因之外的另外的基因，以允许选择将该载体重组出的细胞。根据本发明的任何方面，在适当时，该供体DNA分子可包含多核苷酸序列，其选自任何包含 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的群组。根据本发明的另一方面，本发明提供了包含选自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO 4和SEQ ID NO :5中任何一个的序列的载体。
现参照以下非限制性例子和附图对本发明进行描述。图IA-示意性地说明了现有技术的单交换活动；图IB-示意性地说明了现有技术的双交换同源重组活动(也可称为等位基因交换)；图IC-示意性地说明了双交换同源重组活动的第一重组活动(现有技术)；图ID-示意性地说明了图IC中的双交换同源重组活动的可能的第二重组活动 (现有技术)；图2-示意性地说明了使用携带负性筛选标记的供体质粒的第一重组活动；图3-示意性地说明了在图2中的第一重组活动之后的可能的第二重组活动；图4-显示了用于在带有或不带有FC的最低生长培养基上的codA盒的功能性测试以反向筛选难辨梭状芽孢杆菌的结果；图5-显示了被构建为通过等位基因交换而使难辨梭状芽孢杆菌的spoOA基因失活的质粒。codA负性筛选盒位于终止子的旁侧，以致它较不容易从该质粒中的其他开放阅读框架的转录连读。图6-显示了为第一重组活动的单交换整合子/产物筛选菌落的结果。顶部的两个图示描述了当同源重组分别出现在spoOA敲除盒的左同源臂[spoOA(5')]或右同源臂 [spoOA(3‘)]中时，单交换活动的两个可能的结果。标出数字的线指示了当如下所示正向和反向引物对为靶标时，通过PCR所放大的序列的区域l.F-SpoOA左同源臂/R-spoOA右同源臂；2. spoOA左同源臂的F-上游/R-catP序列；3. F_catP序列/spoOA右同源臂的R-下游。较下的图示包括三种凝胶的照片(1、2和幻，其显示了当进行筛选以显示被设计为分别放大区域1、2和3 (即上部两个图示所描述的那些区域)的PCRs产物时所得到的PCR结果。Wt，野生型难辨梭状芽孢杆菌027 ；1XL，单交换整合子，其中同源重组活动发生在spoOA 的左同源臂中(即上部的图示)；1XR，单交换整合子，其中同源重组活动发生在spoOA的右同源臂中(即中间的图示)。图7-显示了 PCR筛选双交换的产物/第二重组的产物的结果。利用在spoOA敲除盒的同源臂中粘着的引物来进行筛选。1和2中描述了在利用FC来选出双交换/第二重组活动的产物之后，两种丢失了切除质粒(从而丢失了 codA)的预期结果。利用粘着至spoOA 的左同源臂和右同源臂的引物来进行PCR筛选-如半箭头所显示。该凝胶显示了 PCR筛选七个单独克隆的结果。克隆1和3仅产生较大的PCR产物，表明它们是将catP插入spoOA 中的双交换突变体。克隆5、6和7仅产生较小的PCR产物，表明它们是第二重组活动发生在与第一重组活动相同的同源臂中的双交换突变体。因此，其为野生型回复体。最后，克隆 2和4产生较小和较大的PCR产物，其与单交换整合子对照物(IX)相同。这表明这些克隆是带有自发突变的单交换，该自发突变在FC存在的情况下减轻codA效应。图8-是图5中该质粒的DNA序列(SEQ ID NO :1)。图 9-codA 等位基因交换载体 pMTL_SC7215 (SEQ ID NO :2)。图 10-codA 等位基因交换载体 pMTL_SC7315 (SEQ ID NO :3)。图 11-codA 等位基因交换载体 pMTL_SC7415 (SEQ ID NO :4)。图 12-codA 等位基因交换载体 pMTL_SC7515 (SEQ ID NO :5)。图13-利用被codA介导的等位基因交换来构建难辨梭状芽孢杆菌R20291的 spoOA框内缺失突变体。图13A-如果天然染色体spoOA等位基因(i)概念上被分为四个片段A、B、C和D，该重组spoOA框内缺失等位基因(Asp0OA)就仅包括片段A和D (iv)。在这方面，片段A构成LHA，片段D构成RHA。如(ii)和(iii)所描述，在pMTL_SC7215 Δ spoOA 整合到该染色体中之后，单交换克隆分别通过LHA或RHA中的同源重组活动被分离。在第二同源重组活动和切除质粒从细胞丢失之后，双交换克隆被分离，该第二同源重组活动在与第一重组活动的同源臂相对的同源臂中，而该细胞停泊了天然染色体spoOA等位基因和 codA构建。这标记了等位基因交换过程的完成，借以该天然染色体spoOA等位基因被交换为重组spoOA框内缺失等位基因Δ spoOA。该过程通过在有利于放大可能性最小的产物的条件下进行PCR’ s而得以证实。图13B-利用引物Pl和P3来进行PCR证明了两个单交换克隆(克隆1和2)的分离，其中第一重组活动发生在LHA中。图13C-利用引物P2和P4 来进行PCR证明了另外两个单交换克隆(克隆3和4)的分离，其中该第一重组活动发生在 RHA中。图13D-最后，利用引物Pl和P4来进行PCR显示出四个双交换克隆(克隆1、3、6 和7)的分离，其中天然染色体spoOA等位基因被交换为较小的重组spoOA框内缺失等位基因AspoOA。为了绝对的信心，这些PCR产物被测序，并被证实为重组spoOA框内缺失等位基因Δ spoOA。图13E-用于被codA介导的等位基因交换以构建难辨梭状芽孢杆菌R20291 的spoOA框内缺失突变体例证的筛选引物的细节。图14-利用被codA介导的等位基因交换来构建难辨梭状芽孢杆菌R20291的tcdC 框内缺失突变体。图14A-如果天然染色体tcdC等位基因(i)概念上分为四个片段A、B、 C和D，重组tcdC框内缺失等位基因(AtcdC)就仅包括片段A和D(iv)。在这方面，片段A 构成LHA，片段D构成RHA。如(ii)和(iii)所描述，在pMTL_SC7215 Δ tcdC整合到该染色体中之后，单交换克隆分别通过LHA或RHA中的同源重组活动被分离。在第二同源重组活动和切除质粒从细胞丢失之后，双交换克隆被分离，该第二同源活动在与第一同源重组活动的同源臂相对的同源臂中，该细胞停泊了天然染色体tcdC等位基因和codA构建。这标记了等位基因交换过程的完成，借以天然染色体tcdC等位基因被交换为重组tcdC框内缺失等位基因AtcdC。图14B和14C-该过程通过在有利于放大可能性最小的产物的条件下进行PCR’s而得以证实。分别利用引物Pl和P3(B)，以及P2和P4(C)来进行独立的PCR 证实了在LHA中发生第一重组活动的单交换克隆的分离。图14D-利用引物Pl和P4来进行PCR’ s显示出两个双交换克隆(克隆1和2)的分离，其中天然染色体tcdC等位基因被交换为较小的重组tcdC框内缺失等位基因AtcdC(vii)。为获得绝对的信心，这些PCR产物被测序，并被证实为重组spoOA框内缺失等位基因Δ tcdC。图14E-用于被codA介导的等位基因交换以构建难辨梭状芽孢杆菌R20291的tcdC框内缺失突变体例证的筛选引物的细节。图15-利用被codA介导的等位基因交换来将单碱基插入难辨梭状芽孢杆菌 R20291的tcdC开放阅读框架。图15A-如果天然染色体tcdC等位基因(i)概念上分为三个片段A、B和C，重组tcdC::117A等位基因(iv)就包括片段A、B*和C，这里BM又以一个额外的碱基对(即117A)而与B不同。在这方面，片段“A”构成LHA，片段“C”构成RHA。 在pMTL-SC7215::tcdC::117A整合到染色体中之后，分别如(ii)和(iii)所描述，单交换克隆分别通过LHA或RHA中的同源重组活动被分离。在第二同源重组活动和切除质粒从细胞丢失之后，双交换克隆被分离，该第二同源重组活动在与第一重组活动的同源臂相对的同源臂中，该细胞停泊了天然染色体tcdC等位基因和codA构建。这标记了等位基因交换过程的完成，借以天然染色体tcdC等位基因被交换为重组tcdC::117A等位基因。图15B 和15C-该过程通过利用引物Pl和P2来进行PCR而得以证实，其清楚地显示了四个双交换克隆从单交换克隆1被分离。产生于四个双交换克隆中各克隆的PCR产物的测序显示了克隆3和4是停泊了替代R20291野生型tcdC等位基因的染色体中tcdC: 117等位基因的重组体。由于该第二重组活动发生在与该第一重组活动的同源臂相同的同源臂中，所以克隆1和2为仍然停泊了 R20291野生型tcdC等位基因的野生型回复体。这些结果通过利用引物“tcdC-AS-Fl”和“tcdC-AS-Rl”来进行等位基因特异性PCR而得以证实，如果模板 DNA停泊了 tcdC::117A等位基因(C)，该些引物就仅产出PCR产物。图15D-最后，为证实等位基因特异性PCR产物不是受到污染的难辨梭状芽孢杆菌630的阳性对照DNA的结果， 利用仅会产出停泊tcdC: 117A等位基因的难辨梭状芽孢杆菌R2(^91DNA的PCR产物的引物“tcdC-AS-Fl”和“tcdA-Rsl”来重复进行等位基因特异性PCR，S。图15E-用于被codA 介导的等位基因交换以将单碱基插入难辨梭状芽孢杆菌R20291的tcdC开放阅读框架例证的筛选引物的细节。图16-利用被codA介导的等位基因交换来将tcdB的催化“D )”结构域改变为 “AXA”。图16A-天然染色体tcdB等位基因(i)概念上分为三个片段A、B和C，这里“B”带有DNA序列“ATGTTGA”。该重组tcdB-D ^86/8AXA等位基因(iv)包括片段A、B*和C，这里片段“A”构成LHA，片段“C”构成RHA，“B*”与“B”的不同在于其带有DNA序列CTGTTG￡。 如(ii)和(iii)所描述，在pMTL-SC7315: :tcdB-D ^86/8AXA整合到该染色体中之后，单交换克隆分别通过LHA或RHA中的同源重组活动被分离。在第二同源重组活动和切除质粒从细胞丢失之后，双交换克隆被分离，该第二同源重组活动在与第一重组活动的同源臂相对的同源臂中，该细胞停泊了天然染色体tcdB等位基因和codA构建。这标记了等位基因交换过程的完成，借以天然染色体tcdB等位基因被交换为重组tcdB-D ^86/8AXA等位基因。图16B和16C-该过程通过利用产物Pl和P2进行PCR而得以证实，其清楚地显示了两个单交换克隆被分离(B)以及两个双交换克隆被分离(C)。产生于该两个双交换克隆中各克隆的PCR产物的测序显示了二者都是停泊了替代R20291野生型tcdB的染色体上的重组 tcdB-D ^86/8AXA等位基因的重组体。图16D-用于被codA介导的等位基因交换以将tcdB 的催化“D )”结构域改变为“AXA”例证的筛选引物的细节。
具体实施方式
codA表达质粒的构建该codA 表达盒从 Fox et al.，Gene Therapy. (1996) 3 :173-178 所用的载体被分离并克隆到PMTL960中。这质粒被用于测试大肠杆菌和难辨梭状芽孢杆菌中的该codA基因的功能。在大肠杆菌中，该构建如预计般起作用，允许在FC缺少的情况下生长而不允许在FC存在的情况下生长。类似地，如图4所显示，当被转化入难辨梭状芽孢杆菌并在含有 100 μ g/ml FC的最低培养基(修改自Karlsson等人所述的配方(1999)Microbiology 145 1683-1693)上生长时，停泊codA盒的难辨梭状芽孢杆菌细胞可被区别出来。也就是说，表达codA的细胞并没有生长。Karlsson等人所述的该培养基包含
权利要求
1.一种在宿主梭菌细胞中双交换同源重组的方法，包含供体DNA分子和该宿主细胞的DNA之间的第一同源重组活动，从而在该宿主细胞中形成该第一重组活动的产物，其中该供体DNA分子包含codA基因和至少两个同源臂；以及在该第一同源重组活动的产物内的第二重组活动，借以在宿主细胞中形成可通过该 codA基因的丢失而可选择的该第二同源重组活动的产物。
2.如权利要求1所述的方法，其中该宿主细胞的DNA包含该宿主细胞的染色体或质粒。
3.如权利要求1或权利要求2所述的方法，其中该供体DNA分子进一步包含可选择的等位基因。
4.如任一前述权利要求所述的方法，其中该codA基因是负性筛选标记。
5.如权利要求1至3中任一权利要求所述的方法，其中该codA基因是正性筛选标记。
6.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子在该宿主细胞中不被有效地复制。
7.如任一前述权利要求中所述的方法，进一步包含选择该第一同源重组活动的产物的步骤。
8.如任一前述权利要求中所述的方法，进一步包含选择该第二同源重组活动的产物的步骤。
9.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子进一步包含在该第一同源重组活动中被引入至该宿主DNA的替代的等位基因。
10.如权利要求9所述的方法，其中该替代的等位基因在该第二同源重组活动之后被保留在该宿主DNA中。
11.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子包含至少两个同源臂。
12.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子是质粒。
13.如权利要求12所述的方法，其中该质粒是非复制质粒、复制缺陷质粒或条件质粒。
14.如任一前述权利要求所述的方法，其中该梭菌细胞是梭菌属或热厌氧杆菌属的物种。
15.如任一前述权利要求所述的方法，其中该方法进一步包含在该第一同源重组活动之前以供体DNA分子转化宿主梭菌细胞的步骤。
16.如任一前述权利要求所述的方法，其中该方法进一步包含通过由于该codA基因丢失而得的表型改变来分离该宿主细胞的步骤，该宿主细胞包含该第二同源重组活动的产物。
17.如任一前述权利要求所述的方法，其中该供体DNA分子包含多核苷酸序列，其选自任何包含 SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 的群组。
18.—种生成已变更的宿主细胞的方法，包含提供宿主细胞和实施任一前述权利要求所述的方法。
19.已变更的宿主细胞，其由任一前述权利要求所述的方法得到。
20.载体，其包含该codA基因和至少两个用于转化梭菌细胞的同源臂。
21.载体，其包含选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 和 SEQ ID NO :5 中任何的序列。
全文摘要
本发明涉及在宿主梭菌细胞中的双交换同源重组的方法，包含供体DNA分子和宿主细胞的DNA之间的第一同源重组活动，以在该宿主细胞内形成第一重组活动的产物，其中该供体DNA分子包含codA基因和至少两个同源臂；在该第一同源重组活动的产物内的第二重组活动，借以在该宿主细胞中形成可通过该codA基因的丢失而可选择的第二同源重组活动的产物；以及有关的载体和已变更的宿主细胞。
文档编号C12N15/74GK102361986SQ201080013200
公开日2012年2月22日 申请日期2010年1月21日 优先权日2009年1月22日
发明者斯蒂芬·托马斯·卡特曼, 纳杰尔·彼得·明顿 申请人:诺丁汉大学