专利名称：用于上皮干细胞和包含所述干细胞的类器官的培养基的制作方法
用于上皮干细胞和包含所述干细胞的类器官的培养基本发明涉及用于培养上皮干细胞、尤其是肠和结肠上皮干细胞的新的培养基以及用于培养包含所述干细胞的类器官的新的培养基。本发明还涉及用本发明的培养基所培养的细胞后代和类器官，以及所述后代在毒性测定和再生医学中的用途。自我更新的小肠上皮排列成隐窝和绒毛(Gregorieff and Clevers, 2005. Genes Dev 19,877-90)。细胞在隐窝中新生成，并在绒毛顶部通过凋亡而丧失，导致小鼠中上皮的更新时间为5天。一直以来都认为自我更新的干细胞定居在隐窝底部附近，并且产生能向所有谱系分化的快速增殖的过渡放大(TA)细胞。估计每个隐窝的干细胞数量为4-6个 (Bjerknes and Cheng, 1999. Gastroenterology 116，7_14)。三种分化的细胞类型，即肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞由TA细胞形成，并且继续沿着隐窝-绒毛轴在结合带 (coherent band)中迁移。每个绒毛接受来自多个不同的隐窝的细胞。第四种主要的分化细胞类型是帕内特细胞，其定居在隐窝底部。最近鉴定出在第五种细胞类型循环隐窝基部柱状(CBC)细胞中特异表达的基因 Lgr5，所述循环隐窝基部柱状细胞是散布在帕内特细胞之间的小细胞(在图8b用黑色箭头指示)(Barker et al. ,2007. Nature 449:1003-1007)。利用将 GFP/他莫西芬诱导型 Cre 重组酶盒整合入Lgr5基因座中的小鼠，通过谱系追踪显示，Lgr5+CBC细胞构成产生所有上皮细胞类型的多能干细胞，甚至在Cre诱导后14个月评估时也是如此。最近发现，除了 Lgr5之外，Lgr6(而不是Lgr4)也是成体干细胞的特有标志物。 Lgr5在脑、肾、肝脏、视网膜、胃、肠、胰腺、乳房、毛囊、卵巢、肾上腺髓质和皮肤的干细胞中表达，同时Lgr6在脑、肺、乳房、毛囊皮肤的干细胞中表达。通常认为，需要上皮干细胞和上皮下成纤维细胞的密切接触来锚定和支持上皮干细胞，和提供产生正确极化的三维结构所必需的正确方向。尽管已经描述了多种用于培养包括肠上皮干细胞在内的初级上皮干细胞的培养体系(Bjerknes and Cheng, 2006. Methods Enzymol 419 :337-83)，但是至今还没有建立能维持上皮干细胞的多能性的长期培养体系。此外，还没有已知能用于保护从结肠或肠分离的隐窝的基本隐窝-绒毛生理机能，或能用于保护分离的胰腺组织块或胃组织块的基本生理机能的培养体系。因此，本发明提供了培养上皮干细胞、培养包含所述上皮干细胞的分离的上皮组织块或腺瘤细胞的方法，所述方法包括提供细胞外基质，将上皮干细胞，包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与所述细胞外基质一起孵育，在存在细胞培养基的条件下， 培养所述干细胞、分离的组织块或腺瘤细胞，所述细胞培养基包含动物或人类细胞的基础培养基，并向该细胞培养基添加5-500ng/ml的骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂或至少5并且不超过500ng/ml的有丝分裂生长因子，如果培养上皮干细胞和分离的组织块，还添加Wnt 激动剂。本发明人意外发现，本发明的方法允许培养上皮干细胞、从包含所述干细胞的小肠、结肠、胃和胰腺所分离的组织块和腺瘤细胞，同时还能维持保留未分化表型和自我维持能力的干细胞的存在。例如，按本发明方法培养的分离的隐窝发育成为隐窝-绒毛的类器官，所述隐窝-绒毛的类器官包含衬有绒毛样上皮的中央腔。隐窝中存在的干细胞维持分离的隐窝的生长。产生的类器官经历多次隐窝分裂事件。更意外的是观察到，在不存在干细胞龛的条件下，本发明方法允许单个分离的上皮干细胞长成隐窝-绒毛的类器官。从胃幽门部分离的胃组织块充当肠隐窝的类器官。该单元的开放的上部分封闭，并且腔充有凋亡细胞。新形成的胃的类器官经历连续的出芽事件(表明腺体分裂)，同时保持它们与中央腔的极性。此外，培养胰腺组织块导致出现能表达胰岛素和其它胰岛特异性标志物的胰岛样结构，类似于郎格罕氏胰岛。衬于小肠和大肠幽门部的上皮包括腔突起、绒毛和内陷、隐窝。沿隐窝-绒毛轴的每个细胞被极化，其中肠绒毛顶部的细胞或结肠隐窝上部的细胞的分化程度是最高，并且被持续丢失于腔中。定居于隐窝基部的干细胞的连续增殖和定居于隐窝中部的祖细胞的大量增殖确保脱落细胞的正确更替。在成年人和成年小鼠的多个器官中发现干细胞。尽管个体组织中成体干细胞的确切特性存在很大的变化，但是成体干细胞都具有以下特性它们保留了未分化的表型；它们的后代能向相关组织中存在的所有谱系分化；它们在整个生命中保留自我维持能力；它们能在损伤后再生为相关组织。干细胞定居于专门的场所，即干细胞龛，所述干细胞龛提供合适的细胞-细胞接触和维持所述干细胞群的信号。上皮干细胞能形成组成上皮的不同的细胞类型。诸如皮肤和肠的某些上皮表现出快速的细胞更新，这表明定居的干细胞必须连续增殖。诸如肝脏或胰腺的其它上皮在正常条件下表现出非常慢的更新。可以通过本领域技术人员已知的方案从十二指肠、小肠和大肠(包括空肠、回肠和结肠)和胃幽门部分离隐窝。例如，可以通过将分离的组织与螯合剂一起孵育来分离隐窝，所述孵育使细胞从其与基膜和基质细胞类型的钙依赖性和镁依赖性相互作用中释放出来。洗涤组织之后，用载玻片从粘膜下层刮出上皮细胞层，并将其切碎。随后在胰酶或更优选EDTA和/或EGTA中孵育，并利用例如过滤和/或离心步骤从隐窝分离未消化的组织块和单细胞。诸如胶原酶和/或分散酶I的其它蛋白水解酶可以用来代替胰酶。同样的方法用于分离胰腺和胃的组织块。从上皮组织分离干细胞的方法在本领域是已知的。优选的方法基于以下事实干细胞在其表面表达Lgr5和/或Lgr6，Lgr5和/或Lgr6属于大的G蛋白偶联受体(GPCR) 超家族。Lgr亚家族的独特之处在于携带大的富含亮氨酸的胞外结构域，该结构域对于配体结合是重要的。文献中尚没有描述Lgr5和Lgr6的配体。因此，优选的方法包括从所述上皮组织制备细胞悬液，使所述细胞悬液与Lgr5和/或Lgr6结合化合物接触，分离所述Lgr5 和/或Lgr6结合化合物，并从所述结合化合物分离干细胞。优选的是从分离的隐窝通过机械方式产生包含上皮干细胞的单细胞悬液，因为发现在这个阶段用胰酶处理的上皮干细胞导致相当低的存活率。优选的Lgr5和/或Lgr6结合化合物包括抗体，例如特异性地识别和结合Lgr5或 Lgr6的胞外结构域的单克隆抗体，例如包括小鼠和大鼠单克隆抗体的单克隆抗体。禾Ij用这种抗体，例如借助于磁珠或通过荧光活化细胞分选可以分离表达Lgr5和/或Lgr6的干细胞，这对本领域技术人员是显而易见的。在本发明的优选方法中，从隐窝、胃组织块或胰腺组织块分离所述上皮干细胞。例如，从分离自肠的隐窝中分离所述上皮干细胞。优选的上皮干细胞分离自小肠(包括十二指肠、空肠和回肠)、胰腺或胃。优选在这样的微环境中培养分离的干细胞所述微环境至少在一定程度上模拟所述干细胞天然定居的细胞龛。通过在生物材料存在的条件下培养所述干细胞来模拟所述细胞龛，所述生物材料例如代表控制干细胞命运的重要调节信号的基质、骨架和培养基底。所述生物材料包括天然的、半合成的和合成的生物材料，和/或其混合物。骨架提供二维或三维网络。适用于所述骨架的合成材料包括选自多孔固体、纳米纤维和水凝胶的聚合物，例如，包含自组装肽的肽、由聚乙二醇磷酸酯、聚乙二醇延胡索酸酯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚纤维素醋酸酯和/或以上的共聚物组成的水凝胶(参见，例如，Saha et al., 2007.Curr Opin Chem Biol. 11(4) :381-387 ；Saha et al.,2008.Biophysical Journal 95 :4426-4438 ；Little et al.，2008. Chem. Rev 108,1787-1796)。如本领域技术人员所已知的，骨架的机械特性(例如弹性)影响干细胞的增殖、分化和迁移。优选的骨架包含生物可降解的(共)聚合物，在移植入个体中之后所述可降解的(共)聚合物被天然存在的组分替代，例如从而促进组织再生和/或伤口愈合。此外，优选的是，所述骨架在移植入个体中之后基本上不会诱导免疫应答。所述骨架补充有天然的、半合成的或合成的配体，这些配体提供干细胞的增殖和/或分化、和/或迁移所需的信号。在优选的实施方案中，所述配体包含限定的氨基酸片段。所述合成的聚合物的实例包括Pluronic: F127嵌段共聚物表面活性剂(BASF)和 Ethisorb (Johnson and Johnson)。细胞龛在一定程度上由干细胞和周围的细胞、以及所述龛中的细胞产生的细胞外基质(ECM)所确定。在本发明的优选方法中，使分离的隐窝或上皮干细胞附着于ECM。ECM 由多种多糖、水、弹性蛋白和糖蛋白组成，其中所述糖蛋白包括胶原蛋白、内动蛋白(巢蛋白)、纤连蛋白和层粘连蛋白。ECM由结缔组织细胞分泌。不同类型的ECM是已知的，其包括不同的组成，所述不同的组成包含不同类型的糖蛋白和/或糖蛋白的不同组合。可以通过在容器中培养产ECM的细胞(例如成纤维细胞)来提供所述ECM，然后取出这些细胞并添加分离的隐窝或上皮干细胞。产细胞外基质的细胞的实例是主要产胶原蛋白和蛋白聚糖的软骨细胞，主要产IV型胶原蛋白、层粘连蛋白、间质前胶原蛋白和纤连蛋白的成纤维细胞， 和主要产胶原蛋白(I、III和V型)、硫酸软骨素蛋白聚糖、透明质酸、纤连蛋白和肌糖蛋白 C的结肠成肌纤维细胞。可选地，所述ECM是商业提供的。可商购的细胞外基质的实例是细胞外基质蛋白anvitrogen)和基质胶(Matrixgel ) (BD Biosciences)。利用ECM培养干细胞能提高干细胞的长期存活和未分化干细胞的持续存在。在不存在ECM的条件下，不能长时间培养干细胞培养物，并且不能观察到未分化的干细胞的持续存在。此外，ECM的存在允许培养三维的组织类器官，在不存在ECM的条件下不能培养三维的组织类器官。本发明方法中所用的优选ECM包含至少两种不同的糖蛋白，例如两种不同类型的胶原蛋白或一种胶原蛋白与一种层粘连蛋白。所述ECM可以是合成的水凝胶细胞外基质或天然存在的ECM。最优选的ECM由基质胶(Matrixgel ) (BD Biosciences)提供，其包含层粘连蛋白、内动蛋白和胶原蛋白IV。本发明方法中所用的细胞培养基包括任何细胞培养基。优选的细胞培养基是用基于碳酸盐的缓冲液缓冲至PH7. 4 (优选7. 2-7. 6或至少7. 2且不高于7. 6)的规定合成培养基，同时细胞在含5% -10% CO2或至少5%且不超过10% CO2，优选5% CO2的环境中培养。优选的细胞培养基选自补充有谷氨酰胺、胰岛素、青霉素/链霉素和转铁蛋白的DMEM/F12 和RPMI1640。在另一个优选的实施方案中，使用改进DMEM/F12或改进RPMI，其经优化用于无血清培养，并且包含胰岛素。在这种情况下，所述改进DMEM/F12或改进RPMI培养基优选补充谷氨酰胺和青霉素/链霉素。此外，优选的是，所述细胞培养基补充纯化的、天然的、 半合成的和/或合成的生长因子，并且不包含非规定组分，诸如胎牛血清或小牛血清。诸如 B27anvitrogen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma)和N2 (Invitrogen)的补充物刺激某些细胞的增殖，并且如果需要，也可以将这些补充物加到培养基中。添加到基础培养基中的成分是BMP抑制剂。BMP作为二聚配体与由两种不同的受体丝氨酸/苏氨酸激酶(即I型和II型受体)组成的受体复合物结合。II型受体将I型受体磷酸化，导致该受体激酶的活化。I型受体随后将特异性受体底物(SMAD)磷酸化，产生的信号转导通路引起转录活性。所述BMP抑制剂被定义为与BMP分子结合而形成复合物的试剂，其中例如通过阻止或抑制BMP分子与BMP受体的结合来中和BMP活性。可选地，所述抑制剂是起拮抗剂或反向激动剂作用的试剂。这类抑制剂与BMP受体结合，并阻止BMP与所述受体结合。后者试剂的实例是抗体，所述抗体与BMP受体结合，并防止BMP与抗体结合的受体结合。所述BMP抑制剂将细胞中的BMP依赖性活性抑制到相对于不存在所述抑制剂时的 BMP活性水平的至多90%，更优选至多80%、更优选至多70%、更优选至多50%、更优选至多30%、更优选至多10%、更优选0%。如本领域技术人员所已知的，可以通过测定BMP的转录活性来测定BMP活性，例如Zilberberg et al. , 2007. BMC Cell Biol. 8 :41中所示。已知几类天然的BMP结合蛋白，包括Noggin (P^rotech)、脊索蛋白和包含脊索蛋白结构域的脊索蛋白样蛋白(R&D sytems)、卵泡抑素和包含卵泡抑素结构域的卵泡抑素相关蛋白(R&D sytems)、DAN和包含DAN半胱氨酸结结构域的DAN样蛋白(R&D sytems)、硬化蛋白/SOST (R&D sytems)、核心蛋白多糖(R&D sytems)和 α-2 巨球蛋白(R&D systems)。本发明方法中所用的优选的BMP抑制剂选自Noggin、DAN和包括Cerberus和 Gremlin在内的DAN样蛋白(R&D sytems) 0这些可扩散的蛋白能以不同的亲和度与BMP配体结合，并抑制这些BMP配体接近信号转导受体。向基础培养基中添加任何这些BMP抑制剂能防止干细胞丢失，否则在培养约2-3周之后就会发生干细胞丢失。最优选的BMP抑制剂是Noggin。优选以至少lOng/ml的浓度将Noggin添加到基础培养基，Noggin的浓度更优选至少20ng/ml、更优选至少50ng/ml、更优选至少100ng/ml。 最优选的浓度是约lOOng/ml或lOOng/ml。在干细胞的培养过程中，优选每两天向培养基添加所述BMP抑制剂，而优选每四天更换培养基。添加到基础培养基中的另一成分是Wnt激动剂。Wnt信号通路由Wnt蛋白与Frizzled受体家族成员的细胞表面受体结合时发生的一系列事件界定。这导致 Dishevelled家族蛋白的活化，这会抑制包含axiruGSK-3的蛋白和蛋白APC的复合体从而降解细胞内联蛋白。产生的核富集的联蛋白通过TCF/LEF家族转录因子而增强转录。Wnt激动剂被定义为激活细胞中TCF/LEF介导的转录的试剂。因此，Wnt激动剂选自结合并活化Frizzled受体家族成员(包括任何和所有的Wnt家族蛋白)的真正的 Wnt激动剂、细胞内β-联蛋白降解的抑制剂和TCF/LEF的激活剂。相对于不存在Wnt激动剂时的Wnt活性水平，所述Wnt激动剂将细胞中的Wnt活性刺激至少10 %，更优选至少 20%、更优选至少30%、更优选至少50%、更优选至少70%、更优选至少90%、更优选至少 100%。如本领域技术人员所已知的，可以通过测定Wnt的转录活性来确定Wnt活性，例如通过 pTOPFLASH 和 pFOPFLASH Tcf 荧光素酶报告构建体(Korinek et al.，1997. Science 275 :1784-1787)。Wnt激动剂包括分泌型糖蛋白，该分泌型糖蛋白包括Wnt-l/lnt-l ；ffnt-2/ Irp(Int-l 相关蛋白)；Wnt-2b/13 ；ffnt-3/Int-4 ；ffnt-3a (R&D sytems) ；ffnt-4 ；ffnt-5a ； ffnt-5b ；ffnt-6(Kirikoshi H et al.2001. Biochem Biophys Res Com 283 :798-805)； ffnt-7a(R&D sytems) ；ffnt-7b；ffnt-8a/8d ；ffnt-8b ；ffnt-9a/14 ；ffnt-9b/14b/15 ；Wnt-IOa ； Wnt-10b/12 ;Wnt-ll 和 Wnt-16。在“THE WNT FAMILY OF SECRETED PROTEINS (分泌型蛋白的WNT家族)”，R&D Systems目录，2004中提供了关于人Wnt蛋白的概述。其它的Wnt激动剂包括分泌型蛋白的R-spondin家族，该家族参与Wnt信号通路的激活和调节，并由4个成员(R-spondin 1 (NU206, Nuvelo, San Carlos, CA)、R-spondin 2 (R&D sytems)、R-spondin 3和R-spondin 4)组成；Wnt激动剂还包括Norrin (也被称为Norrie病蛋白或NDP) (R&D sytems)，其是功能类似于Wnt蛋白的分泌型调控蛋白，能以高亲和力与Frizzled-4受体结合并诱导 Wnt 信号通路的活化(Kestutis Planutis et al. (2007) BMC Cell Biol. 8:12)。 最近鉴定出Wnt信号通路的小分子激动剂，即氨基嘧啶衍生物，并且其也明确包括在Wnt激动剂(Liu et al. (2005) Angew Chem Int Ed Engl. 44，1987-90)中。已知的GSK 抑制剂包括小干扰 RNA(siRNA ；Cell Signaling)、锂(Sigma)， kenpaullone(Biomol International ；Leost, Μ. et al. (2000)Eur.J.Biochem.267, 5983-5994)、6-溴靛玉红-30-丙酮厢(Mei jer, L. et al. (2003) Chem. Biol. 10, 1255-1266)、SB 216763 和 SB 415286 (Sigma-Aldrich)、以及能阻止 GSK-3 与 axin 相互作用的FRAT家族成员和FRAT衍生的肽。由Meij er et al.，(2004) Trends in Pharmacological Sciences 25，471-480提供了综述，通过引用将其并入本文。测定 GSK-3抑制水平的方法和测定是本领域技术人员已知的，并且包括例如Liao et al 2004， Endocrinology, 145 (6) :2941-9)所描述的方法和测定。在优选的实施方案中，所述Wnt激动剂选自Wnt家族成员、R-spondin 1-4,Norrin 和GSK抑制剂中的一种或多种。本发明人发现，向基础培养基添加至少一种Wnt激动剂对于上皮干细胞或分离的隐窝的增殖是必需的。在另一个优选的实施方案中，所述Wnt激动剂包含R-spondin 1或由R-spondin 1组成。优选地，以至少50ng/ml的浓度将R-spondin 1添加到基础培养基中，R-spondin 1的浓度更优选至少100ng/ml、更优选至少200ng/ml、更优选至少300ng/ml、更优选至少 500ng/ml。R-spondin 1的最优选的浓度是约500ng/ml或500ng/ml。在干细胞的培养过程中，优选每两天向培养基添加所述Wnt家族成员，而优选每四天更换培养基。在优选的实施方案中，Wnt激动剂选自R_spondin、Wnt_3a和Wnt_6。更优选地， R-spondin和Wnt-3a都用作Wnt激动剂。该组合是特别优选的，因为该组合对类器官形成具有意想不到的协同效应。对于R-spondin，优选的浓度是约500ng/ml或500ng/ml，并且对于Wnt3a，优选的浓度是约100ng/ml或100ng/ml。添加到基础培养基中的另一成分是选自生长因子家族的有丝分裂生长因子，
8所述生长因子家族包括表皮生长因子伍6 ;( 印1~0切(^)、转化生长因子-0 (TGF- α ； P印rotech)、基本的成纤维细胞生长因子(bFGF ；P印rotech)、脑源性神经营养因子(BDNF ； R&D Systems)和角质化细胞生长因子(KGF ;Peprotech)。EGF对于多种培养的外胚层和中胚层细胞是有效的有丝分裂因子，并且对特定细胞的体内和体外分化和细胞培养物中的某些成纤维细胞的分化具有重要影响。EGF前体以膜结合分子的形式存在，其经蛋白水解被切割而产生能刺激细胞的53个氨基酸的肽激素。优选的有丝分裂生长因子是EGF。优选地， 以5-500ng/ml或至少5且不高于500ng/ml的浓度将EGF添加到基础培养基中。优选的浓度为至少 10、20、25、30、40、45 或 50ng/ml 且不高于 500、450、400、350、300、250、200、150 或lOOng/ml。更优选的浓度为至少50且不超过lOOng/ml。更优选的浓度为约50ng/ml或 50ng/ml。同样的浓度可用于FGF，优选用于FGFlO或FGF7。如果使用多于一种FGF，例如 FGF7和FGF10，那么FGF的浓度按上文所述来限定并且指的是所用的FGF的总浓度。在干细胞的培养过程中，优选每两天向培养基添加所述有丝分裂生长因子，而优选每四天更换培养基。可以使用bFGF家族的任何成员。优选地，使用FGF7和/或FGF10。FGF7也被称为KGF(角质化细胞生长因子)。在另一个优选的实施方案中，向基础培养基添加有丝分裂生长因子的组合，例如，EGF和KGF，或者EGF和BDNF。在另一个优选的实施方案中，向基础培养基添加有丝分裂生长因子的组合，例如，EGF和KGF，或者EGF和FGF10。本发明方法的另一个实施方案包括含有RockO^ho激酶)抑制剂的培养基。发现添加Rock抑制剂能防止失巢凋亡，尤其当培养单一干细胞时。所述Rock抑制剂优选地选自R)_(+)_反式-4-(1-氨基乙基)-N-(4-吡啶基)环己烷甲酰胺二盐酸盐单水合物 (Y-27632 ；Sigma-Aldrich)、5-(1，4_ 二氮杂-1-基磺酰基)异喹啉(法舒地尔或 HA1077 ； Cayman Chemical)和(S) - (+)-2-甲基 _1_[ (4-甲基-5-异喹啉基)磺酰基]-六氢-1H-1， 4-二氮杂卓二盐酸盐(H-1152 ;Tocris Bioschience)。在培养所述干细胞的前7天中，优选每两天向培养基添加所述Mio激酶抑制剂，例如Y-27632。Y27632的优选浓度是10 □ M。在另一个实施方案中，本发明的方法包括还含有Notch激动剂的培养基。已经表明，Notch信号转导在细胞命运决定以及在细胞存活和增殖中起重要的作用。Notch受体蛋白能与多种表面结合配体或分泌型配体相互作用，所述表面结合配体或分泌型配体包括但不限于Delta 1、Jagged 1和2，以及Delta样1、Delta样3、Delta样4。配体结合后， Notch受体由涉及ADAM蛋白酶家族成员的一系列切割事件和受λ分泌酶早老素调节的膜内切割而被激活。结果是Notch的细胞内结构域转位到细胞核，在细胞核中Notch的细胞内结构域转录激活下游基因。优选的Notch激动剂选自Jagged 1和Delta 1，或其活性片段或衍生物。最优选的Notch激动剂是具有序列CDDYYYGFGCNKFCRra的DSL肽(Dontu et al. ,2004. Breast Cancer Res 6 :R605_R615)。优选以 10 μ M-IOOnM或至少 10 μ M且不高于 IOOnM的浓度使用所述DSL肽(ANA spec) 0尤其在培养的第一周，添加Notch激动剂能使培养效率增加2-3倍。在培养所述干细胞的前7天中，优选每两天向培养基添加所述Notch 激动剂。Notch激动剂被定义为能刺激细胞中Notch活性的分子，相对于不存在Notch激动剂时Notch的活性水平，所述分子将细胞中的Notch活性刺激至少10%，更优选至少20%、 更优选至少30 %、更优选至少50 %、更优选至少70 %、更优选至少90 %、更优选至少100 %。 如本领域技术人员所已知的，可以通过测定Notch的转录活性来确定Notch活性，例如利用Hsieh et al.，1996. Mol. Cell. Biol. 16，952-959 所述的 4xwtCBFl_ 荧光素酶报告构建体。本发明还提供了这样的细胞培养基，其包含动物或人类细胞的基础培养基，并且所述基础培养基添加了骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、Wnt激动剂和5-500ng/ml或至少5 且不超过500ng/ml的、选自EGF、TGF 口、KGF、FGF10和FGF的有丝分裂生长因子。优选地， 有丝分裂因子选自EGF、TGF- □和KGF、或选自EGF、TGF- □和FGF7、或选自EGF、TGF- □和 FGF、或选自EGF和KGF、或选自EGF和FGF7、或选自EGF和FGF、或选自TGF □和KGF、或选自 TGF □和FGF7、或选自TGF □和FGF。EGF可以用TGF □替换。根据待获取的类器官将鉴定几种优选的培养基。本发明的细胞培养基允许细胞外基质上上皮干细胞或分离的隐窝的存活和/或增殖和/或分化。术语细胞培养基(cell culture medium)与培养基(medium)， 培养基(culture medium)或细胞培养基(cell medium)同义。在本发明优选的方法中，第一培养基包含作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和角质化细胞生长因子、和作为Wnt激动剂的R-spondin 1，并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。可以用FGF或FGFlO替换KGF。[Leul5]_促胃液素I、 Exendin和/或烟酰胺也可以被添加到第一培养基中。在另一个优选的实施方案，被称为第二培养基的所述培养基与所述第一培养基相同，除了不含Noggin，并且优选不含[Leul5]-促胃液素LExendin和/或烟酰胺。因此，所述第二培养基包含作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和角质化细胞生长因子和作为 Wnt激动剂的R-spondin 1，并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。也可以用FGF或FGFlO 替换KGF。这两种细胞培养基支持包含胰腺干细胞的胰腺组织块，所述胰腺干细胞在基质胶细胞外基质中这些培养基中生长，从而在细胞外基质上形成包含胰岛样结构的胰腺的类器官。不含Noggin的第二培养基是最低培养基，而含Noggin的第一培养基形成用于胰腺组织块扩增的改良的培养基。扩增培养基优选是在至少2天培养中能促进细胞的存活和/或
增殖的培养基。第三培养基被设计成能在至少5天内促进、诱导细胞向胰腺的类器官分化。一种优选的向胰腺的类器官形成的分化标志物是神经发生素KNeurogenin-； )，能利用 RT-PCR或免疫组化检测神经发生素-3的表达。例如，当在分化培养基中培养至少5天之后，能利用RT-PCR或免疫组化检测到神经发生素-3时，则作为第三或第四培养基的所述分化培养基被认为是有功能的。优选地，在以上所定义的第一或第二培养基的培养基中进行第一扩增步骤之后，再实施该分化步骤。该第三培养基与以上的第二培养基相同，除了不含 FGF或KGF或FGF10。该第三培养基包含表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1， 并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。第四培养基被设计成与所述第一培养基相同，其中所述第四培养基含还补充有 [Leul5]_促胃液素I和/或Exendin。所述第三培养基是最低分化培养基，而所述第四培养基是改良分化培养基。分化培养基是优选诱导或促进培养至少5天内的细胞发生特异性分化的培养基。对于胰腺的类器官，可以通过检测本文之前所定义的与胰腺谱系相关的特异标志物的存在来测定分化。与胰腺谱系相关的其它标志物的实例包括在分化培养基中培养至少7、8、9、10天之后，可利用RTPCR或免疫组化检测的胰岛素分泌。因此，在获得和/或培养胰腺的类器官的优选的方法中，在第一步骤中，在第一或第二培养基中培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞，随后在第二步骤中，在第三或第四培养基中进行培养。第一步骤可以持续至少2周或可以更长。第一步骤可以进行大于1、2、3、4、5、6、7、8、9或大于10个月。所述第二步骤可以持续8、9、10、 11、12、13、14、15、16天或更长。优选地，利用本文所限定的细胞外基质进行每个步骤。每种培养基中存在的每种化合物的优选浓度已在本文的说明书或实施例中进行了限定。在优选的实施方案中，如果胰腺的类器官用于再生医学，则可以从上皮细胞或从分离的胰腺组织块开始。在另一个优选的实施方案中，如果胰腺的类器官被用作药物开发体系，则可从腺瘤开始。因此，通过本发明方法获得的胰腺的类器官是本发明的另一方面。因此，另一方面， 本发明提供了本文所定义的第一、第二、第三、第四培养基。据我们了解，这是首次报道，在培养至少10个月后，获得有功能的并且活的胰腺的类器官(参见实验部分)。功能性优选的特征为胰岛素的分泌。由于获得的胰腺的类器官的最终的量与培养的持续时间相关，因此本领域技术人员应当理解，本发明是开创性的发明，并且有潜力为例如再生医学中带来新的希望。因此，在获得和/或培养胰腺的类器官的优选的方法中，在第一步骤中，在含EGF、 KGF或FGF和作为Wnt激动剂的R-spondin 1并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中，将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质接触培养，随后在第二步骤中，在含EGF和作为Wnt激动剂的R-spondin 1并补充了 B27、N2和 N-乙酰半胱氨酸的培养基中进行培养。在本发明的另一个优选的方法中，培养基包含作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子、作为Wnt激动剂的R-spondin 1和/或Wnt3a。该细胞培养基支持分离的小肠隐窝在包含作为细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。在本发明的另一个优选的方法中，培养基包含作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子、作为Wnt激动剂的R-spondin、作为Notch激动剂的 Jagged-DSL肽和I^ho激酶抑制剂Y-27632。该细胞培养基支持分离的单一上皮干细胞在包含作为细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。在本发明的另一个优选的方法中，培养基包含作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和/或80顺、作为Wnt激动剂的R-spondin 1和/或 Wnt3a，并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸中的至少一种。在该优选的方法中，Wnt-3a是优选的Wnt激动剂。该细胞培养基支持分离的结肠隐窝在包含作为细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。该培养基能促进培养至少2天内的细胞的存活和/或增殖和/或分化。一种优选的向结肠隐窝形成的分化标志物可以选自以下指示肠上皮细胞存在的碱性磷酸酶、指示杯状细胞存在的Muc2和指示内分泌细胞存在的Neurogenic 3或嗜铬粒蛋白。 可以利用RTPCR或免疫组化检测这些标志物中每一种的表达。能起到促进用于获得结肠隐窝的细胞的存活和/或增殖和/或分化功能的培养基能使得在培养至少2、3、4、5、6、7、8、9、 10天或更长的时间之后，可以检测出至少一种上述标志物。优选的培养基包含作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1 和/或Wnt-3a，并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸中的至少一种。该培养基被称为本发明的第五培养基，这代表本发明的另一方面。因此，在获得和/或培养结肠隐窝的优选的方法中，在上文所示的培养基中培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞，优选在第五培养基中进行培养。优选利用本文所限定的细胞外基质实施该方法。培养基中存在的每种化合物的优选浓度已在本文的说明书或实施例中进行了限定。因此，可通过本发明方法获得的结肠隐窝是本发明的另一方面。据我们了解，这是首次报道，在培养至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12个月后，获得有功能的并且活的结肠隐窝(参见实验部分)。功能性的特征优选为至少一种上文所示的标志物的存在。本发明是开创性的发明，并且有潜力为例如再生医学中带来新的希望。因此，在获得和/或培养结肠隐窝的优选的方法中，在含Noggin、EGF和作为Wnt 激动剂的R-spondin 1和/或Wnt_3并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中，将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质接触培养。在本发明的另一个优选的方法中，培养基含有作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子、作为Wnt激动剂的R-spondin 1、并补充了 Wnt-3a或 KGF,并且还含有B27、N2、N-乙酰半胱氨酸。将该培养基称为第六培养基，并因此代表本发明的另一方面。可以用TOF或FGFlO替代KGF。该培养基优选含有作为BMP抑制剂的 Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和FGFlOdtS Wnt激动剂的R-spondin 1 和Wnt-3a，并且还含有B27，N2，N-乙酰半胱氨酸。FGF10优选作为FGF，因为它给出的结果优于例如FGF7(图32)。该细胞培养基支持分离的胃组织块或胃的类器官在含有作为细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。该第六培养基是用于扩增胃组织块的培养基。扩增培养基是优选促进至少2天培养内的细胞的存活和/或增殖的培养基。另一种培养基，即第七培养基，被设计成能在至少 2天内促进、诱导细胞向胃的类器官或胃组织块的分化。该第七培养基与上述的第六培养基相同，除了 Wnt-3a的浓度低于第六培养基。与第六培养基中存在的Wnt-3a浓度相比，第六培养基中 Wnt-3a 的浓度降低至少 25%、50%、100%、200%、300%、400%、500%、600% 或更多。该第七培养基含有表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1与Wnt-3a、 Noggin和FGF10，并补充了 B27、N2、N-乙酰半胱氨酸和促胃液素。促胃液素的使用浓度优选为InM。所述第七培养基是分化培养基。分化培养基是优选在至少3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间培养内诱导或促进细胞发生特异性分化的培养基。对于胃的类器官或胃组织块，可以通过检测胃谱系相关的特异性标志物的存在来确定分化。胃谱系相关的标志物的实例包括MUC5AC(隐窝细胞标志物)、促胃液素和/或生长抑制素(两种都是内分泌细胞标志物)。优选利用RT-PCR和/或免疫组化或免疫荧光来检测至少一种所述标志物的存在。优选在分化条件中至少6天，更优选在至少10天之后可以检测至少一种这些标志物中的存在。当在所述培养基中培养至少6天之后，可以通过RT-PCR或免疫组化检测到至少一种上述标志物时，诸如第七培养基的分化培养基被认为是有功能的。优选在上述限定的第六培养基中的第一扩增步骤之后进行该分化步骤。因此，在获得和/或培养胃组织块的优选的方法中，在第一步骤中，在第六培养基中培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞，随后在第二步骤中，在第七培养基中进行培养。优选利用本文所限定的细胞外基质实施每一步骤。第一步骤可以持续至少3天并且可以持续更长的时间。第一步骤可以进行超过3、4、5、6、7、8、9或
12更多。第二步骤可以持续6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16天或更长时间。每种培养基中存在的每种化合物的优选浓度已在本文的说明书或实施例中进行了限定。因此，可通过本发明方法所获得的胃组织块是本发明的另一方面。因此，在获得和/或培养胃组织块的优选的方法中，在第一步骤中，在含有作为 BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和FGFlOdtS Wnt激动剂的 R-spondin 1和Wnt-3a，并且还含有B27、N2、N-乙酰半胱氨酸的培养基中，将上皮干细胞、 包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质接触培养，随后在第二步骤中，在含有表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1和Wnt_3a、Noggin和FGF10， 并补充了 B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中进行培养，其中第二步骤中的Wnt-3的浓度低于第一步骤中存在的Wnt-3a浓度。在本发明的另一个优选的方法中，培养基含有作为BMP抑制剂的Noggin和作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子。该细胞培养基支持分离的腺瘤组织块或分离的单一腺瘤细胞在含有作为细胞外基质的基质胶的三维培养物中进行培养。可以向培养基中新鲜加入诸如Wnt3a的配体。可选地，通过用表达所述配体的合适的表达构建体转染或感染细胞系使细胞系表达所述配体。培养所述细胞系，并在合适的时间间隔收集含有分泌配体的培养基。例如，当细胞达到汇合并停止生长时，细胞会产生 Wnt3a。将来自没有用所述表达构建体转染或感染的细胞的培养基用作对照。收集条件培养基并对其进行检测，例如在测定中检测受TCF反应元件控制的荧光素酶表达从而检测诸如 Wnt3a 的 Wnt 激动剂的存在(Korinek et al.，1997. Science 275:1784-1787)。当用于培养来再生组织时，将所述培养基稀释。如本领域技术人员所已知的，添加过量的配体有时与添加太少配体一样，对培养物都是有害的。因此，条件培养基的实际稀释度取决于测验中所测定的配体的量。本发明还提供了本发明的培养基在细胞外基质上培养上皮干细胞或包含这些干细胞的分离的类器官结构中的用途，其中所述干细胞优选不包含人胚胎干细胞。优选的是人成体干细胞。此外，从小肠、结肠和胃单分选的上皮干细胞也能在本发明的培养基中起始这些三维类器官。本发明还提供了本发明的培养基在培养包含干细胞的胰腺组织块中的用途，所述胰腺组织块形成包含胰岛样结构的胰腺的类器官。所述干细胞优选是胰腺、胃、肠或结肠上皮干细胞，其中最优选的干细胞是小肠干细胞。本发明的培养基允许长期培养条件的建立，在该条件下，单一隐窝经历多次隐窝分裂事件，而同时产生存在所有分化的细胞类型的绒毛样上皮结构。利用本发明的培养方法可允许至少7个月、至少8个月，至少9个月、至少10个月的培养期。培养的隐窝在培养之后，经历显著的形态改变。新鲜分离的隐窝的上部开口封闭， 并且该区域逐渐膨胀并充有凋亡细胞，很像凋亡细胞在绒毛顶部被剪断。发现隐窝区经历连续的出芽事件而产生其它隐窝，这是表明隐窝分裂的过程。隐窝样扩展物包含所有分化的上皮细胞类型，包括增殖性细胞、帕内特细胞、肠上皮细胞和杯状细胞。在任何阶段的类器官中均未鉴定出成肌纤维细胞或其它非上皮细胞。出芽隐窝结构的扩增产生类器官，所述类器官在衬有绒毛样上皮细胞并充有凋亡细胞体的中央腔周围含有> 40个隐窝样结构。隐窝-绒毛的类器官包含衬有绒毛样上皮的中央腔。该腔在连续的时间间隔是开放的，从而将内容物释放到培养基中。所述类器官可以传代并且可以保持培养至少6个月，而不会丧失重要的特性。传代优选涉及类器官的手动破碎。当培养单一上皮干细胞时，形成相似的隐窝-绒毛的类器官结构。大约1周后，形成了十分类似于利用完整的隐窝所获得的隐窝-绒毛的类器官结构的结构。这些类器官的组织学分析也表明保留了基本的隐窝-绒毛构造、存在所有分化的细胞类型和不存在非上皮成分。因此，一方面，本发明提供了隐窝-绒毛的类器官，包含衬有绒毛样上皮细胞的中央腔，所述绒毛样上皮细胞是通过在本发明的培养基中培养上皮干细胞或分离的隐窝而产生的。优选地，所述隐窝-绒毛的类器官是利用本发明的方法获得的。另一方面，本发明提供了按照本发明的方法培养胰腺组织块所产生或所获得的胰腺的类器官。在开始培养后7天，约20%的胰腺的类器官形成出芽结构。与仅非常缓慢生长的腺泡组织相反，胰管快速增殖。在胰腺的类器官传代之后，观察到分泌胰岛素的胰岛样结构，其类似于健康胰腺组织中存在的郎格罕氏胰岛。本发明还提供了包含中央腔的胃的类器官。优选地，所述胃的类器官是通过本发明的方法获得的。可以向培养基中添加其它生长因子，例如用来增强类器官中胰岛的存在或进一步支持诸如胃组织块的分离组织块的培养，所述其它生长因子包括环巴胺(Sonic-hedgehog 抑制剂；Tocris Bioscience)、激活素、GLP(胰高血糖素样肽)及其衍生物(ExendiM ； California Peptide Research)、促胃液素(Genscript)、Notch 激云力齐[J (Jagged 肽，Ana Spec)、烟酰胺和诸如Wnt-3a的Wnt激动剂。当以单细胞起始培养时，优选使用Wnt-3a。本发明还提供了隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官的集合体，每集合体包含多于10 个，优选多于20个、更优选多于40个类器官。隐窝-绒毛的类器官包围衬有绒毛样上皮的中央腔。该腔充有凋亡细胞体。隐窝-绒毛的类器官中的细胞是极化的，干细胞定居在结构的基部。隐窝样结构的顶部包含脱落进腔中的凋亡细胞。所述隐窝-绒毛的类器官集合体优选包含至少10%的活细胞、更优选至少20%的活细胞、更优选至少50%的活细胞、更优选至少60%的活细胞、更优选至少70%的活细胞、更优选至少80%的活细胞、更优选至少90%活细胞。可以在FACS中利用Hoechst染色或碘化丙啶染色评价细胞活力。另一方面，本发明提供了本发明的隐窝-绒毛的类器官、胃的类器官或胰腺的类器官在药物开发筛选、毒性测定或再生医学中的用途。为了高通量的目的，将所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官培养在多孔板中，例如，96孔板或384孔板。分子文库用来鉴定影响所述类器官的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如L0PAP ，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)、 合成化合物文库(例如LOP AC , Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可以使用诱导或抑制腺瘤细胞后代中一个或多个基因的表达的基因文库。这些基因文库包括cDNA文库、反义文库和siRNA或其它非编码RNA文库。优选将细胞暴露于多个浓度的检测试剂一段时间。在暴露时间结束时，评估培养物。术语“影响”用于包括细胞中的任何改变，包括但不限于，增殖降低或丧失、形态改变和细胞死亡。所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官还可以用来鉴定特异性地靶向于上皮癌细胞，但不靶向于所述隐窝-绒毛，胃或胰腺的类器官的药物。所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官还可以替代诸如Caco-2细胞的细胞系在可能的新药或现有的或新的食品补充剂的毒性测定中的用途。此外，所述隐窝-绒毛、胃或胰腺的类器官可以用于培养目前缺乏合适的组织培养物或动物模型的病原体，例如诺如病毒。包含隐窝-绒毛的类器官的培养物可用在再生医学中，例如用在肠上皮的放射后和/或手术后修复、诸如克罗恩病和溃疡性结肠炎的炎性肠病患者的肠上皮的修复、以及短肠综合征患者的肠上皮的修复。其它用途是小肠/结肠遗传病患者的肠上皮的修复。包含胰腺的类器官的培养物也可用在再生医学中，例如用作胰腺或部分胰腺切除后的植入物和用于治疗诸如I型糖尿病和II型糖尿病的糖尿病。在可选的实施方案中，可以使扩增的上皮干细胞成为相关的组织，例如，包括胰腺 β细胞在内的胰腺细胞和肝细胞。目前，从成体干细胞再生胰腺细胞或肝细胞是不可能的。 本发明的培养方法能实现分析使密切相关的上皮干细胞转分化为包括胰腺β细胞在内的胰腺细胞和肝细胞的因子。对于本领域技术人员显而易见的是，基因疗法也可以用在基于修复受损或患病的组织的方法中。例如，可以利用腺病毒或逆转录病毒基因递送媒介来将诸如DNA和/或RNA 的遗传信息递送至干细胞。本领域技术人员能替换或修复基因疗法中所靶向的特定基因。 例如，可以将正常基因插入基因组非特异的位置中，从而替换无功能的基因。在另一个实例中，可以通过同源重组用正常基因序列替换异常基因序列。可选地，选择性回复突变可以将基因恢复至正常功能。另一个实例是改变特定基因的调控(激活或关闭基因的程度)。优选地，通过基因疗法途径离体处理干细胞，随后将其转移至需要治疗的哺乳动物，优选人。另一方面，本发明提供了培养上皮腺瘤细胞的方法，包括提供细胞外基质、使上皮腺瘤细胞附于所述细胞外基质、在存在细胞培养基的条件下培养所述细胞，所述细胞培养基含有动物人类细胞的基础培养基，并且该基础培养基中添加有骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂和5-500ng/ml或至少5且不超过500ng/ml的、选自EGF、TGF_ α和KGF的有丝分裂生长因子。可以用FGF或FGFlO替代KGF。上皮结肠腺瘤细胞包含编码APC蛋白的基因中的改变，这导致由包含APC的蛋白复合体导致的细胞内联蛋白的低效降解。结肠腺瘤中常见的其它突变包括联蛋白或Axin2中的突变。总结果是增强的TCF/LEF信号转导，这是因为细胞核中β-联蛋白的量增加。发现不含Wnt激动剂的培养基足以使腺瘤细胞增殖。可以通过本领域内已知的方法从上皮腺瘤分离所述腺瘤细胞，包括使用诸如EDTA 的解离剂。可选地，可以利用Lgr5结合化合物从腺瘤分离单一 Lgr5-或Lgr_6-阳性的腺瘤细胞，随后利用磁珠或FACS分析。本发明还提供了在存在细胞培养基条件下培养的上皮腺瘤细胞的后代，所述细胞培养基包含动物或人类细胞的基础培养基，并且该基础培养基添加有骨形态发生蛋白 (BMP)抑制剂和5-500ng/ml或至少5且不超过500ng/ml的表皮生长因子(EGF)。培养的腺瘤细胞不能发育成诸如隐窝-绒毛样构造的极化的三维结构。相反，腺瘤细胞形成气球样结构，其中细胞随机朝向边缘或中央腔。没有分化成其它上皮细胞类型的迹象。该结果表明APC在隐窝-绒毛样构造的三维组建中的作用。此外，本发明提供了腺瘤细胞的后代在靶向药物开发筛选中的用途，用于鉴定与在相同培养基中进行培养的扩增的正常上皮细胞相比，特异性地影响腺瘤细胞的药物。为了高通量的目的，将腺瘤细胞的后代培养在多孔板中，例如，96孔板或384孔板。使用分子文库来鉴定影响所述后代的分子。优选的文库包括抗体片段文库、肽噬菌体展示文库、肽文库(例如LOPAP ，Sigma Aldrich)、脂质文库(BioMol)，合成化合物文库(例如L0PAC ， Sigma Aldrich)或天然化合物文库(Specs，TimTec)。此外，可以使用诱导或抑制腺瘤细胞后代中一个或多个基因的表达的基因文库。这些基因文库包括cDNA文库、反义文库和 siRNA或其它非编码RNA文库。随后或平行检测影响腺瘤细胞的化合物对扩增的正常上皮细胞的影响。术语“影响”用于包括细胞中的任何改变，包括但不限于，增殖降低或丧失、形态改变和细胞死亡。所述后代也可以用来鉴定与上皮腺瘤细胞相比(包括逆转的癌细胞)， 特异性地靶向于上皮癌细胞的药物。显而易见的是，所述后代也可以用在测定候选药物的体外代谢稳定性和代谢谱的
高通量方法中。此外，本发明提供了本发明的腺瘤细胞后代、胰腺的类器官、胃的类器官和隐窝-绒毛的类器官在毒性测定中的用途。所述后代和隐窝-绒毛的类器官易于培养，并且比诸如当前用在毒性测定中的 Caco-2(ATCCHTB-37)、I-407(ATCC CCL6)和 XBF(ATCC CRL 8808)的上皮细胞系更类似于原代上皮细胞。预计的是，利用原代腺瘤培养物或隐窝-绒毛的类器官获得的毒性结果更接近于患者中获得的结果。基于细胞的毒性测定用于确定器官特异性细胞毒性。在所述测定中检测的化合物包括癌症化学预防剂，环境化学品、食品补充剂和可能的有毒物。将细胞暴露于多个浓度的检测试剂中一段时间。在利用5天暴露时间和从最高可溶浓度的对数稀释的预实验中确定测定中检测试剂的浓度范围。在暴露时间结束时，评估培养物的生长抑制。分析数据以确定抑制终点50%时的浓度(TC50)。在本文件及其权利要求书中，动词“包括(to comprise)”及其变化词以非限制性的含义使用，表示包括该词后面的项，但是不排除未特定提到的项。此外，动词“由……组成
(to consist) ”可以用“基本由......组成(to consist essentially of)”替代，表示本文
所限定的产物可以含有特定指出的成分之外的其它成分，但所述其它成分不会改变本发明的特有性质。此外，本文所限定的方法可以包括特定指出的步骤之外的其它步骤，但所述其它步骤不会改变本发明的特有性质。此外，由不定冠词“a”或“an”修饰的元件不排除存在多于一个元件的可能性，除非文中明确指示有且只有一个元件。因此，不定冠词“a”或“an” 通常表示“至少一个”。单词“约(about)”或“约(approximately)”当与数值联合使用时 (约10)，优选表示该值可以为10或大于或小于该值的1%。通过引用将本说明书中所列举的所有专利和参考文献全部整体并入本文。仅以示例提供以下实施例，而非意图以任何方式限制本发明的范围。
图1.隐窝培养的生长因子需要a 用 EGF (E ；0_50ng/ml)和 R-spondin 1 (R :0_500ng/ml)接种 500 个隐窝，三个平行样品；接种后7天对隐窝的类器官进行计数。b 用EGF(50ng/ml)和R-spondin 1 (500ng/ ml)和指定量的Noggin培养500个隐窝/隐窝的类器官，随后进行3次传代。每次传代时对隐窝的类器官进行计数。实验重复三次，得到类似的结果。图2.肠隐窝培养体系的建立
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a 分离的单个隐窝长成类器官的时间过程。差分干涉相差图像显示隐窝基部的含颗粒的帕内特细胞(箭头)。b，c:单一分离的隐窝有效形成隐窝的类器官。通过重复的隐窝分裂，结构在第14天时产生多个章鱼样隐窝的类器官。d:培养3周之后，单个类器官的 3D重建共聚焦图像。Lgr5-GFP+干细胞(浅灰色)位于隐窝样结构的顶部。DNA的对比染色ToPro-3(深灰色)。e:隐窝的类器官的图示。类器官由衬有绒毛样上皮的中央腔和多个周围的隐窝样结构组成。位于隐窝结构顶部的深灰色细胞指示存在于每个隐窝结构中的 Lgr5+干细胞的位置。比例尺显示50 μ m。图3.基因表达谱的集群分析。利用新鲜分离的结肠和小肠隐窝以及小肠的类器官的表达水平的集群分析表明， 小肠的类器官和其来源的组织小肠隐窝之间具有高度的相似性。结肠隐窝集中在单独的分支上，表明该密切相关的组织的不同的基因表达模式。值得注意的是，所有表达的基因中只有1.2%显著富集在对应于小肠隐窝的类器官中，而反之有2%富集在小肠隐窝中。对这些差异性基因的hgenuity Pattway分析表明，新鲜分离的隐窝中特异性地存在淋巴细胞标志，而在类器官富集的少量基因中没有鉴定出明显的通路(未显示)。我们推断，后一组代表生物学噪音，而来源于污染的上皮内免疫细胞的淋巴细胞标志在培养时丢失。图4.隐窝的类器官保留基本的隐窝-绒毛特性。a-e:Wnt激活码保留在隐窝结构中。a 细胞核β-联蛋白(深灰色，箭头)仅见于隐窝结构中。图5中显示更高分辨率的图像。星号代表基质胶；Lu代表腔。b:CBC细胞和TA细胞梯度表达EphB2(浅灰色)。观察到用白箭头指示的Lgr5-GFP+干细胞。c 半胱天冬酶3+的凋亡细胞(深灰色，箭头)脱落进衬有肠上皮细胞的中央腔中。d:来自>3月的隐窝培养物的细胞涂片的40条染色体。e-g :Lgr5+干细胞的体外谱系追踪。e 用他莫西芬体外刺激来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^-lacZ报告基因小鼠的隐窝12小时，并培养指定的天数。LacZ染色(深灰色)表明，分散的单LacZ+细胞(第1天)在体外产生整个LacZ+隐窝(第2-14天)。插图显示更高放大倍数的着色隐窝的类器官。f 组织学分析显示整个LacZ+隐窝结构(深灰色/黑色)进入绒毛结构中。g 具有LacZ+细胞的隐窝的类器官的百分比随时间保持稳定，表明Lgr5+细胞具有长期干细胞活性。以三个平行样品接种500个隐窝，并对LacZ+隐窝的类器官进行计数。误差棒是三个平行样品的标准差。 实验重复3次，结果相似。图5.图4a、图Ilm和Ilp的更高分辨率的图像。图6.隐窝的类器官中没有存在上皮下成纤维细胞的证据。a 平滑肌肌动蛋白(SMA ；深灰色，用黑色箭头指示实例)的免疫染色表明上皮层下存在上皮下成纤维细胞。b:基质胶(星号)中不存在SMA+细胞表明培养体系中没有上皮下成纤维细胞。比例尺50μπι。图 7. a-c 用他莫西芬体外刺激来自 Lgr5-EGFP-ires_CreERT2/Rosa^-YFP 报告基因小鼠的隐窝12小时，并在指定的天数进行成像。Lgr5+细胞是浅灰色的且用白色箭头指示。d 用他莫西芬体外刺激来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^-YFP隐窝的7天长类器官12小时，培养指定的天数并成像。YFP荧光(浅灰色)显示分散的单YFP+细胞(第1 天)在随后的5天内在体外产生多个后代。绒毛结构在第1-1. 5天内快速生长，随后形成新的绒毛结构(白圈)。观察到YFP+细胞向绒毛结构迁移。
图8.单分选的Lgr5+干细胞产生整个隐窝-绒毛结构。a 将从Lgr5-EGFP-ires-CreERT2肠制备的Lgr5_GFP+细胞(底图)与野生型同窝细胞(Iittermate)进行比较(顶图)。将GFP+细胞分成两群:GFP髙和GFP低。b 对新鲜分离的隐窝的共聚焦显微镜分析显示GFPs存在于CBC细胞中(黑色箭头)，GFP 位于CBC 上(白色箭头)。c:所分选的GFPs细胞。d:培养14天后分选的1000个GFPs细胞(左) 和GFPte细胞(右)。e-f:分选后14天，单一 GFPs细胞形成隐窝的类器官，Lgr5-GFP+细胞 (浅灰色细胞)和帕内特细胞(白色箭头)位于隐窝底部。比例尺50 μ m。f 更高放大倍数的e中的隐窝基部。g 为了观察增殖的细胞，将类器官与胸苷类似物EdU(浅灰色，用白色箭头指示实例)一起培养1小时，培养之后将其固定。观察到只有隐窝结构并入了 EdU。 复染剂DAPI (深灰色)。图9. a 单个孔中分选的单细胞的集落形成效率。给出j个单独实验的平均值，其中每个实验中肉眼检查100个细胞，然后追踪生长。b 单个胞成功生长的实例。C 每个单个类器官的细胞数，给出的是5个生长的类器官的平均值。d:将来自单细胞来源的类器官的单细胞悬液进行再接种，并生长2周。二图10.单个孔中分选的单细胞的集落形成能力。单个胞成功生长的实例。 箭头指向作为标志的尘粒。比例尺50μπι.图11.来源于单个干细胞的类器官的组成。a-d为以下的三维重建共聚焦图像a 浅灰色的绒毛蛋白(衬于中央腔的肠上皮细胞的顶部)，b:用白色箭头指示Muc2染色(杯状细胞)，c 浅灰色的溶菌酶(帕内特细胞)，d 浅灰色的嗜铬粒蛋白A(肠内分泌细胞)。 用DAPI对细胞核进行复染。e_g 石蜡切片染色e 黑色的碱性磷酸酶(衬于中央腔的肠上皮细胞的顶部)，f 深灰色的PAS (杯状细胞)，g 深灰色的溶菌酶(帕内特细胞)，h 深灰色的突触素(肠内分泌细胞)。i_P:隐窝的类器官的电子显微镜切片表明存在肠上皮细胞 (i)、杯状细胞(j)、帕内特细胞(k)和肠内分泌细胞(1)。m/o 低倍镜隐窝图像表明不存在基质细胞。n-o 更高放大倍数的m。η 如微绒毛长度的差异所指示(黑色箭头)，朝向类器官的腔室的刷边缘的成熟。P:绒毛结构低倍镜图像。Lu 充有凋亡体并衬有极化的肠上皮细胞的隐窝的类器官的腔。G 杯状细胞；EC 肠内分泌细胞；P 帕内特细胞；星号基质胶。 比 列尺5 μ m(m, ρ) , 1 μ m(n, ο)。图12.体内隐窝和体外培养的隐窝之间的电子显微镜图像比较。a、b 正常肠隐窝基部底面具有结缔组织(箭头)。为了比较，类器官的c_g图像也在隐窝基部进行采集。d 顶膜的高放大倍数图像；两个相邻细胞的膜之间具有细胞间裂缝(箭头)。观察到桥粒(箭头头部)，然后是细胞间裂缝。e:基部的高放大倍数图，其中两个相邻细胞的膜之后可以为细胞间裂缝。这些图像与来自正常小鼠肠的a和b相似。这些细胞间裂缝可能是由乙醛固定过程中的渗透冲击引起的。f、g:组成类器官的所有细胞都处于健康的状态，并且没有大的空泡或其它胁迫迹象。可以观察到有丝分裂图(c)，在每个细胞中都有多个核孔(f，箭头)和完整的线粒体。可以看到ER和高尔基体(g)，并没有任何膨胀的迹象。没有核破裂、核溶解或核固缩迹象。因此，没有观察到细胞裂解或凋亡的迹象。类器官腔中的细胞显示预期的凋亡特征，因为可在正常小鼠的肠中观察到这个现象。f 显示肠内分泌细胞的另一个实例。Mi 有丝分裂的细胞，Lu 腔，EC:肠内分泌细胞，G 高尔基体。
图13.同样可以维持培养结肠来源的隐窝。利用与小肠隐窝相同的培养条件，来源于结肠的单一分离的隐窝有效地形成隐窝的类器官。通过重复的隐窝分裂，在第14天时，该结构产生了许多章鱼样隐窝的类器官。图14.添加BDNF提高培养效率。在存在EGF、Noggin、R-Spondin和BDNF的条件下培养单一分离的结肠隐窝。在起始培养后的第0、4和14天对结肠隐窝的类器官采集的图像。图15.添加Wnt3a进一步提高结肠隐窝的类器官的培养效率。在存在EGF、Noggin、 R-Spondin的条件下培养单一分离的结肠隐窝。与使用对照培养基(-Wnt3a)培养结肠的类器官相比，使用Wnt3a条件培养基(+Wnt3a)将培养效率提高高达30%。图16.从APC-/-小鼠分离的腺瘤可以在体外生长。将来自APC-/-小鼠的单个分离的腺瘤解离，并用以上所述的条件进行培养，除了在培养基中不含R-spondin。a 此处所示的4天时的腺瘤的类器官通常长成简单的包囊，其包含一个含有凋亡细胞的中央腔。b 更大放大倍数的一个腺瘤的类器官。c:用联蛋白(深灰色)和苏木精(腔中的浅灰色)对一个腺瘤的类器官进行染色。类器官的外层由具有细胞核联蛋白染色的上皮细胞组成。内腔含有死细胞，死细胞已经摄取苏木精并被染成深灰色。d:更大放大倍数的上皮细胞外层，其显示出清楚的细胞核联蛋白。二图17.添加提高了类器官形成的效率。a 分选出Lgr5_GFPS细胞，并在正常单一细胞培养条件下(EGF、noggin、R-spondin、Notch配体和Y-27632，如上文所述的单一细胞培养条件)并且在含有或不含Wnt3a(100ng/ml)的情况下进行培养。在存在和不存在Wnt3a条件下，培养类器官的皿的这些图像是有代表性的。b 以100个细胞/孔进行接种，类器官的数量是接种后14天时的数量。该图表示每皿的类器官数。图 18. R-spondinl 作用模型。当真正的Wnt配体与Frizzled结合并与LRP5/6受体相联时，启动Wnt/ β -联蛋白信号转导。在不存在R-spondin 1的条件下，Wnt信号转导受细胞表面上的LRP6的量所限， 由于DKKl/Kremenl介导的内化而使LRP6的量保持低水平。R-spondin 1通过拮抗DKKl/ Kremenl介导的LRP6更新而增强Wnt信号转导，导致细胞表面的LRP6水平提高。该图来自 PNAS 104 14700，2007。图19.在小肠中帕内特细胞与Lgr5+干细胞邻近。从Lgr5-EGFP-ires_CreERT2敲入小鼠的小肠分离隐窝。此处显示代表性隐窝的实例。GFP+细胞是Lgr5+(浅灰色，用黑色箭头指示)，并且其通常与帕内特细胞邻近(用*指示)。图20.在不存在活帕内特细胞的情况下，类器官形成效率降低。将分离的隐窝与ΙμΜ Newport Green-DCF (Molecular probe) 一起在 PBS+0. 1% Pluronic 127 (Sigma)中于室温孵育3分钟，随后用PBS洗涤。在这之后，将隐窝包埋入基质胶中，并用上文所述的标准条件进行培养。图21.胃的类器官培养的效率。(a)从Lgr5_GFP小鼠的胃幽门部分离的胃腺的GFP(箭头，指示GFP阳性细胞)和DIC图像。细胞核用DAPI染色。放大倍数63X; (b)用 EGF (E)、R-spondin 1 (R)、Noggin (N)、EGF+R-spondin 1 (ER)、EGF+Noggin (EN)、 EGF+R-spondin 1+Noggin (ERN) >EGF+R-spondin l+Noggin+ffnt3A (ERNW)或 EGF+R-spondin l+Noggin+ffnt3A+KGF (ERNWK)以100个胃腺/孔进行接种(两个平行样品)。在2、5和7天后对胃的类器官的数量进行计数。结果显示为2个独立实验的平均值士标准误。(b)用补充有a中所述的其它生长因子的Wnt3A重组蛋白(ENRWK)或Wnt3A条件培养基(ENRWCMK) 以100个胃腺/孔进行接种(两个平行样品)。在接种后第7天和第一次传代后的第2天对出芽的类器官的数量进行计数。图22.胃的类器官的体外形成。(a)分离的胃腺长成类器官。来自接种后第1、2、 5和7天的差分干涉相差图像。放大倍数10X(第1、2、5天)。第7天的放大倍数为4X， 插图为IOX。(b)每4-7天通过机械解离对培养物进行传代。培养物已生长至少1个月。 代表性的图像显示来自不同代的类器官的出芽结构。第1代(P1)、第2代(P2)和第4代 (P4)分别代表第8、11、20天。图23.胃腺的标志物(a)来自Lgrf-LacZ小鼠的胃培养物。接种后第5天，在胃出芽中检测到LacZ表达(参见箭头，指示LacZ阳性细胞(深灰色))，表明存在Lgr5阳性细胞。放大倍数为20X。(b)Ki67染色(黑色)显示位于腺样结构基部的阳性增殖细胞。 (c)存在于类器官的腔内的半胱天冬酶3 (深灰色)凋亡细胞(d)存在于胃的类器官中的胃粘蛋白5AC(深灰色)阳性细胞。Lu:类器官腔。放大倍数20X。图24.胰管可在体外形成胰腺样的类器官。在存在EGF、Noggin、R-spondin 1和 KGF的条件下培养新鲜分离的胰管。来自接种后第0、4和14天的差分干涉相差图像。图25.在体外培养约3周后形成胰岛样结构。来自接种后第21天的差分干涉相差图像。图26.用单独的介质(A)或R-Spondin(B)注射Axin-LacZ小鼠。2天后，分离胰腺，并通过X-gal染色检测LacZ表达的存在。B的中间的图显示更大放大倍数的导管，所述导管为LacZ阳性染色，表明Axin-LacZ沿胰管内衬表达。左图显示位于泡心细胞或闰管细胞中的小导管细胞表达AXin2-LaCZ(用黑色箭头指示实例)。在每幅图的角落显示放大倍数。在野生型小鼠中进行胰管结扎。在PDL后的不同时间，分离胰腺，并将获自PDL和非 PDL区域的组织切片进行H&E染色。显示每个时间点的放大倍数(C)。在wt和AXin2-LaCZ 小鼠中进行胰管结扎。PDL后7天，分离胰腺，并通过对固定的组织切片(D)或整体固定的器官组织块(E)进行X-gal染色来测定AXin2-LaCZ表达。白色圆圈指示胰腺的结扎部位。PDL后5天，胰腺组织切片中Ki67的表达(用箭头指示实例)。显示放大倍数。(F)用 R-spondin体内处理2天之后，胰腺组织中BrdU的并入(用箭头指示实例)。显示放大倍数。(G)在从经历PDL或对照手术的小鼠获得的胰腺组织中，利用Q-PCR测定Lgr5mRNA表达。在PDL胰腺中，对PDL区域和非PDL区域进行Q-PCR。(H)显示了与TATA盒结合蛋白 (tbp)相比的Lgr5表达的倍数提高，TATA盒结合蛋白是一种管家基因。PDL后13天，分离胰腺，并用对固定的组织切片进行X-gal染色来测定Lgrf-LacZ表达。用黑色箭头指示着色细胞的实例⑴。图27.从野生型小鼠分离胰管组织块之后，在不同时间点所采集的体外生长在EM 中的胰管组织块的图像(A，顶图)。泡心细胞未生长超过7天，7天后泡心细胞破裂(A，底图)。胰腺组织块在存在或不存在 EGF (50ng/ml)、R-spondin (1 μ g/ml)、FGFlO (lOOng/ml) 或Noggin (lOOng/ml)的条件下生长。在用新鲜分离的胰腺组织块起始培养后7和14天， 采集培养物图像。无EGF的培养物不能存活超过10天(B)。从Axin2-LacZ小鼠分离的胰腺组织块在不存在或存在R-spondin (1 μ g/ml)的条件下培养3天。X_gal染色显示，仅在存在R-spondin的条件下，3和14天之后的导管细胞中表达Wnt响应性Axin-LacZ (用白色箭头指示实例)。在腺泡或小岛细胞中没有检测到X-gal染色(C)。从Lgrf-LacZ小鼠分离导管组织块，并在不存在或存在R-spondin的条件下培养3天。如X-gal染色所示， Lgr5-LacZ的表达显示芽的顶部上的Lgr5+细胞，这与其在PDL后的表达相似(D)。对获自胰腺组织块并在存在Wnt激动剂R-spondin的条件下进行培养的细胞进行FACS染色。对细胞进行EpCAM(广谱上皮细胞标志物)和LacZ染色(荧光素二吡喃半乳糖苷，FDG)。当在存在Wnt信号的条件下培养胰腺组织块时，Lgr5+细胞的百分比显著增加(E)。图28.从PDL处理后7天的小鼠分离胰腺，并用EpCAM_APC和LacZ的荧光底物 (FluoroReporter试剂盒)对胰腺细胞进行染色，分选，并在含有50% Wnt3A条件培养基和 IOmM Y-27632的EM中培养4天。4天之后，将培养基换成无Wnt和Y-27632的EM培养基。 在指定的天数采集图像，并显示为40X的放大倍数。图29.将胰腺的类器官从EM转移至DM。从扩增培养基去除FGFlO (即得到DM)的效应诱导分化成为小岛。在DM中培养胰腺的类器官10天，之后可在体外检测到小岛样结构。显示存在和不存在FGFlO的条件下的培养物的图像(A)，并且通过PCR检测，显示某些分化标志物(Ngn3和生长抑制素)的表达提高。Hprt是管家基因(B)。在转移至DM之后的几个时间点，利用PCR评估多个标志物的表达(C)。从胰腺包囊至β细胞样结构(D)的形态改变伴随某些β细胞标志物的出现，例如通过免疫荧光所检测的胰岛素和C-肽(E)。 正如Ngn3的阳性免疫荧光染色所示，DM中存在R-spondin是β细胞祖细胞再生所必需的 (白色箭头指示实例)(F)。图30.人胰腺组织块是新鲜分离的，并培养在EM中。在起始培养之后指定的时间点采集培养物的图像。图31.体外隐窝培养物产生Wnt配体(A) Wnt通路的图示。当Wnt配体被分泌时，其可以自分泌或旁分泌激活Wnt信号通路。Porcupine对于适当的Wnt配体分泌至关重要。IWP抑制剂抑制Wnt配体分泌。(B)在如实施例1中所示的正常条件下培养的小鼠的类器官。(C)小鼠的类器官培养物与1 μ M IWP —起孵育导致类器官培养物的细胞死亡。(D)添加Wnt3a条件培养基增强小鼠的类器官培养物。(E)通过添加Wnt3a条件培养基挽救IWP诱导的类器官死亡。(B-E)所示的放大倍数为IOX。图32.人肠隐窝培养的建立在补充有EGF、Noggin和Rspondin并且含有Wnt3a条件培养基(A，B, E，F)和不含Wnt3a条件培养基(C，D，G，H)的培养基中3天(A、C、E、G)和5天(B、D、F、H)之后，从小肠(A-D)和结肠(E-H)培养出的人的类器官。图33.胃的类器官培养的建立(A)用 EGF (E) 、 R-spondin 1 (R) 、No g g i η (N) 、EGF + R-s ρ ο η d i η 1 (ER)、EGF+Noggin(ΕΝ)、EGF + R-spondin 1+Noggin(ERN)、EGF + R-spondin l+Noggin+ffnt3A (ERNW)、EGF+R-spondin l+Noggin+ffnt3A+FGF10 (ERNWF)、EGF+R-spondin 1+Noggin+对照条件培养基+FGFlO (ERNCCMF)或 EGF+R-spondin l+Noggin+Wnt3A 条件培养基+FGFlO (ERNWCMF)以总共100个胃腺/孔进行接种(两个平行样品)。在2、5和7天之后，对胃的类器官的数量进行计数。将结果显示为2次独立实验的平均值士标准误。(B)用Wnt3A条件培养基(ENRWCM)或补充有FGFlO的Wnt3A条件培养基 (ENRffCMF)以总共100个胃腺/孔进行接种(两个平行样品)。培养7、15 (第2代)和60 天(第10代)之后，对出芽的类器官的数量进行计数。(C)在补充有 FGF7/KGF(K)或 FGFlO(F)的 Wnt3A 条件培养基(WCM) +EGF+Noggin 和R-spondin中以总共100个胃腺/孔进行接种，使用的FGF7/KGF (K)或FGFlO (F)的浓度为100和lOOOng/ml。培养4天(第7代)之后，对出芽的类器官的数量进行计数。显示了代表性的实验。(D)分离的胃腺发育成为类器官。接种后1、2、3、4、7天的差分干涉相差图像。1 周后，培养物需要以1 5或1 6进行传代。按补充材料和方法部分所描述进行传代培养和维持。培养15天、3个月、4. 5个月和6个月之后的培养物的代表性图像(放大倍数为 10X)。(E)在对照条件培养基中生长5天的培养物的实例。观察到该培养物没有生长，并且未能形成腺体结构。在这些条件下，所述培养物存活不超过7天。(F)在培养3个月的胃的类器官的全标本包埋E-钙粘附蛋白染色。图34.单个Lgr5ratt细胞在体外成为长期存活的胃的类器官。(A)从Lgr5-EGFP-ireS-CreERT2小鼠的胃中新鲜分离的幽门胃单元的共聚焦分析。箭头指示GFPs (灰色)、GFP (黑色)和GFp_re(白色)的不同群。(B)根据GFP表达水平，Lgr5-EGFP ,^细胞可与GFPte和GFP_ve群相区分。FSC 前向散射。(C)从单个!^!^,^细胞长成类器官的代表实例。箭头指示第7天时腺样结构的芽的形成。初始放大倍数第1-4天为40X放大倍数，第5-6天为20X放大倍数，第7_8天为10X放大倍数和第9天为5X放大倍数。(D)将来源于单一 Lgr5ratt细胞的类器官解离，并每5-7天进行传代。3个月的培养物的代表图像。初始放二大倍数左图为4X放大倍数，右图为10X放大倍数。(E)从单个GFPs细胞长出的14天的胃培养物中的表达Lgr5 EGFP的细胞的共聚焦分析。观察到Lgr5-GFPratt细胞位于腺体结构的基部(白色箭头；10X放大倍数)。(F)用胸苷类似物EdU(红色)培养类器官1. 5小时。只有腺结构能并入EdU(白色箭头；20 X放大倍数)。复染剂4，6_ 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI ；细胞核)。(G)用他莫西芬体外刺激来自Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^_YFP报告基因小鼠的单细胞培养物的2周长的培养物20小时，并在指定天数进行成像。YFP荧光(黄色) 显示分散的单个黄色细胞(第1.5天)在体外产生多个后代。观察到YFPratt细胞向中央腔迁移(白色虚线的圆)。(H)来自！^沖&^单细胞的2月长的培养物的胃特异性基因的表达分析。培养物保持在高Wnt3A培养基中(左图)或低Wnt3A培养基中(中图)。观察到胃来源的培养物对肠特异性基因是阴性的(右图)。(I)培养物在低Wnt3A培养基中保持至少10天。上图ECad染色的共聚焦图像 (红色，上皮来源的类器官)。复染剂=Hoescht 33345(蓝色)。下图用Tff2 (褐色，颈粘液细胞)、高碘酸-雪夫(红色，小凹细胞)、MUC5AC(褐色，小凹细胞)和嗜铬粒蛋白A (褐色，肠内分泌细胞)进行染色的石蜡切片。 实施例实施例1 小肠隐窝和绒毛的体外培养材料和方法小鼠使用6-12周龄的远交系小鼠。之前描述了 Lgr5-EGFP-Ires-CreERT2等位基因1的产生和基因型分型^ Rosa^-IacZ或YFP Cre报告基因小鼠获自Jackson Labs。隐窝分离、细胞解离和培养通过在4°C下在2mM EDTA/PBS中孵育30分钟使隐窝从鼠小肠释放。对分离的隐窝进行计数并离心。将500个隐窝与50μ1基质胶 (BD Bioscience)混合，并接种于M孔板中。基质胶聚合之后，添加500 μ 1隐窝培养基(具有生长因子(10-50ng/ml EGF(Peprotech) ,500ng/ml R-spondin I11 和 100ng/ml Noggin(Peprotech)的改进DMEM/F12)。对于分选实验，将分离的隐窝于37°C在培养基中孵育45分钟，随后用玻璃移液管重悬。使解离的细胞通过20-μ m的细胞过滤器。通过流式细胞仪(MoFlo，Dako)分选GFPS、GFPte或GFP细胞。通过前向散射、侧向散射和脉冲宽度参数以及碘化丙啶的负染来为单一活上皮细胞画门。将分选的细胞收集在隐窝培养基中， 并以1细胞/孔埋入含有Jagged-I肽(Ana Spec, 1 μ Μ)的基质胶(96孔板，5 μ 1基质胶) 中。用含有Υ_27632(10μΜ)的隐窝培养基(48孔板为250 μ 1，96孔板为100 μ 1)覆盖。每隔一天添加生长因子，并且每4天更换全部培养基。为了传代，将类器官从基质胶移出，机械解离成单隐窝结构，并转移至新的基质胶中。每1-2周以1 5的比例进行传代。试剂鼠重组EGF 和 Noggin 购自 P印rotech。人重组 R-spondin I11、 Y-27632 (Sigma)、4_羟基他莫西芬(Sigma)和Edu (Invitrogen)用于培养实验。以下抗体用于免疫染色抗溶菌酶(Dako)、抗突触素(Dako)、抗BrdU(Roche)、抗β-联蛋白(BD Bioscience)、抗E-钙粘附蛋白(BD Bioscience)、抗平滑肌肌动蛋白(Sigma)、抗EphB2 和B3 (R&D)、抗绒毛蛋白、抗Muc2、抗嗜铬粒蛋白A (Santa Cruz)、抗半胱天冬酶-3 (Ce 11 Signaling)。隐窝分离将分离的小肠纵向剖开，用冷PBS洗涤。将组织切成约5mm的小块， 再用冷PBS洗涤。将组织块在含2mM EDTA的PBS中冰上孵育30分钟。去除EDTA介质之后，用冷PBS和IOml移液管用力悬浮组织块。上清是绒毛部分，将其弃去；用PBS重悬沉淀。再一次用力悬浮和离心之后，上清富集了隐窝。将该部分通过70 μ m的细胞过滤器(BD bioscience)，以去除残留的绒毛。将分离的隐窝于300rpm离心3分钟，以使隐窝与单细胞分离。最终的部分由基本上纯的隐窝组成，并用于培养或单细胞解离。他莫西芬诱导和X-gal染色为了活化CreERT2，将隐窝与低剂量的4_羟基他莫西芬(IOOnM) —起孵育12小时，并在隐窝培养基中培养。按之前的描述1进行X-gal染色。 在未经4-羟基他莫西芬处理时未观察到染色。电子显微镜分析按之前的描述S将包含隐窝的类器官的基质胶于室温在 Karnovsky' s固定剂O %多聚甲醛、2. 5 %戊二醛、0. IM 二甲砷酸钠、2. 5mM CaCl2和5mM MgCl2, pH 7.4)中固定5小时。将样品包埋入Epon树脂中，用Phillips CMlO显微镜 (Eindhoven, The Netherlands)进行检查。微阵列分析结肠隐窝、小肠隐窝和类器官的基因表达分析。将从两只小鼠新鲜分离的小肠隐窝分成两部分。从一部分直接分离RNA(RNeasy微型试剂盒，Qiagen)，将另一部分培养一周，之后进行RNA分离。我们按照生产商的说明书制备了标记的cRNA(Agilent Technologies)。在两染料互换实验中，将来自两只小鼠的小肠隐窝和类器官的差异标记的 cRNA分别与4X44k Agilent全小鼠基因组双色微阵列(G4122F)杂交，得到四个分别的阵列。此外，在两染料互换实验中，将分离的结肠隐窝与差异标记的小肠隐窝杂交，得到四个分别的阵列。用 Feature Extraction(V. 9. 5. 3，Agilent Technologies)检测微阵列信号禾口本底信息。用 ArrayAssist (5. 5. 1, Stratagene Inc.)禾口 Microsoft Excel (Microsoft Corporation)对所有的数据进行分析。通过扣除局部本底校正原始信号强度。为了允许计算仅存在于一个通道(小肠隐窝或类器官)或(小肠隐窝或结肠隐窝)中的特征强度之间的比值，将负值转变为接近0的正值(局部本底的标准差)。通过应用Lowess算法进行标准化，并且如果两种(小肠隐窝或类器官)或(小肠隐窝或结肠隐窝)强度均改变或如果两种强度均小于本底信号的2倍，则滤掉个体特征。此外，滤掉不一致的特征。数据可在 GEO (Gene Expression Omnibus (基因表达汇编)，号码 GSE14594)公布时获得。用 Cluster 3(距离城市街，相关性平均连锁)对小肠/结肠隐窝和类器官的标准化的强度(Feature Extraction中处理过的信号)进行无监督分级集群，并用TreeView可视化。如果基因在所有阵列中都一致地表现出在类器官或隐窝中提高大于3倍，则认为所述基因显著改变。成像分析用共聚焦显微镜(Leica，SP5)、倒置显微镜(Nikon DM-IL)或立体显微镜(Leica，MZ16-FA)采集隐窝的类器官的图像。对于免疫组化，用4%多聚甲醛(PFA)于室温将样品固定1小时，并用标准技术1加工石蜡切片。按之前的描述1进行免疫组化。对于全包埋免疫染色，用分散酶(Irwitrogen)从基质胶分离隐窝的类器官，并用4% PFA固定， 随后用0. Triton-X进行透化。按生产商的方案进行EdU染色(Click-IT，Invitrogen)。 利用DAPI或ToftO-3 (Molecular Probe)对DNA进行染色。用共聚焦显微镜(Leica，SP5) 获取3D图像，并用Volocity软件(Improvision)重建。结果在成年哺乳动物中，肠上皮是自我更新最快的组织。我们最近证实，在小肠隐窝基部存在大约6循环Lgr5+干细胞^我们目前已经建立了长期培养条件，在该条件下单个隐窝经历多次隐窝分裂事件，并同时产生绒毛样上皮结构，在所述绒毛样上皮结构中存在所有分化的细胞类型。单分选的Lgr5+干细胞也能起始这些隐窝-绒毛的类器官。追踪实验表明，Lgr5+干细胞的分级保持在类器官中。我们推断，肠隐窝-绒毛单元是自组织结构，其可以在不存在非上皮细胞龛的条件下从单个干细胞进行组建。自我更新的小肠上皮排列成隐窝和绒毛2。细胞在隐窝中新生成，并在绒毛顶部通过凋亡而丧失，导致小鼠中的更新时间为5天。一直以来都认为自我更新的干细胞定居在隐窝底部附近，并且产生快速增殖的过渡放大(TA)细胞。估计每个隐窝的干细胞数量为 4-6个。肠上皮细胞、杯状细胞和肠内分泌细胞由TA细胞发育而来，并且这些细胞继续沿着隐窝-绒毛轴在结合带中迁移。第四种主要的分化细胞类型是帕内特细胞，其定居在隐窝底部。我们最近鉴定出了基因Lgr5，其在散布于帕内特细胞之间的循环隐窝基部柱状细胞中特异性地表达\利用将GFP/他莫西芬诱导型Cre重组酶盒整合入Lgr5基因座中的小鼠，我们通过谱系追踪显示，Lgr5+细胞构成产生所有上皮细胞类型的多能干细胞S甚至在 Cre诱导14个月后评估时也是如此3。
尽管已经描述了多种培养体系4_7，但是还没有建立能维持基本隐窝-绒毛生理机能的长期培养体系2。将小鼠隐窝制备物悬浮于基质胶中。隐窝生长需要EGF和R-spondin 1 (图la)。 传代需要Noggin (图lb)。培养的隐窝表现出定式(图加)。上面的开口迅速闭合，腔充有凋亡细胞。隐窝区经历连续的出芽事件，暗示隐窝分裂17。帕内特细胞总是存在于出芽位点。大部分的隐窝是可以培养的(图2b)。进一步的扩增产生了包含>40个隐窝结构的类器官，所述隐窝结构位于衬有绒毛样上皮(“绒毛结构”)的中央腔的周围(图2c-e)。E-钙粘附蛋白染色显示出单细胞层(数据未显示)。每周将类器官机械解离，并以1/5的预接种密度进行重新接种。培养>6个月的类器官没有丧失以下描述的特征。利用微阵列的表达分析表明，例如当与新的结肠隐窝比较时，类器官与新鲜分离的小肠隐窝高度相似(图3)。Lgr5-EGFP-ires-CreERT2隐窝的培养表明，Lgr5_GFP+干细胞与帕内特细胞在隐窝基部混杂在一起。通过细胞核β -联蛋白(图如，图5)和Wnt靶基因Lgr5(图2d)和 EphB218(图4b)的表达所证实的Wnt激活限于隐窝。凋亡的细胞脱落进中央腔，这是表明体内凋亡的细胞在绒毛顶部脱落的过程(图4c)。培养超过3个月的类器官的中期染色体涂片(Metaphase spread) 一致地显示40个染色体/细胞(n = 20)(图4d)。意外地，我们没有发现存在成肌纤维细胞或其它非上皮细胞的证据(图6)。我们将来自与Cre-可激活的R0Sd6-LaCZ报告基因小鼠杂交的 Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠的隐窝进行培养，以允许谱系追踪。用低剂量的他莫西芬诱导之后，我们立即观察到单一标记的细胞(图4e，g)。这些细胞中大于90%产生了完全蓝色的隐窝(图4e-g)，这表明Lgr5-GFP+细胞确实保留了干细胞特性。来自Cre-可激活的 Rosde-YFP报告基因19小鼠的隐窝允许通过共聚焦分析进行谱系追踪。他莫西芬处理之后，我们立即观察到单一标记的细胞，这些细胞在随着接下来数天内诱导谱系追踪，在新鲜分离的隐窝(图7a-c)和建立的类器官(图7d)中都观察到该现象。二最近，在体外从单一干细胞建立了乳腺上皮结构21。当分选单一 Lgr5_GFPS细胞时，这些细胞立即死亡。Mio激酶抑制剂Y-27632显著降低了这种细胞死亡。发现Notch激动肽u能支持增殖性隐窝η。在这些条件下，大量的Lgr5-GFPS细胞存活并且形成大的隐窝的类器官。当接种GFPte后代细胞时，很少形成类器官(图8d)。多个Lgr5-GFPS细胞与帕内特细胞在隐窝基部混杂在一起(图8e-f)。EdU(胸苷类似物)的并入表明隐窝中存在 S期细胞(图8g)。我们以1个细胞/孔分选细胞，肉眼检查单细胞的存在，并追踪随后的生长。在4 个单独实验的每一个中，我们鉴定出并追踪到100个单细胞。平均大约6%的
胞长成类器官，而其余的细胞通常在最初的12个小时内死亡，据推测是由分离程序所固有的物理和/或生物胁迫所致。GFPte细胞几乎不能长成类器官(图9a)。图9b和图10显示从单个Lgr5-GFPS细胞长成的类器官。在培养4天时，结构由大约100个细胞组成，这符合增殖性隐窝细胞的12小时的细胞周期^(图9c)。2周后，将类器官解离成单细胞，并进行再接种来形成新的类器官(图9d)。按照每两周一次，该程序可重复至少四次，而不会明显丢失再接种效率。似乎难以将单一干细胞来源的类器官与来自整个隐窝的类器官区分开来。帕内特细胞和干细胞位于隐窝底部(图8e、f、图11c，g)。通过绒毛蛋白+成熟的刷边缘和顶部碱性磷酸酶所证实的完全极化的肠上皮细胞衬于中央腔(图11a、e、i)。杯状细胞(Muc2+，图 lib ；PAS+,图Ilf)和肠内分泌细胞(嗜铬粒蛋白A+，图Ild ；突触素+，图Ilh)分散于类器官结构中。利用电子显微镜识别出4种成熟细胞(图lli-Ι)。不存在非上皮(基质/间充质)细胞，通过EM成像进行证实(图lli-p，图12c-g)。隐窝(图llm，o)和中央腔上皮 (图lip)两者均由单层极化上皮细胞组成，所述细胞直接位于在基质胶载体上。这些EM图片的高分辨率图像呈现在图5中。具有红色E-钙粘附蛋白染色和蓝色细胞核复染的类器官表明类器官上皮的单层性质(数据未显示)。公知的是，上皮隐窝与上皮下的成肌纤维细胞密切接触％_28，并且通常认为后一种细胞在隐窝基部产生了特化的细胞龛27~29~3°。这种龛会产生特有的环境来锚定和支持肠干细胞。目前，我们证实，利用限定组的一致存在的生长信号可以建立自我更新的上皮。尽管如此，分离的干细胞会以高度定式自发产生不对称性。这迅速导致隐窝样结构的形成，重新产生的干细胞和帕内特细胞位于其基部，并充有TA细胞。这些隐窝样结构进入由有丝分裂后的肠上皮细胞组成的绒毛样腔结构中，其中凋亡细胞被夹断入腔中，这表明细胞在绒毛顶部丢失。意外观察到暴露于均勻促生长环境中的单细胞能产生不对称的结构，这在Wnt 通路的研究上是非常明显的。尽管所有的细胞均暴露于R-spondin 1，但是只有隐窝中的细胞表现出激活的Wnt信号转导的特征，即细胞核联蛋白和Wnt靶基因的表达。显然， 对Wnt信号转导的差异性响应才是隐窝绒毛轴形成的核心，而不是对细胞外Wnt信号的差异性暴露。总之，我们推断，单个!^沖&^肠干细胞能独立于来自其环境的位置信号而运作， 并且其可以产生连续扩增的，自组织的、类似正常的肠道的上皮结构。所述的培养体系会简化干细胞驱动的隐窝-绒毛生物学研究。此外，它会为再生医学和基因疗法开辟新的途经。实施例2结肠隐窝和绒毛的体外培养材料和方法Wnt3a条件培养基将表达Wnt3a配体的细胞系和无Wnt3a配体的相同细胞系(对照培养基)培养 3-4周的时间。一旦细胞达到汇合停止生长时，它们就会产生Wnt3a。收获培养基，并在 TOPflash测定中进行检测、TOPflash测定是利用TCF反应元件-Iuc构建体(TOP)和在TCF 反应元件中具有突变的相同构建体(FOP)的荧光素酶测定。对于用于培养的培养基，TOP/ FOP的比应该大于20。当用于培养来再生组织时，将所述培养基稀释成25-50%。剖开新鲜分离的结肠，用PBS或DMEM洗涤，并将其切成小块。将组织块与2mM EDTA/PBS—起在4°C下轻轻摇动孵育1小时。去除EDTA溶液之后，用IOml移液管用力将组织块悬浮于IOml冷PBS中。弃去含有残渣的第一上清液，并用10-15ml PBS悬浮沉淀物。再一次用力悬浮组织块之后，上清液富集结肠隐窝。将组织块离心沉淀，与基质胶混合，并按小肠的类器官培养体系进行培养。将基质胶于37°C孵育5-10分钟。基质胶聚合之后，添加500 μ 1组织培养基(50%改进DMEM/F12/50% Wnt-3a条件培养基，补充了 200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondinl、100ng/ml Noggin、IOOng/ ml BDNF(P^rotech))。每2-3天更新全部培养基。对于传代，用1000 μ 1移液管从基质胶取出类器官，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶。至少每两周一次以1 4的分种率(split ratio)进行传代。在这些条件下，使培养物维持至少3个月。
结果与小肠的类器官相比，结肠的类器官生长较慢且效率较低。在与小肠相同的生长因子条件下，从远端结肠分离的结肠隐窝中小于5%生长并形成类器官结构(图13K从结肠的近端部分长出结肠隐窝是困难的。由于我们在微阵列分析(结肠Lgr5-GFPS细胞与结肠Lgr5-GFP 细胞相比)中发现BDNF(脑源性神经营养因子)的受体trkB的上调， 我们确定了 BDNF对结肠的类器官的作用。我们一直能观察到，BDNF+培养中的培养效率高于BDNF-培养大约2倍。通常，一个结肠的类器官含有大约10个隐窝结构(图14)。没有检测到帕内特细胞，这符合它们的来源。与小肠的类器官相比，结肠隐窝在隐窝基部没有产 Wnt-3a的帕内特细胞，因此补充Wnt-3能提高结肠隐窝的培养效率，但是对小肠隐窝没有作用。通常，当添加Wnt-3a条件培养基时，我们获得了高达30%的培养效率(图15)。总之，利用上述条件，可以在体外保持和增殖来源于小肠和结肠的隐窝，使得该所述的第一培养方法能在人工体系中产生肠上皮。实施例3腺瘤的体外培养材料和方法(参见实施例1)结果一直以来都难以在体外培养腺瘤。由于上述条件从小肠和结肠成功地培养出健康的隐窝，因此意图确定相似的条件是否能在体外维持腺瘤。使用2.5mM EDTA从APC-/-小鼠分离出腺瘤之后，在与上述相似的条件下培养单个腺瘤。重要的是，这些条件足以维持腺瘤的体外生长，而R-spondin已变得多余。通过以下事实可以容易解释这点不再需要诱导 Wnt信号通路，因为这些细胞中不存在APC，所以它们会自动产生细胞核β-联蛋白。这使得Wnt激动剂R-spondin在腺瘤的体外培养中是多余的。图16a和更大放大倍数的图16b 显示，在正常的隐窝的类器官中可以看到隐窝发芽带有中央腔，但与此相反，腺瘤的类器官只生长为包囊。死细胞脱落进腔中，这可以从腔中存在的大量的死细胞推断出。在正常的隐窝的类器官中，细胞核β-联蛋白仅见于隐窝-结构的基部(参见图如)。在腺瘤的类器官(图16c和更大放大倍数的图16d)中，细胞核β-联蛋白可见于每个上皮细胞中，这符合APC基因突变。这些类器官可以无期传代。还检测了利用前述的培养条件(无R-spondin)来源于Lgr5-EGFP-Ires_CreERT2/ APCflox/flox小鼠中的腺瘤的单一 Lgr5+分选细胞是否能在体外形成相似的腺瘤的类器官。事实上，情况正是如此，所获得的类器官与利用完整腺瘤作为体外培养起始材料所获得的类器官在结构上高度相似(数据未显示)。实施例4检测其它Wnt激动剂的效果为了确定其它Wnt激动剂是否与R-spondin具有相同的效果，即促进隐窝_绒毛的类器官的体外形成，将可溶性Wnt3a添加到Lgr5+分选的单细胞中，并评价其对体外隐窝-绒毛形成的效果。材料和方法分选出Lgr5_GFPS细胞，并在正常单细胞培养条件(如上文所述的用于单细胞的 EGF、noggin、R-spondin、Notch 配体和 Y-27632)之外，添加或不添加 Wnt3a (100ng/ml)进行培养。我们接种100个细胞/孔，并在接种后14天，对类器官的数量进行计数。
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分离的隐窝与ΙμΜ Newport Green-DCF(MolecularProbes) —起在 PBS+0. 1 % Pluronic 127 (Sigma)中于室温下孵育3分钟，随后用PBS洗涤。洗涤之后，将隐窝包埋入基质胶中，并使用上文所述的标准条件进行培养。结果在不存在R-spondin的条件下添加对集落形成没有任何效果在不存在 R-spondin的条件下形成很少集落，甚至没有形成集落。然而，在存在R-spondin的条件下， 仅在存在Wnt3a时观察到类器官形成的效率提高(图17)。这表明，两种因子彼此支持它们的能力，从而刺激并支持干细胞分化为完整的上皮细胞层形成所必需的所有细胞。目前的假说是在信号转导通过Frizzled之前，R-spondin负责抑制Frizzled的共受体LRP6的内化。一旦Wnt因子与Frizzled和共受体LRP6结合，Wnt信号通路被激活31。当细胞表面存在LRP6时，将发生Wnt激活(图18)。因此，如果培养基中不存在R-spondin，Wnt3a将不能激活Wnt通路，因为LRP6被内化，并且不能与Wnt因子联合用于信号转导，从而阻止了 Wnt通路的激活。Wnt3a是一种可溶性因子，在生理条件下，其由帕内特细胞产生。这些细胞通常邻近于干细胞(图19)，假设的是这些细胞支持肠上皮细胞层的不断分化。同样由帕内特细胞分泌的其它Wnt因子是Wnt6、9b和11。据推测，Wnt6与Wnt3a对干细胞分化具有相同的效应。这些发现支持这样的看法，帕内特细胞对干细胞龛的形成至关重要。这些数据是出人意料的，因为对于干细胞龛已有很多推测，但是目前还没有实验数据支持存在这样的龛。对存在干细胞龛的其它支持来自帕内特细胞被选择性杀死的实验。从小鼠小肠分离隐窝，并在存在特异性地去除帕内特细胞的锌螯合剂32的条件下进行体外培养。以非常低的浓度使用锌螯合剂并持续很短的时间，使得其仅影响隐窝中的帕内特细胞而不影响其它细胞。用锌螯合剂处理之后，对类器官形成进行评价。当在初始隐窝中不再存在帕内特细胞时，观察到类器官形成显著降低(图20)。在存在Wnt3a的条件下，该降低被部分地恢复(数据未显示)。这支持了帕内特细胞在维持干细胞龛中的作用，其支持隐窝中Lgr5+干细胞的分化。实施例5培养条件同样支持胃的类器官的生长胃由3个局部解剖区域(胃底部，胃体部和胃窦)和2个功能性腺区(泌酸的和幽门的)。泌酸腺区包括该器官的80%，而幽门部包括该器官的20%。哺乳动物胃上皮被组织成由平面状表面上皮、短的小凹和长的腺体组成的胃单元。小凹衬有粘液分泌细胞，而腺体由分散于以下三个区域中的分泌细胞组成峡部、颈部和基部。胃上皮不断地更新。我们实验室进行的追踪研究表明，位于腺体基部的LGR5阳性细胞满足干细胞性的定义(Barker et al.准备中)。迄今而至，胃单层培养物不能覆盖胃单元的特征，胃单元是由数种分化的胃细胞形成。此外，3-D培养法体系仅报道了重建高度分化的胃表面粘液细胞，而没有出现任何内分泌细胞。而且，这些培养仅进行了 7天的时间，因此表现出缺乏自我更新的能力 (Ootani A, Toda S, Fujimoto K, Sugihara H.Am J Pathol. 2003 Jun ； 162 (6) :1905-12)。 这里我们开发出一种从鼠胃的幽门部分离胃单元的方法，并且已开发出一种能表现出更长保持时间的3D-培养体系。材料和方法胃单元分离将分离的胃纵向剖开，并用冷的改进DMEM/F12(InVitr0gen)洗涤。在体视镜下，切下幽门部，并与胃体和前胃分离，用镊子小心地将幽门粘膜与肌肉层分离。然后，将组织切成大约5mm的小块，并再一次用冷的分离缓冲液(Na2HPO4 28mM+KH2P04 40mM+NaCl 480mM+KCl 8mM+蔗糖220mM+D-山梨醇274mM+DL_ 二硫苏糖醇2. 6mM)洗涤。将组织块与分离缓冲液一起在5mM EDTA中于4°C下轻轻摇动孵育2小时。去除EDTA溶液之后，用IOml 移液管将组织块用力地悬浮于IOml冷的分离缓冲液中。弃掉含有死细胞的第一上清液，并用10-15ml冷的分离缓冲液悬浮沉淀物。再一次用力悬浮组织块之后，上清液富集胃单元。 每10-20次悬浮，新鲜的冷的分离缓冲液替换上清液，并将上清液保存在冰上，检测胃单元的存在。重复该步骤直到胃单元完全释放，通常为4-5次。将富集胃单元的悬液以600rpm 离心2-3分钟，以使分离的胃单元与单细胞分离，并将沉淀物用来培养。胃培养按以前部分的描述，通过与5mM EDTA 一起于4°C下孵育2小时而使含有腺体、峡部和凹区的整个胃单元与鼠胃的幽门部分离。对分离的胃单元进行计数并沉淀。将100个胃单元与25μ 1基质胶(BD Bioscience)混合，接种到48孔组织培养板上，并于37°C孵育 5-10分钟，直到基质胶完全聚合。聚合之后，添加250 μ 1组织培养基(改进DMEM/F12，并补充有 Β27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondin UlOOng/ ml Noggin、lOOng/ml Wnt3A、50或lOOng/ml KGF)。每2天更换全部培养基。为了传代，用 1000 μ 1移液管将类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶。以 1 4的分种率每周1次或2次进行传代。在这些条件下，培养物维持了至少1个月。试剂改进DMEM/F12和补充物Ν2和Β-27无血清补充剂购自Invitrogen，N-乙酰半胱氨酸购自Sigma。鼠重组EGF、Noggin和人KGF购自P印rotech，Wnt3A重组蛋白购自Mem Cell Research。对于提到的生长因子，仅检测了不同浓度的R-Spondin 1和KGF。在50ng/ ml时，R-Spondin 1抑制培养物生长。可以以50或100ng/ml使用KGF，但是浓度为IOOng/ ml时，出芽效率较高。按之前所述，制备Wnt3A 条件培养基(Willert K, Brown JD, Danenberg E, Duncan AW, Weissman IL, Reya Τ, Yates JR 3rd, Nusse R. Nature. 2003May 22 ；423 (6938) 448-52)。免疫组化和成像分析对于X-gal染色，用配制在IOOmM MgCl2 PBS溶液中的0. 25%戊二醛(Sigma)， 将类器官于室温下直接固定于基质胶中1-2小时。之后，用洗涤溶液(配制在PBS中的 0. 01% 脱氧胆酸钠+0. 02% NP40+5mM MgCl2)洗 3 次，并在存在 0. 21 % K/e (CN) 6 和 0. 16% K3Fe(CN)6 的条件下，与 lmg/ml X-Gal (Invitrogen) 一起于 37°C下孵育 16 小时。在 PBS 中洗涤之后，用含2% PFA的PBS在室温下对培养物进行后固定15分钟。所有的试剂均获自 Sigma。对于免疫组化，用胰酶(Tryple Select, Invitrogen)从基质胶分离类器官，用 4%的PFA于室温下将分离的类器官固定1小时，并包埋入石蜡中。用标准技术加工石蜡切片，并按以前所述进行免疫组化。使用以下抗体抗小鼠Ki67(克隆匪1，Monosan) (1 200)、抗兔切割的半胱天冬酶-3 (Cell Signaling Technology) (1 400)和抗人胃粘蛋白5AC(N0V0Castra clone 45M1) (1 200)。在所有情况下都进行柠檬酸盐缓冲液抗原回收。用Mayer氏苏木素复染切片。用倒置显微镜(Nikon DM-IL)或共聚焦显微镜(Leica SP5)来采集胃的类器官和分离的胃腺的图像。结果目前，胃培养物都是单层生长。然而，单层培养物缺乏覆盖整个胃单元的特征的能力，胃单元由数种分化的胃细胞(小凹粘液细胞、肠内分泌细胞和增殖性无粘液细胞)形成。最近我们实验室通过体内谱系追踪表明，存在于肠隐窝基部的Lgr5阳性细胞是真正的肠干细胞(Barker N, van Es JH, Kuipers J, Kujala P, van den Born M, Cozijnsen M, Haegebarth A,Korving J,Begthel H,Peters PJ, Clevers H. Nature. 2007 ;449 :1003-7)。 与肠上皮一样，胃上皮不断更新。在幽门胃腺单元底部发现Lgr5阳性细胞，追踪研究表明， 这些LGR5阳性细胞能表现出自我更新能力和多潜能能力而满足干细胞性的定义(Barker et al.准备中)。由于我们已经能从单个Lgr5+细胞培养出3-D结构的肠隐窝，因此意图确定相似的条件是否能维持幽门胃单元的体外生长。用5mM EDTA分离胃腺单元之后，将胃腺(图21a)悬浮于基质胶中。胃培养物生长需要 EGF (50ng/ml) ,Noggin (100ng/ml)、R_spondin 1 (1 μ g/ml)和 Wnt3A (lOOng/ml)(图 21b)。KGF(50或lOOng/ml)对于出芽事件的形成的是必需的，并且因此对培养物的扩增是必需的。因此，培养的幽门单元表现同肠隐窝的类器官一样。单元开放的上部分是封闭的， 并且腔充有凋亡细胞。新形成的胃的类器官经历连续的出芽事件(表明腺体分裂)，同时维持它们的极性，胃腺在中央腔出芽。当使用Wnt3A条件培养基时，检测到出芽形成的效率显著提高(图21c)，这表明出芽形成和形态发生的Wnt剂量依赖性，所述Wnt3A条件培养基表现出的Wnt活性高于重组Wnt3A重组蛋白10-100倍。类器官培养至少1个月，而没有丧失所述特性。每周通过机械解离将类器官以 1 4进行传代(图22)。Lgrf-LacZ幽门胃单元的培养表明，胃的类器官中存在Lgr5阳性干细胞(图23a)。如Ki67染色所证明，增殖性细胞位于腺样结构的基部(图23b)，而发现凋亡的半胱天冬酶3阳性细胞被挤进腔中(图23c)。胃粘蛋白5AC(MUC5AC)是胃小凹细胞 (也称为小凹细胞)的特异标志物。在类器官中发现MUC5AC阳性细胞，这表明至少一种分化的胃细胞谱系的存在(图23d)。然而，没有检测到内分泌腺来源的细胞。因此，需要其它因子。所述因子包括促胃液素释放肽、Hedgehog和Notch家族的激活剂或抑制剂、Wnt通路的其它激活剂和BMP家族的其它抑制剂、TGF家族的激活剂。实施例6a胰腺的类器官可在体外生长材料和方法将新鲜分离的胰腺切成小块，并在定轨摇床(80rpm，37 °C )中，在 DMEM(Invitrogen)中与消化酶混合物(300U/ml XI型胶原酶(Sigma)、0. Olmg分散酶 I (Roche)和0. Img DNA酶)一起孵育10分钟。孵育之后，通过机械吹打使组织块温和地解离。使未消化的组织块以正常重力沉降1分钟，并将上清液转移至新管中。使上清液通过 70 μ m的细胞过滤器，并用DMEM洗涤残留物。用DMEM冲洗倒转的细胞过滤器来收集细胞过滤器上残余的组织块，并将其离心沉淀。这些组织块主要由胰腺腺泡组织组成，并且包含胰管。将沉淀与基质胶混合，并按照小肠的类器官培养体系(参见实施例1的材料和方法) 进行培养。将基质胶于37°C孵育5-10分钟。在基质胶聚合之后，添加500 μ 1组织培养基(补充有 B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondin UlOOng/ ml Noggin、50 或 lOOng/ml KGF (Peprotech)的改进 DMEM/F12)。每 2 天添加生长因子。每 4-6天更换全部培养基。对于传代，用1000 μ 1移液管将类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶中。以1 4的分种率每周1次或2次进行传代。在这些条件下，培养物维持至少2个月。结果在EGF存在下培养3-4天之后，胰腺组织形成了简单的包囊结构。Noggin和 R-spondin协同增加了包囊结构的大小，但是不影响类器官的形态发生。KGF显著提高出芽形成和培养效率。利用最佳的生长因子组合(EGF、N0ggin、R-Sp0ndin 1和KGF)，在生长因子的最佳组合中，大于80%的胰管生长。一旦取出培养物中的胰管，胰管立即密封结构的两端，形成简单的结构。在起始培养之后7天，大约20%的类器官开始形成出芽结构(图M)。胰管快速增殖，这与腺泡组织相反，腺泡组织生长非常缓慢。有趣的是，在类器官传代之后，起始培养之后大约2-3周，观察到胰岛样结构(图 25)。在传代之前通常没有观察到这些小岛样结构。这些小岛存活至少7天，但增殖非常缓慢或根本不增殖。这些小岛样结构与存在于健康胰腺组织中的郎格罕氏胰岛类似。这类小岛含有分别产生胰高血糖素和胰岛素的α细胞和β细胞等。所观察到的小岛样结构含有表达胰岛素、神经发生素3和Pdx-I的细胞。检测数种生长因子，以确定它们是否能增加来源于胰腺组织的类器官中胰腺β细胞的存在。候选生长因子包括环巴胺(Sonic-hedgehog 抑制剂)、激活素、GLP (胰高血糖素样肽)及其衍生物(ExendiM)、促胃液素和烟酰胺。实施例6b胰腺的类器官可在体外生长材料和方法将新鲜分离的胰腺切成小块，并在定轨摇床(80rpm，37 °C )中，在 DMEM(Invitrogen)中与消化酶混合物(300U/ml XI型胶原酶(Sigma)、0. 01mg/ml分散酶 I (Roche)和0. lmg/ml DNA酶)一起孵育10分钟。孵育之后，通过机械吹打使组织块温和地解离。使未消化的组织块以正常重力沉降1分钟。用消化酶混合物对未消化的组织块再消化10分钟。重复该消化步骤直到未消化的组织块主要由胰管组成。在显微镜下从未消化的组织块手动挑出胰管结构。将该胰管与基质胶混合，并按照小肠的类器官培养体系(参见实施例1的材料和方法)进行培养。将基质胶于37°C孵育5-10分钟。在基质胶聚合之后， 添加500 μ 1组织培养基(补充有1\611^311^1、青霉素/链霉素、101111 H印es、B27、N2、IOmM N-乙酰半胱氨酸、10nM[Leu15]-促胃液素 IUOOnM Exendin4、IOmM 烟酰胺、50ng/ml EGF、 1 μ g/ml R-spondin UlOOng/ml Noggin、50■lOOng/ml FGF7(KGF) FGF10(Peprotech) 的改进DMEM/FU)。每2天更换培养基。对于传代，用1000 μ 1移液管将类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶中。以1 4的分种率每周1次或2次进行传代。在这些条件下，培养物维持至少10个月。结果在EGF存在下培养3-4天之后，胰腺组织形成了简单的包囊结构。Noggin和 R-spondin协同增加了包囊结构的大小，但是不影响类器官的形态发生。FGF7 (KGF)/FGF10 显著提高出芽形成和培养效率。利用最佳的生长因子组合(EGF、Noggin、R-spondin 1和
31FGF7 (KGF) /FGF10)，在生长因子的最佳组合中，大于80%的胰管生长。一旦从培养物中取出胰管，胰管快速密封结构的两端，形成简单的结构。在起始培养7天之后，大约80%的类器官开始形成出芽结构(图M)。胰管快速增殖，这与腺泡组织相反，腺泡组织的生长非常缓慢。有趣的是，类器官在传代之后，起始培养大约2-3周之后，观察到胰岛样结构(图 25)。在传代之前通常没有观察到这些小岛样结构。这些小岛存活至少14天，但增殖非常缓慢或根本不增殖。这些小岛样结构与存在于健康胰腺组织中的郎格罕氏胰岛类似。这类小岛含有分别产生胰高血糖素和胰岛素的α细胞和β细胞等。所观察到的小岛样结构含有表达胰岛素、神经发生素3和Pdx-I的细胞。检测数种生长因子，以确定它们是否能增加来源于胰腺组织的类器官中胰腺β细胞的存在。候选生长因子包括环巴胺(Sonic-hedgehog 抑制剂)、激活素、GLP (胰高血糖素样肽)及其衍生物(ExendiM)、促胃液素和烟酰胺。实施例7通过驱动Wnt/Lgr5再生响应而进行的成体胰腺祖细胞的体外无阻碍扩增材料和方法小鼠、试剂和组织从以下小鼠获得胰腺组织=Axin-LacZ敲入小鼠(Lustig et al. Mol. Cell. Biol. 2002)、Lgr5-LacZ 敲入小鼠(Barker et al，2007)、Lgr5_GFP 小鼠(Barker et al, 2007)。用 100 μ g 纯化的人 R-spondin 1 (由 A. Abo, Nuvelo Inc, CA, USA 惠赠)腹腔注射 Axin-LacZ小鼠，并在48小时以后处死，用于胰腺中LacZ的表达分析。胰管结扎按照(Wang et al. , 1995)所述的在大鼠中进行结扎的方法并进行某些较小的修改。PDL的实验步骤如下用氟阿尼酮芬太尼咪达唑仑的混合物分别以 3. 3mg/Kg,0. 105mg/Kg和1. 25mg/Kg的剂量进行腹膜内注射来麻醉动物。以仰卧的姿势放置动物，将腹部表面去毛，并用抗菌溶液(碘液)清洁。然后，从剑突开始在上前部腹壁制造正中切口，暴露胰腺。在解剖显微镜下，定位胰的脾叶，并用7-0聚丙烯缝线单丝在距胃叶管的接点远端约Imm处结扎胰管。手术后，皮下给予剂量为0. 01-0. 05mg/Kg的止痛剂丁丙诺啡。然后，用5-0丝线缝合腹壁和皮肤。按实施例6所述处理新鲜分离的胰腺，将得到的胰腺组织块在以下所述的条件下培养。机械分离出主胰管和胰管的第一分支。将组织块切成小块，并在定轨摇床(80rpm， 37 °C )中，在DMEM (Invitrogen)中与消化酶混合物(300U/ml XI型胶原酶(Sigma)、 0. 01mg/ml分散酶I (Roche)和0. lmg/ml DNA酶)一起孵育30分钟。消化后，大多数腺泡细胞从组织块释放。使主要由胰管细胞组成的未消化的组织块以正常重力沉降1分钟，弃掉上清液。在用PBS洗涤三次之后，将未消化的组织块在室温下与2mM EDTA/PBS —起孵育 30分钟。用力吹打组织块，并以正常重力沉降1分钟。将富集导管细胞的上清液转移到新管中，并用PBS洗涤三次。将导管细胞离心沉淀，并与基质胶混合。将基质胶于37°C孵育5-10 分钟。在基质胶聚合之后，添加500μ 1扩增培养基(补充有lXGlutamax、青霉素/链霉素、 IOmM Hepes,B27,N2UmM N-乙酰半胱氨酸、10nM[Leu15]-促胃液素 I、IOOnM Exendin4、IOmM 烟酰胺、50ng/ml EGFU μ g/ml R-spondin UlOOng/ml Noggin、50或 lOOng/ml FGF7 (KGF) 或的改进DMEM/FU)。每2天更换全部培养基。对于传代，用1000 μ 1移液管将类器官从基质胶移出，机械解离成小组织块，并转移至新鲜的基质胶中。以1 4的分种率每周1次进行传代。在这些条件下，培养物维持至少2个月。对于分化，将扩增培养基换成分化培养基(补充有Glutamax、青霉素/链霉素、IOmM H印es、B27、N2、200ng/ml N-乙酰半胱氨酸、10nM[Leu15]-促胃液素 I、100nM Exendin4、50ng/mlEGF、1 μ g/ml R-spondin UlOOng/ml Noggin 的改进 DMEM/F12)。FGFlO 获自 P印rotech。BrdU 获自 Sigma。Q-PCR利用RNA小型试剂盒(Quiagen)分离RNA，并用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶 (Promega)进行逆转录。在热循环仪中扩增cDNA。以下列出所用的引物。mmTBP(正向)TATTGTATCTACCGTGAATCTTGGmmTBP(反向)CAGTTGTCCGTGGCTCTCLgr5 (正向)TCCAACCTCAGCGTCTTCLgr5 (反向)TGGGAATGTGTGTCAAAG (Tm = 57 °C )PCR为了区分基因组DNA，将所有的引物设计成位于内含子序列侧翼或跨越内含子序列。 Hprt(F)AAGTTTGTTGTTGGATATGC(R)CATCTTAGGCTTTGTATTTGG(Tm)57 °C，106bpNgn3(F)TCCTCGGAGCTTTTCTACGA(R) TGTGTCTCTGGGGACACTTG (Tm) 60 °C，239bp/373bp (基因组条带)Pax6 (F)AACAACCTGCCTATGCAACC(R) ACTTGGACGGGAACTGACAC TM 60°C，206bp葡萄糖激酶(F)AAGATCATTGGCGGAAAG(R)GAGTGCTCAGGATGTTAAG(Tm)57 °C 193bp嗜铬粒蛋白A (F) GCTGACAGCAGAGAAGCGGCT(R) GACAGGCTCTCTAGCTCCTGG (Tm) 60 °C 23 Ibp
Glut2(slc2a2)(F)AAGTTGGAAGAGGAAGTCAG(R)AGACCTTCTGCTCAGTCG(Tm)57 °C 124bp胰岛素(F)TTTGTCAAGCAGCACCTTTG(R)TCTACAATGCCACGCTTCTG(Tm)57 °C，214bp生长抑制素(F)GAGGCAAGGAAGATGCTGTC(R)GGGCATCATTCTCTGTCTGG(Tm)57 °C，214bp胰高血糖素(F)TTACTTTGTGGCTGGATTGCTT(R)AGTGGCGTTTGTCTTCATTCA(Tm)57 °C，149bp图像分析。利用Leica SP5共聚焦显微镜、倒置显微镜(Nikon DM-IL)或立体显微镜(Leica， MZ16-FA)采集隐窝的类器官的图像。对于免疫组化，在室温下用4%多聚甲醛(PFA)对样品固定1小时，并用标准技术(Barker et al，Nature 2007)加工石蜡切片。按以前所述(Barker et al, Nature 2007)进行免疫组化。对于全包埋免疫染色，用分散酶(Invitrogen)从基质胶分离胰腺的类器官，并用4% PFA固定，随后用0. 1% Triton X-100 进行透化处理。以下抗体用于免疫组化抗BrdU (Amersham)、抗Ki67 (Dako)、抗胰岛素 (Sigma)、Jjt C—月太(Cell signaling) Ngn3 (Developmental hybridoma studies bank)。用DAPI或ToftO-3 (Molecular Probes)对DNA进行染色。用共聚焦显微镜获得三维图像。按实施例5中的免疫组化和成像分析进行X-gal染色。FACS在存在或不存在R-Spondind U g/ml)的条件下所培养的胰腺的类器官，并通过机械方式或酶学方式(TrypLE)从基质胶取出胰腺的类器官。用TrypLE在37°C下对分离的类器官再消化10分钟。使解离的细胞通过40 μ m细胞过滤器(BD bioscience)，并用APC 偶联的抗EpCAM(eBioscience)进行染色。利用FluoR印orter试剂盒Qnvitrogen)，按照生厂商的方案对LacZ进行染色。用脉冲宽度、侧向散射参数和碘化丙啶染色对单一活细胞进行画门。单一 Axin2-LaCZ阳性胰腺细胞的体外扩增PDL处理之后7天，从小鼠分离胰腺，并按上述分离胰管。分离的胰管与TrypLE Express(Invitrogen) 一起于37 °C孵育20分钟，随后使其通过40 μ m细胞过滤器(BD bioscience)。按实施例7中所述用EpCAM-APC和LacZ的荧光底物(FluoroR印orter试剂盒)对细胞进行染色。分析细胞，并用流式细胞仪(MoFlo ;Dako Cytomation)分选单个活的上皮细胞，并将其收集在EM培养基中。离心沉淀分选的细胞，使其与基质胶混合，并用含有50% Wnt条件培养基和IOmM Y-27632的EM培养基培养4天。4天之后，将培养基换成无Wnt和Y-27632的EM培养基。结果可以培养来源于小肠的单个Wnt依赖性的Lgr5+干细胞，从而形成连续扩增的肠样的类器官(Sato et &1，2009)。在健康的成体胰腺中，1壯通路是无活性的，并且因此1^1~5 是不表达的。当通过部分导管结扎(PDL)造成损伤时，我们发现Wnt通路变得十分活跃，同时在再生导管的出芽处出现Lgr5表达。在改良肠培养体系的条件下，新鲜分离的成体导管组织块起始Lgr5的表达，并形成出芽包囊，其每周扩增10倍，持续> 30周。生长刺激物的去除将这些包囊转化成具有不成熟小岛形态的结构，该结构表达内分泌腺和β细胞标志物。来自受损胰腺的单个Wnt刺激的细胞也可以起始这些长期的培养。我们推断，当在优化条件下培养时，海弗利克限制(Hayflick limit)不适用成熟祖细胞。因此，有利于器官特异性成体干细胞扩增的培养方法可以提供基于ES或iPS的组织再生的备选方案。尽管很详细地了解胚胎胰腺的外分泌区室和内分泌区室的发育(jensen，2004)， 但是关于出生后胰腺中小岛细胞的产生却知之甚少(Bormer-Weir and Weir, 2005 ； Bouwens and ROOman，20(^)。遗传谱系追踪提供了以下证据在正常的生理条件下和部分胰切除以后，成年小鼠中先存的β细胞产生了新的β细胞，而不是由干细胞/祖细胞产生新的β细胞(Dor et al. ,2004 ；Teta et al.，2007)。最近描述了成年小鼠胰腺的管膜中存在多能祖细胞，在受损的胰腺中该细胞可被活化，从而增加功能性β细胞的量(Xu et al. 2008) 0通过在携带Ngn3启动子报告基因的成年小鼠的胰腺上进行PDL来获得受控损伤，Ngn3编码胚胎小岛细胞祖细胞的主要开关(Apelqvist et al. , 1999 ；Gradwohl et al. ,2000 ；Gu et al. ,2002 ；Schwitzgebel et al.，2000)，并且其在正常出生后的胰腺中是沉默的(Gu et al.，2002)。这些β细胞祖细胞的分化是Ngn3依赖性的，并且产生所有的小岛细胞类型，包括葡萄糖响应β细胞(Xu et al，2008)。目前还不了解是哪些信号驱动损伤时出现这些祖细胞。这样的观点似乎是重要的，因为其可以指导设计祖细胞扩增的体外方法。为了确定Wnt信号转导是否在β细胞祖细胞的诱导中起作用，在成体胰腺中追踪 Axin2-LacZ等位基因的表达。Axin2-LacZ等位基因已被证实为Wnt信号转导提供可靠的、 通常的报告基因(Lustig et al. ,Mol. Cell. Biol. 2002) 0如同预期，该报告基因在成体胰腺中是没有活性的(图^A)。然而，当我们将Wnt激动剂Rspol (Kim et al,2005)注射入 Axin2-LacZ小鼠中来激活Wnt信号通路时，我们观察到沿着导管出现Wnt响应细胞，但是在胰腺泡或胰岛中却没有(图^B)。由于以前仅在胰腺损伤时检测β细胞祖细胞，因此我们随后检验了在进行PDL造成损伤时，这些细胞中的Wnt响应是否被生理激活。图26C 显示从PDL区域和非PDL区域分离的胰腺组织切片的Η&Ε染色。如之前所报道的(Abe et al. 1995)，5天之后腺泡细胞凋亡，并通过未完全了解的机制被新形成的导管结构所替代。 7天之后，还观察到小岛数量(小岛再生)和小岛大小的增加(如星号指示)。这表明PDL 是成功的。AXin2-LaCZ报告基因特定地沿着胰腺的结扎部位的导管被激活，而未结扎部位没有表现出该响应(图26D和E)。而且，通过Ki67染色所测定的增殖响应主要局限于结扎部位的导管，而在未结扎部位的导管中，没有检测到细胞核Ki67(图^F)。这类似于在用 R-Spondin处理之后的胰腺中检测到增殖性的BrdU阳性细胞(图^G)。我们已经证实，在肠中某些Wnt响应细胞群是干细胞(Barker et al,2007)。该细胞群的标志物是Lgr5。Lgr5基因与Axin2类似，是Wnt响应基因。而在肠和皮肤中，Lgr5 基因仅在Wnt刺激的干细胞中表达，但不在过渡放大细胞中表达(Barker et al,2007 Jaks et al，2008)。因此，Lgr5基被认为是真正的干细胞标志物。我们猜测，与肠中的Lgr5+细胞相似，正如损伤后所检测到的，胰腺中的Lgr5+细胞也可能是β细胞祖细胞的起源。为了检验该猜测，我们在Axin-LacZ和Lgr5-LacZ小鼠的胰腺中进行PDL，并测定Lgr5 mRNA 表达和LacZ染色。有趣的是，在PDL后的时间过程中利用qPCR可容易地检测到Lgr5 (图 ^H)。此外，如X-gal染色所示，Lgrf-LacZ敲入小鼠中的PDL导致再生导管的芽中报告基因的特异活性(星号指示)(图261)。活性再生位点处Lgr5表达的出现提示Lgr5可能不仅标志生理上自我更新的干细胞(例如在肠、胃或毛囊中)，而且其表达还可能预示损伤时通过再生的干细胞/祖细胞的Wnt的激活。鉴于Wnt依赖的Lgr5干细胞标志物的出现，我们推断，成体胰腺祖细胞可以在以前所定义的肠的类器官培养条件下扩增(Sato et al，2009)。之前已经建立胰腺细胞异种群体的培养，并且该培养中通常包含生长因子和血清补充剂，所述生长因子例如 EGF (Githens et al. In Vitro Cell Dev Biol. 1989)、FGFlO (Miralles et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999)禾口HGF(Lefebvre et al. Diabetes. 1998，Suzuki et al. ,Diabetes 53，2004)，所述血清补充剂例如促胃液素(Rooman et al. Gastroenterology 2001)、烟酰胺(Rooman et al. Diabetologia. 2000)等。多种这样的培养导致体外产生具有β细胞样表型的细胞(Bonner-ffeir et al.，2000 ；Seaberg et al.，2004 ；Suzuki et al.，2004)，当将所述细胞移植入糖尿病小鼠中时，在某些条件下其能逆转高血糖症(Hao et al. ,2006； Ramiya et al.，2000)。这些方法中的大多数以混合的细胞群开始，所述细胞群随时间衰老。似乎可以公平地说，目前还不存在能维持限定的非转化的成体胰腺祖细胞在很长的一段时间内保持沿内分泌谱系分化的能力的稳定扩增的完善长期培养体系。我们首先试图在扩增培养基(EM)中接种纯化的导管组织块。如图27A所示，小的导管组织块立即经历连续出芽而扩增成为包囊样结构，同时小岛(数据未显示)和腺泡 (底图)逐渐解体。培养物每周扩增10倍(并且每周进行传代)，持续超过30周。检测了多种生长因子，以确定胰腺细胞体外最佳扩增所需的信号(图27B)。显然，在不存在EGF的条件下，培养物在7天之后解体。同样在不存在R-spondin或FGFlO的条件下，培养物的活力在14天以后下降。相反，BMP抑制剂Noggin对胰腺组织块的持续生长没有任何影响。向扩增培养基添加烟酰胺、ExendiM、促胃液素不是必需的，但是可以导致培养效率提高(数据未显示)。由于我们已经证实，Wnt信号转导在PDL时被激活，因此希望能确定向新鲜分离的胰腺组织块体外添加Wnt激动剂对持续生长的效果。当自Axin2-LacZ小鼠分离导管时，整个出芽包囊仅在Wnt激动剂Rspondin 1存在的条件下被染成蓝色(图27C)，这与PDL后的体内情况相似(图26D和E)。在从AXin2-LaCZ胰腺新鲜分离的小岛或腺泡中没有观察到蓝色染色。与PDL时的体内现象一致，只有Lgr5-LacZ包囊的芽被染成蓝色(图27D)。此外，在存在R-spondin的条件下培养胰腺Lgr5-LacZ类器官14天显著增加Lgr5+细胞的百分比(图27E)。重要的是，当在不存在R-Spondin的EM中培养胰腺组织块时，类器官在1个月内停止增殖，而在存在R-spondin的条件下，它们可以无限期扩增。这些观察结果提示， 位于导管附近的Wnt响应祖细胞激发出芽包囊的生长，所述出芽的生长包囊随后由具有干细胞样特性的表达Lgr5的细胞来维持。为了直接检验这个观点，我们从PDL后7天的小鼠分选出AXin2-LaCZ阳性细胞， 并且发现这些细胞有效地起始出芽包囊，这些出芽包囊与导管起始的包囊是无法区分的 (图观)。单细胞需要培养基中存在Wnt3a。对单细胞解离之后存在或不存在Wnt3A条件下的培养效率的比较显示，在不存在Wnt3A条件下培养的单细胞最初长成小包囊结构，但是在2-4天之后停止增殖。这与从分离的胰腺组织块起始胰腺培养的情况不同。有趣的是， 可以在4天之后去除Wnt3A，这表明刺激生长不再必需该信号，或者来源于起始培养的单分选细胞的细胞启动了 Wnt3A的产生。然后我们试图评价出芽包囊产生内分泌腺谱系细胞的潜能。为了这个目的，我们检验了对EM的多种改变，以确定分化培养基(DM)。检验了一系列因子对分化成为内分泌腺谱系的效应。去除FGF10似乎对分化诱导是至关重要的。只有在不存在FGF10的条件下，才会出现小岛样结构(图29A)，这与β细胞祖细胞(Ngn3)的数种分化标志物的表达相符，出现β细胞(胰岛素)、胰高血糖素(α细胞)和生长抑制素(S细胞)(图29Β和 C)。此外，从暴露于DM培养基后10天开始，诸如葡萄糖激酶、Pax6和嗜铬粒蛋白A的分化标志物上调。因此，DM最好由至少EGF和R-Spondin组成，并且不含FGF7或10。在分化条件下，干细胞标志物Lgr5的持续表达可以通过DM中存在Wnt激动剂R-spondin来解释，因为Lgr5是Wnt响应基因。当在存在烟酰胺的EM中培养细胞时，从该培养基去除烟酰胺也是重要的，以便获得完全分化。当将培养任何时间之后的出芽包囊从EM转移至DM时，该包囊经历定式“内卷”过程壁不断向内折叠导致包囊被压紧成为更小的在形态上类似于小岛的致密体(图^D)。通过诸如胰岛素和C-肽的β细胞小岛的标志物证实小岛样形态(图
3629E)。为了证实该再生过程步骤对Wnt信号转导的依赖，在存在或不存在R-spondin的DM 中培养胰腺组织块。重要的是，如Ngn3的表达所证实，在存在R-spondin的条件下仅可以检测到β细胞祖细胞(图^F)。实施例8人胰腺组织块的体外扩增在胚胎胰腺发育过程中，在胰管网络中观察到表达神经发生素3+或胰岛素的细胞，这提示胰管细胞产生内分泌腺祖细胞，并因此产生成熟的内分泌细胞。已经证实，人胰管细胞在体外分化为葡萄糖响应的产胰岛素细胞(Bormer-Weir，S et al 2000PNAS)，并且该发现使得胰管细胞成为β细胞替代疗法的有吸引力的来源。然而，扩增导管细胞同时不丧失内分泌腺分化能力是困难的。在之前所报道的培养体系中，人胰管细胞丧失上皮特性或在2周直到5周之后经历衰老(Trautmann B et al,Pancreas vol. 8 248-254) 因此， 没有完善的培养体系来扩增保留内分泌腺分化能力的人胰管细胞。利用建立的小鼠胰腺的类器官培养体系，我们试图建立人胰腺的类器官培养体系。人胰腺祖细胞的体外生长人胰腺获自荷兰的莱顿大学医学中心(Leiden University Medical Center)。重要的是，在与上述的小鼠胰腺组织块相同的条件下(实施例7)，人的新鲜分离的胰腺组织块也可以体外生长(图30)。在这些扩增条件下，胰腺组织块的培养效率为大约80%，即新鲜分离的胰腺组织块中的80%可在体外较长时间有效扩增。与小鼠胰腺相比，腺泡组织更容易形成包囊结构， 然而，这些结构在4周内停止增殖。来自较大导管网络的胰管细胞能更有效地产生包囊结构，并最终形成具有芽的类器官。以1 5的比率每周1次对胰腺的类器官进行分种，并在体外维持至少5周而不丧失增殖能力。总之，我们建立了人胰腺的类器官培养体系，并成功地将胰管细胞从初始体积扩增至少3000倍。我们正在优化人胰管细胞的内分泌腺分化培养条件，并且该体外方法一旦经过优化，则可能对使β细胞替代疗法可用于1型和2型糖尿病的大量人群具有重要的含义。参考文献Abe K,Watanabe S. 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41
按照他人所述的方案(Willertet al.，2003，Nature. May 22 ；423 (6938) 448-52)制备 Wnt3a 培养基。如 van de Wetering 及其同事所描述(van de Wetering et al. ,2001 Cancer Res. Jan 1 ；61(1) :278-84)，用 T0P/F0P测定来检测 Wnt3a条件培养基和对照条件培养基中的Wnt活性。T0P/F0P比> 50被认为是高Wnt培养基，并将其与胃的类器官培养基以1 1进行稀释。该高Wnt3a培养基的1 10稀释液(T0P/F0P比约为5) 被认为是低Wnt培养基并将其用于分化目的。胃的类器官免疫组化对于免疫组化，用PBS将胃的类器官洗涤一次，并立即用4%多聚甲醛在室温下固定15-20分钟。将胃的类器官包埋入石蜡中，并用标准技术进行加工。对于全包埋染色，用PBS 0. 5% Triton-XlOO-I % BSA对样品进行透化处理，并将其与一抗孵育。在PBS 0. 3% Triton XlOO中洗涤数次之后，将样品与二抗孵育。按照生产商的说明书(Click-IT ； Invitrogen)进行EdU染色。用T0PR03碘或Hoescht33342对细胞核进行染色。用共聚焦显微镜(Leica, SP5)获得胃腺和胃的类器官的图像。用Volocity软件(Improvision)进行三维重建。RT-PCR用RNeasy Mini RNA提取试剂盒Oliagen)从胃细胞培养物或新鲜分离的组织提取RNA，并用莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(!Iomega)进行逆转录。按之前所描述(Huch et al. ,2009) ^tWM^iX (GeneAmp PCR System 9700 ；Applied Biosystems, London, UK)中扩增cDNA。所用的引物显示如下(基因符号后为正向(5’ -3’ )和反向(5’ -3’ )引物)。Lgr5 GGAAATGCTTTGACACACATTC,GGAAGTCATCAAGGTTATTATAAGif TGAATCCTCGGCCTTCTATG,CAGTTAAAGTTGGTGGCACTTCPgc CCAACCTGTGGGTGTCTTCT,TTAGGGACCTGGATGCTTTGMuc6 TGCATGCTCAATGGTATGGT,TGTGGGCTCTGGAGAAGAGTMuc5ac CCATGAAGTGGGAGTGTGTG,TTGGGATAGCATCCTTCCAGGhrl GCCCAGCAGAGAAAGGAATCCA,GCGCCTCTTTGACCTCTTCCGast GCCAACTATTCCCCAGCTCT,GGCTCTGGAAGAGTGTTGCTStt GAGGCAAGGAAGATGCTGTC,GGGCATCATTCTCTGTCTGGMuc2 GAACGGGGCCATGGTCAGCA,CATAATTGGTCTTGCATGCCCdx2 :CTTGCTGCAGACGCTCAAC,TCTGTGTACACCACCCGGTA
Hprt :AAGCTTGCTGGTGAAAAGGA，TTGCGCTCATCTTAGGCTTT结果为了确定胃单元在体外的最佳生长，我们分离出胃腺单元，并将其悬浮于基质胶中并在不同的条件下进行培养。胃培养物的生长条件与小肠培养物的生长条件(包含EGF、 Noggin和R-spondin 1)相似，但是严格依赖条件培养基形式的Wnt3A。利用纯化的Wnt3a 蛋白来证实这个需求(图33A)。此外，FGFlO被证明是驱动出芽事件和将培养物扩增成为多单元的类器官所必需的成分(图33B)。FGFlO可用于替代在实施例5中使用的FGF7(KGF)， 并且替代后甚至能导致起始培养4天之后出芽的类器官的百分比增加2倍(图33C)。新形成的胃的类器官经历连续的出芽事件，同时保持其极性，使得胃腺结构芽分布在中央腔周围(图33D)。在不存在Wnt3A条件培养基的条件下，胃的类器官快速恶化(图33E)。每周将类器官机械解离，并分种为之前接种密度的1/5。如E-Cad染色所证实，培养的幽门单元是单层上皮结构(图33F)。我们已经成功地将胃的类器官培养了至少8个月，而没有检测到丧失任何上文所述的特征。为了确定胃Lgr5ratt细胞(图34A)是否能在体外产生和维持幽门胃腺单元，我们分选出Lgr5-EGFPS细胞(图34B)。当分选出单一 Lgr5_EGFPs细胞时，平均8%的细胞长成类器官，而其它细胞在前M小时内死亡。所分选的Lgr5-EGFPS细胞快速开始分裂，并且 5天之后就可以看见小的包囊样结构。在接下来的时间，新形成的(包囊样)结构开始产生腺样结构(图34C)。培养9-11天之后，将胃的类器官手动解离，并分种以产生新的类器官。已成功地将来自单细胞的胃的类器官每周进行重新接种，持续至少3个月，而没有丧失所述的特征(图34D)。从第7天开始，Lgr5-EGFP表达局限于腺样结构的基部(图34E)。 如EdU染色所证实，增殖性细胞位于这些腺样结构的基部(图34F)，同时发现凋亡的半胱天冬酶3阳性细胞被挤入腔中(数据未显示)。在从Lgr5-EGFP-ires-CreERT2/Rosa^-YFP 报告基因小鼠分离的单个Lgr5ratt细胞所建立的类器官中研究谱系追踪。他莫西芬诱导之后，腺样结构中单个1^5_细胞中的YFPp^t告基因被迅速激活。在接下来的几天内，生长的类器官中的YFP表达结构大量扩增，这证明Lgr5ratt干细胞有助于类器官的体外生长 (图34G)。如E-钙粘附蛋白染色所证实，来源于单细胞培养物的类器官是单层上皮结构 (图341)。除了 Lgr5之外，培养物还表达胃上皮标志物胃固有因子、粘蛋白6和胃蛋白酶原C。在这些培养条件下没有观察到分化为小凹或肠内分泌细胞谱系(这与实施例5不同，在实施例5中观察到小凹细胞谱系。但是在那个实施例中，使用了 Wnt3a蛋白而不是活性较差的Wnt条件培养基。降低Wnt条件培养基的浓度导致分化为小凹细胞谱系，参见以下)。培养基中Wnt3A浓度的降低导致形成具有极化的小凹细胞的相似的胃结构，这正如胃粘蛋白5AC(MUC5AC)的表达和高碘酸-雪夫(PAQ、以及Tff2表达所证明的颈粘液细胞和某些分散的不成熟肠内分泌细胞(嗜铬粒蛋白A)所证实(图34H，I)。添加诸如RA、IGF 和ExendiM的其它生长因子可以导致胃培养物向不同细胞谱系的更成熟的分化。总之，这些体内和体外观察结果表明，Lgr5是胃幽门中以前未受关注的自我更新的多能成体干细胞群的标志物。参考文献1.Barker, N. et al.Identification of stem cells in small intestine andcolon by marker gene Lgr5 (通过标志基因Lgr5在小肠和结肠中鉴定干细胞).Nature 449，1003-7(2007).2. Bjerknes, Μ· & Cheng, H. Intestinal epithelial stem cells and progenitors (肠上皮干细胞和祖细胞).Methods Enzymol 419，337-83 (2006).3. Barker, N. , van de Wetering,M.& Clevers, H. The intestinal stem cell(肠干细胞).Genes Dev 22,1856-64(2008).4. Evans,G. S.，Flint,N. , Somers,A. S.，Eyden,B. & Potten, C. S. The development of a method for the preparation of rat intestinal epithelial cell primary cultures (用于制备大鼠肠上皮细胞初级培养物的方法的幵发).J Cell ScilOl (Pt 1)， 219-31(1992).5. Whitehead, R. H.，Demmler, K.，Rockman, S. P. & Watson, N. K. Clonogenic growth of epithelial cells from normal colonic mucosa from both mice and humanS(来自小鼠和人的正常结肠粘膜的上皮细胞的族群性生长).(Gastroenterology 117,858-65(1999).6.Fukamachi, H.Proliferation and differentiation of fetal rat intestinal epithelial cells in primary serum-free culture (初级无血清培养中大鼠胎儿肠上皮细胞的增殖和分化).J Cell Sci 103 (Pt 2)，511-9 (1992) ·7.Perreault, N. & Jean-Francois, B.Use of the dissociating enzyme thermolysin to generate viable human normal intestinal epithelial cell cultures (使用解离酶嗜热菌蛋白酶来产生活的人正常肠上皮细胞培养物).Exp Cell Res 224,354-64(1996).8.Korinek,V. et al.Depletion of epithelial stem-cell compartments in the small intestine of mice lacking Tcf_4 (在缺失Tcf_4的小鼠小肠中删除上皮干细胞池).Nat Genet 19，379-83 (1998) ·9. Pinto, D. , Gregorieff, A. , Begthel, H. & Clevers, H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium(公认的 Wnt 信号是肠上皮稳定所必需的).Genes Dev 17，1709-13 (2003).10. Kuhnert, F. et al. Essential requirement for Wnt signaling in proliferation of adult small intestine and colon revealed by adenoviral expression of Dickkopf-1 (利用Dickkopf-1的腺病毒表达表明成体小肠和结肠增殖必需 Wnt 信号转导)· Proc Natl Acad Sci U S A 101，266-71 (2004) ·11. Kim, K. A. et al. Mitogenic influence of human R-spondinl on the intestinal epithelium(人 R-spondinl 对肠上皮的促分裂影响)· Science 309， 1256-9(2005).12. Dignass, A. U. & Sturm, A. Peptide growth factors in the intestine (肠中的月太生长因子).Eur J Gastroenterol Hepatol 13,763-70(2001).13. Haramis,Α. P. et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine (从头隐窝形成和青年性多发性息肉症在小鼠肠中的 BMP 抑制).Science 303，1684-6 (2004).
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权利要求
1.隐窝-绒毛的类器官或结肠隐窝的类器官，所述隐窝-绒毛的类器官包含衬有绒毛样上皮的中央腔。
2.培养上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞的方法，所述方法包括提供细胞外基质；将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与所述细胞外基质一起孵育；在存在细胞培养基的条件下，培养所述干细胞、分离的组织块或腺瘤细胞，所述细胞培养基包含用于动物或人类细胞的基础培养基，并且所述基础培养基中添加了骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂和5-500ng/ml的有丝分裂生长因子，如果培养上皮干细胞和分离的组织块，还要添加Wnt激动剂。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述BMP抑制剂是Noggin，所述有丝分裂生长因子是表皮生长因子和角质化细胞生长因子，并且所述Wnt激动剂是R-spondin 1。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述BMP抑制剂选自Noggin、DAN和包括Cerberus 和Greml in在内的DAN样蛋白。
5.如权利要求2或4所述的方法，其中所述Wnt激动剂选自Wnt、R-spondin1_4、 Norrin和GSK抑制剂中的一种或多种。
6.如权利要求2和3-5所述的方法，其中所述Wnt激动剂包含R-spondin1和Wnt-3a 和/或所述有丝分裂生长因子是EGF。
7.如权利要求2-6中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含Rock(Rho激酶)抑制剂，所述Rock抑制剂选自Y-27632、法舒地尔和H-1152。
8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中所述培养基还包含notch激动剂。
9.优选根据权利要求2-8中任一项所述的方法获得和/或培养结肠隐窝的方法，其中-将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质在培养基中接触培养，所述培养基含有Noggin、EGF和作为Wnt激动剂的R-spondin 1和/或 Wnt-3,并补充有B27、N2和N-乙酰半胱氨酸。
10.优选根据权利要求2-8中任一项所述的方法获得和/或培养胰腺的类器官的方法， 其中-在第一步中，将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质在培养基中接触培养，所述培养基含有EGF、KGF或FGF和作为Wnt激动剂的 R-spondin 1，并补充有B27、N2和N-乙酰半胱氨酸；-随后第二步的培养在含有EGF和作为Wnt激动剂的R-spondin 1并补充有B27、N2和 N-乙酰半胱氨酸的培养基中进行。
11.优选根据权利要求2-8中任一项所述的方法获得和/或培养胃组织块的方法，其中-在第一步中，将上皮干细胞、包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞与细胞外基质在培养基中接触培养，所述培养基含有作为BMP抑制剂的Noggin、作为有丝分裂生长因子的表皮生长因子和FGFlOdtS Wnt激动剂的R-spondin 1和Wnt-3a，并且还含有B27、N2、N-乙酰半胱氨酸。-随后第二步的培养在含有表皮生长因子和作为Wnt激动剂的R-spondin 1和Wnt-3a 并补充有B27、N2和N-乙酰半胱氨酸的培养基中进行，其中第二步中Wnt-3的浓度低于第一步中Wnt-3a的浓度。
12.细胞培养基，包含用于动物或人类细胞的基础培养基，并且所述基础培养基中添加了骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、Wnt激动剂和5-500ng/ml的表皮生长因子(EGF)。
13.权利要求12所述的培养基在细胞外基质上培养上皮干细胞或分离的组织块的用途。
14.通过权利要求2-9中所述的方法获得的隐窝-绒毛的类器官或结肠隐窝的类器官， 所述隐窝-绒毛的类器官包含衬有绒毛样上皮的中央腔。
15.优选通过权利要求2-8或10中所述的方法获得的包含小岛样结构的胰腺的类器官。
16.优选通过权利要求2-8或11中所述的方法获得的包含中央腔的胃的类器官。
17.权利要求1或14所述的隐窝-绒毛的类器官或结肠隐窝、权利要求15所述的胰腺的类器官或权利要求16所述的胃的类器官在药物开发筛选、毒性测定或再生医学中的用途。
18.细胞培养基在腺瘤细胞培养中的用途，所述细胞培养基包含用于动物或人类细胞的基础培养基，并且所述基础培养基中添加了骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂和5-500ng/ml 的表皮生长因子(EGF)。
全文摘要
本发明涉及培养上皮干细胞、培养包含所述上皮干细胞的分离的组织块、或腺瘤细胞的方法，以及在培养上皮干细胞和分离的组织块时存在骨形态发生蛋白(BMP)抑制剂、有丝分裂生长因子和Wnt激动剂的条件下培养所述细胞或组织块的方法。本发明还涉及含有BMP抑制剂、有丝分裂生长因子和Wnt激动剂的细胞培养基、所述培养基的用途以及在所述培养基中形成的隐窝绒毛的类器官、胃的类器官和胰腺的类器官。
文档编号C12N5/073GK102439135SQ201080013109
公开日2012年5月2日 申请日期2010年2月3日 优先权日2009年2月3日
发明者佐藤·俊朗, 梅里特克赛尔·胡克·奥尔特加, 约翰尼斯·卡洛鲁斯·克莱威尔斯 申请人:荷兰皇家科学院