抗线虫的转基因植物的制作方法

专利名称：：抗线虫的转基因植物的制作方法抗线虫的转基因植物本申请要求提交于2009年3月20日的美国临时专利申请序号61/161，776的优先权益，其全部内容引用在此作为参考。
背景技术：
：线虫是以2000多种行栽作物、蔬菜、水果和观赏植物为食的微小线虫动物，在全世界引起大约1千亿美元的作物损失。多种寄生线虫物种感染作物植物，包括根癌线虫(root-knotnematode)(RKN)、胞囊形成线虫(cyst-formingnematode)禾口病变形成线虫(lesion-formingnematode)0以在进食位点引起根虫瘿形成为特征的根癌线虫，具有相对广的宿主范围并因此在多种作物物种上是致病的。胞囊形成线虫和病变形成线虫具有较为有限的宿主范围，但是仍在易感作物中引起相当大的损失。致病线虫目前遍及整个美国，在南部和西部的温暖、潮湿区域以及在沙质土壤中发生最为密集。1%4年，首次在美国北卡罗莱纳州发现了大豆胞囊线虫(Soybeancystnematode)(Heteroderaglycines)，其是大豆植物最严重的害虫。一些地区受到大豆胞囊线虫(SCN)侵染太严重，以至于不采取控制措施，大豆产量将不再是经济上可行的。尽管大豆是受到SCN攻击的主要经济作物，但是SCN总共寄生大约50种宿主，包括大田作物、蔬菜、观赏植物和杂草。线虫损害的病征包括在炎热时期叶子的矮化和黄化，以及植物枯萎。然而，线虫感染可以在没有任何明显的地上疾病症状的情况下引起显著的产量损失。产量降低的主要原因是由于地下的根损伤。受到SCN感染的根会矮化或者发育不良。线虫感染也可以减少根上固氮根瘤的数量，并可以使根更易于受到其他土传植物病原体的攻击。线虫的生活史具有三个主要的阶段卵、幼体和成体。线虫物种之间生活史不同。例如，在最佳的条件下，SCN的生活史通常可以在M到30天内完成，然而其他物种可能需要1年或者更长以完成生活史。在春天，当温度和湿度水平变得有利的时候，在土壤中，虫状的幼体从卵中孵化。只有在幼体发育阶段的线虫能感染大豆根。SCN的生活史是很多研究的主题，并且其是理解线虫生活史的有用的实例。在渗透入大豆根后，SCN幼体移动穿过根直到它们接触到维管组织，在那时，它们停止迁移并开始进食。通过口针，线虫注射修饰某些根细胞的分泌物并将它们转变成专门的进食位点。根细胞在形态上被转化成作为线虫的营养来源的大型多核合胞体(或者在RKN的情况下为巨大细胞)。因此，主动进食线虫从植物中盗取基本营养物质，造成了产量损失。随着雌性线虫进食，它们开始膨大并最终变得太大以至于它们的身体突破了根组织并暴露于根的表面。在一段时间的进食后，没有如成体膨大的雄性SCN线虫，迁移到根的外面进入土壤中并使增大的成年雌性受精。然后雄性死亡，而雌性仍依附于根系统并继续进食。在膨大的雌性内的卵开始发育，最初在体外的团块(mass)或卵囊内，并然后随后在线虫体腔内。最终，整个成年雌性体腔都充满了卵，且线虫死去。死亡雌性的充满卵的身体称为胞囊。胞囊最终扩散并在土壤中可随意发现。胞囊的壁变得非常坚硬，为包含在其中的大约200至400个卵提供良好的保护。SCN的卵在胞囊中存活直到合适的孵化条件出现。尽管许多卵可以在第一年内孵化，但是许多卵也会在保护性胞囊中存活几年。线虫在土壤中以其自身的能力每年仅可以移动几英寸。然而，线虫感染可以以多种方式传播相当远的距离。任何移动受感染土壤的东西都能传播感染，包括农业机械、车辆和工具、风、水、动物和农场工人。土壤的种子大小颗粒常常污染收获的种子。因此，当从受感染的田地的受污染的种子播种在未受感染的田地的时候，线虫感染可以传播。甚至有证据表明，某些线虫物种可以通过鸟类传播。这些原因中仅有一些可以预防。用于管理线虫感染的常规方法包括在受线虫感染的土地中保持合适的土壤营养和土壤PH水平；控制其他植物疾病，以及昆虫和杂草害虫；仅在耕种了未感染田地后使用卫生实践，如线虫感染田地的耕作、种植和栽培；在受感染的田地作业后，用高压水或者蒸汽彻底清洁设备；不使用在受感染的土地上生长的种子用于种植未感染的田地，除非种子已经适当地清洁；轮作受感染的田地并用非宿主作物替换宿主作物；使用杀线虫剂；和种植抗性植物品种。已经提出了用于植物的基因转化的方法以赋予对植物寄生线虫增加的抗性。美国专利号5，589，622和5，824，876涉及在受到线虫附着后在植物的进食位点内或者附近特异表达的植物基因的鉴定。这些植物靶基因的启动子随后可用于指导有害蛋白质或者酶的特异表达，或者靶基因或一般细胞基因的反义RNA的表达。此植物启动子也可以用于通过用包含连接于其产物诱导线虫摄食之后死亡的基因的植物靶基因启动子的构建体转化植物，从而在进食位点特异地赋予线虫抗性。近来，已经提出了RNA干扰(RNAi)(也被称为基因沉默)，作为控制线虫的方法。当基本对应于靶基因或mRNA序列的双链RNA(dsRNA)弓丨入细胞时，来自于靶基因的表达受到抑制(见例如，美国专利号6，506，559)。美国专利号6，506，559表明了RNA干扰对秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans)已知基因的效果，但是没有表明RNA干扰用于控制植物寄生线虫的效用。已经提出了用RNA干扰靶向关键的线虫基因，例如，在PCT公开文本WO01/96584、WO01/17654、US2004/0098761、US2005/0091713、US2005/0188438、US2006/0037101、US2006/0080749、US2007/0199100、和US2007/0250947中。已经提出了很多RNA干扰作用的模型。在哺乳动物系统中，大于30个核苷酸的dsRNA以非序列特异性的方式触发诱导干扰素合成和总体蛋白质合成关闭。然而，美国专利号6，506，559公开了在线虫中，对应于靶基因序列的双链RNA的长度可至少为25、50、100、200,300或者400个碱基，甚至更大的双链RNA也有效地诱导秀丽隐杆线虫中的RNA干扰。众所周知，当包含范围为98个到邪4个核苷酸的双链区域的发卡RNA构建体转化入多种植物物种时，靶植物基因被有效地沉默。一般同意在许多生物中，包括线虫和植物，大片段的双链RNA在细胞中被切分为约19-M个核苷酸的片段(siRNA)，这些siRNA是RNA干扰现象的实际介质。尽管已经有许多努力使用RNA干扰控制寄生线虫，到目前为止，在任何国家中还没有解除对转基因线虫抗性的植物的管制。因此，仍然存在使用RNA干扰来鉴定用于控制植物寄生线虫和生产具有增加的植物寄生线虫抗性的植物的安全且有效的组合物和方法的需要。发明概述本发明提供了克服或者减轻有价值的农作物如大豆的线虫侵染的核酸，转基因植4物和方法。本发明的核酸能够用RNA干扰(RNAi)降低植物靶基因的表达。根据本发明，此植物靶基因选自GLABRA-样基因、同源域-样基因(HD-样)、海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因(TTP-样)、未知基因(UNK)、RingH2指-样基因(RingH2-样)、锌指-样基因(ZF-样)和MIOX-样基因。在一个实施方案中，本发明提供了分离的编码双链RNA的表达载体，所述双链RNA包含第一链和与第一链互补的第二链，其中第一链与植物靶基因一部分基本相同，该部分选自靶基因的从约19个到约400或500个连续的核苷酸，其中双链RNA抑制靶基因表达，而其中靶基因选自(a)编码植物GLABRA-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO2中示出的序列的大豆GLABRA-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)编码植物同源域-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:5或者SEQIDNO:8中示出的序列的大豆同源域-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(c)编码植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样蛋白质的多核苷酸；(d)编码植物未知蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:17中示出的序列的大豆未知蛋白质具有至少80%序列同一性；(e)编码RingH2指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:20中示出的序列的大豆RingH2指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(f)编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或者SEQIDNOJ6中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(g)编码MIOX-样蛋白质的多核苷酸。本发明还涉及包含编码一批双链RNA分子的核酸的分离的表达载体，所述RNA分子包含多种RNA分子，每种包含具有约19、20、21、22、23或M个核苷酸长度的双链区域，其中所述RNA分子来自多核苷酸，该多核苷酸选自(a)编码植物GLABRA-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:2中示出的序列的大豆GLABRA-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)编码植物同源域-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO5或者SEQIDNO:8中示出的序列的大豆同源域-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(c)编码植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样蛋白质的多核苷酸；(d)编码植物未知蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:17中示出的序列的大豆未知蛋白质具有至少80%序列同一性；(e)编码RingH2指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:20中示出的序列的大豆RingH2指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(f)编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或者SEQIDNO:26中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(g)编码MIOX-样蛋白质的多核苷酸。在另一个实施方案中，本发明提供了能够表达至少一个双链RNA的转基因植物，所述双链RNA与植物靶基因一部分基本相同，该靶基因选自(a)编码植物GLABRA-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:2中示出的序列的大豆GLABRA-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)编码植物同源域-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:5或者SEQIDNO:8中示出的序列的大豆同源域-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(c)编码植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样蛋白质的多核苷酸；(d)编码植物未知蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:17中示出的序列的大豆未知蛋白质具有至少80%序列同一性；(e)编码RingH2指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:20中示出的序列的大豆RingH2指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(f)编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或者SEQIDNO:26中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(g)编码MIOX-样蛋白质的多核苷酸，其中所述双链RNA抑制该靶基因在植物根中的表达。本发明还包括制备能够表达双链RNA的转基因植物的方法，所述双链RNA包含与植物靶基因一部分基本相同的第一链和与第一链互补的第二链，其中该靶基因选自(a)编码植物GLABRA-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:2中示出的序列的大豆GLABRA-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)编码植物同源域-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:5或者SEQIDNO:8中示出的序列的大豆同源域-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(c)编码植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样蛋白质的多核苷酸；(d)编码植物未知蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:17中示出的序列的大豆未知蛋白质具有至少80%序列同一性；(e)编码RingH2指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:20中示出的序列的大豆RingH2指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(f)编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或者SEQIDNO:26中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(g)编码MIOX-样蛋白质的多核苷酸，所述方法包括以下步骤(i)制备包含编码双链RNA的核酸的表达载体，其中此核酸一旦在植物中表达能够形成双链转录本；(ii)用所述表达载体转化受体植物；(iii)产生一个或多个该受体植物的转基因后代；和(iv)就对线虫感染的耐受性选择后代。本发明还提供了一种赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包含以下步骤(i)选择植物靶基因，所述靶基因选自(a)编码植物GLABRA-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO2中示出的序列的大豆GLABRA-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)编码植物同源域-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:5或者SEQIDNO:8中示出的序列的大豆同源域-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(c)编码植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样蛋白质的多核苷酸；(d)编码植物未知蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:17中示出的序列的大豆未知蛋白质具有至少80%序列同一性；(e)编码RingH2指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:20中示出的序列的大豆RingH2指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(f)编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或者SEQIDNO:26中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(g)编码MIOX-样蛋白质的多核苷酸；(ii)制备包含编码双链RNA的核酸的表达载体，所述双链RNA包含与靶基因一部分基本相同的第一链和与第一链互补的第二链，其中此核酸一旦在植物中表达能够形成双链转录本；(iii)用所述核酸转化受体植物；(iv)产生一个或多个该受体植物的转基因后代；和(ν)就线虫耐受性选择后代。附图简述图1显示了分配给对应的来自大豆(Glycinemax)和其他植物物种的核苷酸和氨基酸序列的SEQIDNO的表。图2显示了GmHD-样(SEQIDNO5)编码的开放阅读框与相关的大豆氨基酸序列GM50534465(SEQIDNO8)的氨基酸比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0.05，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDNO6描述的有义链的RAW484生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO4和SEQIDNO7描述的相应的DNA6序列。图3显示了GmTPP-样(SEQIDNO10)编码的开放阅读框与相关的大豆氨基酸序列GM47125400(SEQIDNO13)和GMsq97c08(SEQIDNO:15)的氨基酸比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0.05，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDN0:11描述的有义链的RTJ150生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO:9，SEQIDNO12和SEQIDNO14描述的相应的DNA序列。图4显示了GmZF-样(SEQIDNO23)编码的开放阅读框与大豆基因索引标识符TC248286(SEQIDNO26)描述的相关的大豆氨基酸序列的氨基酸比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0.05，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDNO24描述的有义链的RAW486生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO22和SEQIDNO25描述的相应的DNA序列。图5显示了GmMIOX-样(SEQIDNO28)编码的开放阅读框与相关的大豆氨基酸序列GM50229820(SEQIDNO:31)的氨基酸比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=10，空位延伸罚分=0.05，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDNO29描述的有义链的RTP2615-1生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO27和SEQIDNO30描述的相应的DNA序列。图6a-c显示了GmHD-样(SEQIDNO4)与相关的大豆序列GM50634465(SEQIDNO7)的DNA比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDNO6描述的有义链的RAW484生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO4和SEQIDNO7描述的相应的DNA序列，如比对中所示。图7a-e显示了GmTPP-样(SEQIDNO9)与相关的DNA序列GM47125400(SEQIDNO:12)和GMsq97c08(SEQIDNO:14)的DNA比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDN0:11描述的有义链的RTJ150生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO:9,SEQIDNO:12和SEQIDNO14描述的相应的DNA序列，如比对中所示。图显示了GmZF-样(SEQIDNO:22)与大豆基因索引标识符TC248286(SEQIDNO25)描述的相关大豆DNA序列的DNA比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDNO:描述的有义链的RAW486生成的发卡茎可以靶向SEQIDNO22和SEQIDNO25描述的相应的DNA序列，如比对中所示。图9a-c显示了GmMIOX-样(SEQIDNO27)与相关的大豆DNA序列GM50229820(SEQIDNO30)的DNA比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位间隔罚分=8)。用具有SEQIDNO29描述的有义链的RTP2615-1生成的发卡茎可以靶向SEQIDN0:27和SEQIDN0:30描述的相应的DNA序列，如比对中所示。图lOa-h显示了示例性的GmHD-样序列(图10a，氨基酸；图10b，核苷酸)，GmTPP-样序列(图10c，氨基酸；图10d，核苷酸)，GmZF-样序列(图10e，氨基酸；图IOf，核苷酸)，和GmMIOX-样序列(图10g，氨基酸；图10h，核苷酸)的总体百分比同一性。百分比同一性由使用VectorNTI软件套件vlO.3.0的多重比对计算得来。图11显示了GmMIOX-样基因(SEQIDNO28)与来自棉花TC86807和TC86837(分别为SEQIDN0:33和SEQIDNO:；35)，甜菜TC6112(SEQIDNO:37)，玉米ZM2G126900(SEQIDNO39)和马铃薯基因索引标识符CV505571(SEQIDNO:41)的相关同源物的氨基酸比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位间隔罚分=8)。图12显示了GmMIOX-样基因(SEQIDNO27)与来自棉花TC86807和TC86837(分别为SEQIDN0:32禾口SEQIDNO:34)、甜菜TC6112(SEQIDNO:36)、玉米ZM2G126900(SEQIDNO38)和马铃薯基因索引标识符CV505571(SEQIDNO40)的相关同源物的核苷酸比对，该比对使用VectorNTI软件套件vlO.3.0(空位开放罚分=15，空位延伸罚分=6.66，空位间隔罚分=8)。图13a_b显示了示例性的MIXO-样序列(图13a，氨基酸；图13b，核苷酸)的总体百分比同一性。百分比同一性由使用VectorNTI软件套件vlO.3.0的多重比对计算得来。图14a-14t显示了在SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、四、30、32、34、36、38、或者40中根据核苷酸位置多种可能的21聚体。优选实施方案详述通过参考以下本发明优选实施方案的详细的说明和本文中所包含的实施例可以更容易地理解本发明。除非另有说明，本文中所用术语应根据相关领域普通技术人员的常规使用进行理解。除了下文提供的术语定义之外，常见的分子生物学术语的定义可见于Riger等人，1991Glossaryofgenetics:classicalandmolecular第5版，Berlin:Springer-VerlagjPCurrentProtocolsinMolecularBiology,F.M.Ausubel等人·，编著，CurrentProtocols,ajointventurebetweenGreenePublishingAssociates,Inc.andJohnWiley&Sons，Inc.，(1998补编)。应当理解，如本说明书和权利要求中所用，单数形式(“a”或“an”)可以意为一个或者多个，取决于在其中使用它的上下文。因此，例如，提到“(一个)细胞”指可以使用至少一个细胞。应当理解，本文中所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，且并不意为限制。在本申请中，参考了多种出版物。所有这些出版物的公开和在那些出版物中引用的那些参考文献以其整体在此都引入本申请中作为参考，以便更充分地说明本发明所属的
技术领域：
。标准的克隆，DNA分离，扩增和纯化技术，涉及DNA连接酶、DNA聚合酶、限制性内切核酸酶等的酶促反应的技术，以及多种分离技术为本领域技术人员所知并且常用。许多标准技术描述于=Sambrook等人，1989MolecularCloning，第二片反，ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Maniatis等人，1982MolecularCloning，ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,N.Y.；Wu(编著)1993Meth.Enzymol.218,PartI;Wu(编著)1979MethEnzymol.68；Wu等人·，(编著)1983Meth.Enzymol.100和101；Grossman和Moldave(编著)1980Meth.Enzymol.65；Miller(编著)1972ExperimentsinMolecularGenetics，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，N.Y.；Old禾口Primrose，1981PrinciplesofGeneManipulation，UniversityofCaliforniaPress，Berkeley;Schleif禾口Wensink，1982PracticalMethodsinMolecularBiology;Glover(编著)1985DNACloning卷I禾口II，IRLPress,Oxford,UK；Hames禾口Higgins(编著)1985NucleicAcidHybridization,IRLPress，Oxford，UK；禾口Setlow禾口Hollaender1979GeneticEngineering-PrinciplesandMethods，卷1-4，PlenumPress,NewYork。使用缩写和名称时认为其是本领域标准的且常用于如这里所弓I用的专业杂志中。如本文中所用，术语“表达载体”指能⑴运输已经与其连接的另一核酸并且(ii)指导与其有效连接的多核苷酸表达的核酸分子。如此处所用，术语“有效连接”和“有效地连接”可互换并用于指目的核苷酸序列以下述方式连接于表达载体的调节序列，所述方式为当载体引入宿主细胞时允许宿主细胞中核苷酸序列表达。术语“调节序列”用于包括启动子，增强子和其他表达调控元件(如多腺苷酸化信号)。如此处所用，“RNAi”或者“RNA干扰”指在植物中序列特异的转录后基因沉默的方法，由双链RNA(dsRNA)介导。如此处所用“双链RNA”指部分或者完全成双链的RNA。双链RNA也被称为短片段干扰RNA(siRNA)、短片段干扰核酸(siNA)、微小RNA(miRNA)等。在RNA干扰方法中，把包含与靶基因的一部分基本相同的第一链和与第一链互补的第二链的双链RNA引入植物。在引入植物之后，含有RNA干扰加工机制的植物细胞将靶基因特异性的双链RNA加工成相对小的片段(siRNA)，导致靶基因沉默。如此处所用，考虑到当对比RNA和DNA序列时尿嘧啶替换为胸腺嘧啶，用于双链RNA的术语“基本相同”指此双链RNA的其中一条链的核苷酸序列与靶基因的20个或者更多的连续的核苷酸至少约为80%-90%相同，更加优选地，与靶基因的20个或者更多的连续的核苷酸至少约为90%-95%相同，最为优选地，与靶基因的20个或者更多的连续的核苷酸至少约为95%、96%、97%、98%或99%相同或者完全相同。20个或者更多的核苷酸意为靶基因的一部分，至少约20、21、22、23、24、25、50、100、200、300、400、500、1000、1500个连续的碱基或者最高达全长。如此处所用，“互补的”多核苷酸是那些根据标准Watson-Crick互补规则能够碱基配对的多核苷酸。特别地，嘌呤将与嘧啶碱基配对形成鸟嘌呤配对胞嘧啶(G:C)以及腺嘌呤在DNA中配对胸腺嘧啶(A:T)，或者腺嘌呤在RNA中配对尿嘧啶的组合。可以理解，尽管他们并不完全地互相互补，两条多核苷酸可互相杂交，条件是每一条有至少一个与另一条基本互补的区域。如此处所用，术语“基本互补”指两条核酸序列在其核苷酸的至少80%上是互补的。优选地，这两条核酸序列在其核苷酸的至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或者更多或者全部上是互补的。备选地，“基本互补”意为两条核酸序列在高度严格条件下可以杂交。如此处所用，术语“基本相同”或者“对应(相应)”指两条核酸序列具有至少80%序列同一性，优选地，这两条核酸序列具有至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。同样如此处所用，术语“核酸”和“多核苷酸”是指线性的或者分枝的、单链或者双链的RNA或者DNA或者它们的杂合物。该术语也包括RNA/DNA杂合物。当双链RNA合成产生时，较少常见的碱基，例如肌苷，5-甲基胞嘧啶，6-甲基腺嘌呤，次黄嘌呤和其他碱基也可以用于反义的，双链RNA和核酶配对。例如，含有尿苷和胞苷的C-5丙炔类似物的多核苷酸已显示出以高亲和力结合RNA并且是基因表达的强力的反义抑制物。也可以制造其他修饰，比如对磷酸二酯主链的修饰，或者对RNA的核糖糖基团中的2’-羟基的修饰。“分离的”核酸分子是基本上与在该核酸的天然来源中存在的其他核酸分子(如，编码其他多肽的序列)分离的一种核酸分子。例如，认为克隆的核酸是分离的。如果核酸已经通过人为干预改变、或者已经将核酸放置于不是其天然位点的基因座或位置、或者如果通过转化将它引入细胞中，那么也认为核酸是分离的。此外，分离的核酸分子，例如cDNA分子，可以没有一些其天然结合的其他细胞物质、或者当通过重组技术产生时，没有培养基、或者当化学合成时没有化学前体或其他化学物质。尽管它可以任选地包括位于基因的编码区的3’和5’末端的非翻译序列，但是优选地可以除去天然地位于其天然发生的复制子中的编码区侧翼的序列。如此处所用，术语“接触”和“施用”可互换使用，指本发明的双链RNA在植物中转录从而抑制植物内关键靶基因的表达的方法。可以以多种方法施用该双链RNA，包括但不限于直接引入细胞(即，细胞内地)；或者细胞外引入，或者进入植物维管系统，或者可由植物转录该双链RNA。例如，可将双链RNA喷雾到植物上，或者可将双链RNA用于根部附近的土壤，令植物将其吸收，或者可以遗传改造植物以表达足够量的靶向植物靶向基因的双链RNA，所述量足以通过双链RNA沉默(RNAi)植物靶基因，来杀死或者不利地影响某些或者全部的该植物所暴露于的寄生线虫。如此处所用，当用于感染的背景时，术语“控制”指减少或者预防感染。减少或者预防线虫感染将使得植物具有增加的线虫抗性；然而，这种增加的抗性并不意指该植物必然具有100%感染抗性。在优选的实施方案中，与不具有线虫抗性的野生型植物相比，在抗性植物中线虫感染抗性大于前者10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、或95%。优选地，野生型植物是这样的植物，其与具有增加的线虫抗性的植物的有相似的基因型，更优选地是有相同的基因型，但并不包含靶向靶基因的双链RNA。植物的线虫感染抗性可能是由于线虫暴露于植物基因特异性的双链RNA时，线虫死亡，不育，发育停滞，或者线虫的移动性受损，所述双链RNA在进食位点发育，维持或者在进食位点提供线虫营养的总体能力上具有某些效用。此处所用术语“对线虫感染有抗性的”或者“具有线虫抗性的植物”指与野生型植物相比，植物避免线虫感染，杀死线虫或者阻碍，减少或者终止线虫发育，生长或者繁殖的能力。这可以由主动方法完成，例如，通过产生对线虫有害的物质，或者由被动的方法完成，如具有减少的对线虫的营养价值或者不发展线虫进食位点诱导的结构如合胞体或者巨大细胞。植物线虫抗性的水平可以由多种方法确定，例如，通过计算能够在该植物上建立寄生的线虫，或者测量线虫发育次数(times)，线虫雌雄比例，或者，对于胞囊线虫，计算生产于受感染植物的根部或者植物检测系统的胞囊或者线虫卵的数目。术语“植物”指包括在成熟或者发育的任何阶段的植物，以及取自或来自任何此植物的任何组织或者器官(植物部分)，除非上下文另有明确说明。植物部分包括但不限于，茎、根、花、胚珠、雄蕊、种子、叶、胚、分生组织区、愈伤组织、花药培养物、配子体、孢子体、花粉、小孢子、原生质体、发根培养物等。本发明也包括由本发明植物产生的种子。在一个实施方案中，与野生型物种的植物种子相比，此种子对于增加的线虫感染抗性而言是不分离的。如此处所用，植物细胞包括但不局限于原生质体，配子生产细胞，再生为整个植物的细胞。植物各种组织的组织培养和由此再生植物已为本领域众所周知和广为公布。如此处所用，术语“转基因”指含有全部或者部分的至少一种重组多核苷酸的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织，或者植物部分。在许多情形中，全部或者部分的重组多核苷酸被稳定地整合进染色体或者稳定的染色体外元件，从而将它传递至连续世代。就本发明的目的，术语“重组体多核苷酸”指已经改变，重排或者通过遗传工程修饰的多核苷酸。实例包括任何克隆的多核苷酸或者连接或关联于异源序列的多核苷酸。术语“重组”不是指天然发生事件造成的多核苷酸的改变，如自发突变，或者来自选择育种之后的非自发诱变造成的多核苷酸的改变。如此处所用，术语“抑制表达的足够量”指此双链RNA的浓度或者数量足够减少mRNA或者蛋白质的水平或者稳定性，所述mRNA或者蛋白质由植物中靶基因产生。如此处所用，“抑制表达”指来自靶基因的蛋白质和/或mRNA产物消失或者可见的水平下降。抑制植物靶基因表达可能导致寄生线虫死亡，或者如果植物疾病与寄生线虫生活史的特定阶段相关，则此抑制会延迟或预防进入特定的发育步骤(如，变态)。抑制的结果可以由线虫外部特性检测确定(如下述实施例所示)。本发明涉及分离的表达载体，所述表达载体编码至少一种能够特异地抑制植物靶基因表达的双链RNA，所述植物靶基因影响线虫进食位点发育、进食位点维持、线虫存活、线虫变态，或者线虫繁殖。本发明的表达载体编码的双链RNA包含第一链和与第一链互补的第二链，其中第一链与植物靶基因一部分基本相同。双链RNA的第一链可以与靶基因任一部分基本相同，只要靶基因在植物中的表达受到抑制。优选地，双链RNA的第一链与靶基因的从约19、20或者21到约400或500个连续的核苷酸基本相同。本发明的表达载体包含有效连接于调节序列的编码双链RNA的核酸，所述调节序列为启动子。任何启动子可用在本发明的分离的表达载体中。优选地，编码双链RNA的核酸受根特异的启动子或者寄生线虫诱导的进食细胞特异的启动子的转录调控。更为优选地，表达载体包含与寄生线虫诱导的进食细胞特异的启动子有效连接的核酸，所述核酸编码双链RNA。在一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物GLABRA-样靶基因表达的双链RNA。GLABRA基因是HD-ZIPIV转录因子家族的一部分。在植物中GLABRA转录因子已经显示出与花色素苷积累，根发育和毛状体发育相关。在这个实施方案中本发明表达载体编码的双链RNA包含与植物基因组GLABRA-样靶基因一部分基本相同的第一链和与此第一链基本互补的第二链。如实施例1所示，分离并在SEQIDNO1中展示全长大豆GLABRA-样靶基因。在此实施方案中，植物GLABRA-样靶基因选自由(a)编码植物GLABRA-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:2中示出的序列的大豆GLABRA-样蛋白质具有至少80%序列同一性(b)具有SEQIDNO1中示出的序列的多核苷酸，(c)具有与SEQIDNO1至少80%序列同一性的多核苷酸；(d)来自植物的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDN0:1中示出的序列在严格条件下杂交。与大豆GLABRA-样靶基因一部分基本相同的示例性的双链RNA第一链在SEQIDNO:3中示出，所述双链RNA第一链适用于本发明的表达载体之中。在另一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物同源域-样靶基因表达的双链RNA。同源域-样基因包含DNA结合结构域并一般被认为是转录因子。在这个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA包含与植物基因组同源域-样靶基因一部分基本相同的第一链和与此第一链基本互补的第二链。如实施例1所示，分离并在SEQIDNO:4中展示全长大豆同源域-样靶基因。在此实施方案中，植物同源域-样靶基因选自(a)编码植物同源域-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:5或SEQIDNO:8中示出的序列的大豆同源域-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)具有SEQIDNO:4或者SEQIDNO:7中示出的序列的多核苷酸，(c)具有与SEQIDNO4或者SEQIDNO7至少80%序列同一性的多核苷酸；和(d)来自植物的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:4或SEQIDNO:7中示出的序列在严格条件下杂交。在SEQIDNO:6中示出与大豆同源域-样靶基因一部分基本相同的示例性的双链RNA第一链，所述双链RNA第一链适用于本发明的表达载体之中。在另一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样(TPP)靶基因表达的双链RNA。植物TPP基因与海藻糖代谢有关。在植物中海藻糖已经显示出其为作为渗透保护剂和信号分子而与胁迫应答和生理相关的重要的糖。TPP酶把海藻糖-6-磷酸转化为海藻糖。如实施例1所示，分离并在SEQIDNO9中展示全长大豆海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因。在这个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA包含与植物基因组海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样靶基因一部分基本相同的第一链和与此第一链基本互补的第二链。此实施方案的表达载体编码能够抑制任何植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因的双链RNA。优选地，此实施方案的双链RNA靶向大豆海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因，所述海藻糖-6-磷酸-磷酸酶-样基因选自(a)编码植物TPP-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO10,SEQIDN0:13、或SEQIDN0:15中示出的序列的大豆TPP-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:12、或者SEQIDNO:14中示出的序列的多核苷酸，(c)具有与SEQIDNO:9、SEQIDN0:12、或SEQIDNO:14至少80%序列同一性的多核苷酸和(d)来自植物的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO9,SEQIDN0:12、或者SEQIDNO14中示出的序列在严格条件下杂交。在SEQIDNO:11中示出与大豆TPP-样靶基因一部分基本相同的示例性双链RNA第一链，所述双链RNA第一链适用于本发明的表达载体之中。在另一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物未知功能的基因表达的双链RNA，所述未知功能基因是具有如SEQIDNO:16所定义的全长序列的大豆未知功能基因的同源物。在这个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA包含与在SEQIDNO:16中所定义的未知靶基因或者其同源物的一部分基本相同的第一链，和与此第一链互补的第二链。在此实施方案中，此双链RNA靶向未知基因，所述未知基因选自(a)植物未知蛋白质，所述未知蛋白质与具有SEQIDNO:17中示出的序列的大豆未知蛋白质具有至少80%序列同一性(b)具有SEQIDNO16中示出的序列的多核苷酸，(c)具有与SEQIDNO16至少80%序列同一性的多核苷酸和(d)来自植物的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:16中示出的序列在严格条件下杂交。在SEQIDNO:18中示出的与大豆未知靶基因一部分基本相同的示例性的双链RNA第一链，所述双链RNA第一链适用于本发明的表达载体之中。在另一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物ringH2指-样靶基因表达的双链RNA。许多植物RingH2指蛋白质与多种植物过程有关，包括非生物和生物胁迫应答、发育、光呼吸作用、程序性细胞死亡、种子萌发、和细胞周期调控。在这个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA包含与植物基因组ringH2指-样靶基因一部分基本相同的第一链和与此第一链互补的第二链。如实施例1所示，分离并在SEQIDN0:19中展示全长大豆ringH2指-样基因。在此实施方案中，此植物ringH2指-样靶基因选自(a)编码RingH2指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:20中示出的序列的大豆RingH2指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)具有SEQIDNO:19中示出的序12列的多核苷酸；(c)具有与SEQIDNO19至少80%序列同一性的多核苷酸；和(d)来自植物的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:19中示出的序列在严格条件下杂交。在SEQIDNO21中示出与大豆RingH2指靶基因一部分基本相同的示例性双链RNA第一链，所述双链RNA第一链适用于本发明的表达载体之中。在另一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物锌指-样靶基因表达的双链RNA。含锌指基序的基因与多种植物过程相关，包括蛋白质-蛋白质相互作用和DNA结合。在这个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA包含与植物基因组锌指-样靶基因一部分基本相同的第一链和与此第一链基本互补的第二链。如实施例1所示，分离并在SEQIDNO:22中展示全长大豆锌指-样基因。在此实施方案中，大豆锌指-样靶基因选自(a)编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或SEQIDNOJ6中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)具有SEQIDN0:22或SEQIDNO:25中示出的序列的多核苷酸，(c)具有与SEQIDN0:22或SEQIDNO:25至少80%序列同一性的多核苷酸和(d)来自植物的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO:22或SEQIDNO:25中示出的序列在严格条件下杂交。在SEQIDNOJ4中示出与大豆锌指-样靶基因一部分基本相同的示例性的双链RNA第一链，所述双链RNA第一链适用于本发明的表达载体之中。在另一个实施方案中，本发明的分离的表达载体编码能够抑制植物MIOX-样基因表达的双链RNA。肌醇加氧酶(MIOX)是细胞壁聚合物合成中的关键酶，调节两个涉及半纤维素和果胶生物合成的通路中的一个。MIOX催化肌醇分裂为葡糖醛酸，所述葡糖醛酸随后在两步过程中被转化为尿苷-二磷酸-葡糖醛酸(UDP-GlcA)。MIOX在植物和动物界中高度保守，在迄今筛选的所有植物中，发现其作为单拷贝基因或者小基因家族。在这个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA包含与植物基因组MIOX-样靶基因一部分基本相同的第一链和与此第一链基本互补的第二链。如实施例1所示，分离并在SEQIDN0:27中展示全长大豆MIOX-样基因。SEQIDNO:27描述的大豆MIOX-样基因序列包含开放阅读框，所述开放阅读框具有公布于SEQIDNO的氨基酸序列。如实施例3所示，SEQIDNO28描述的此氨基酸序列用来鉴定来自棉花、甜菜、玉米、和马铃薯的同源的MIOX-样氨基酸序列。SEQIDNO:33、SEQIDNO:35、SEQIDNO:37、SEQIDNO:39、和SEQIDNO41分别示出了相应的同源的氨基酸序列，并且这些代表性的MIOX-样蛋白质序列或者序列片段的比对展示于图lla-b中。SEQIDNO32,SEQIDNO34,SEQIDNO36,SEQIDNO:38、和SEQIDNO:40描述了相应的同源DNA序列，并且代表性的MIOX-样同源物和SEQIDNO27的比对展示于图12a-e中。相应地，在此实施方案中，植物MIOX-样靶基因选自由(a)编码植物MIOX-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO28,SEQIDNO33、SEQIDNO35、SEQIDNO:37,SEQIDN0:39、或SEQIDNO:41中示出的序列的植物MIOX-样蛋白质具有至少80%序列同一性；(b)具有SEQIDNO27,SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO32、SEQIDNO34,SEQIDNO36、SEQIDNO:38、或SEQIDNO:40中示出的序列的多核苷酸，(c)具有与SEQIDNO27,SEQIDNO29,SEQIDNO30,SEQIDNO32,SEQIDNO34,SEQIDNO36,SEQIDNO:38、或SEQIDNO:40至少80%序列同一性的多核苷酸和(d)来自寄生线虫的多核苷酸，所述多核苷酸与SEQIDNO27,SEQIDNO29、SEQIDNO30、SEQIDNO32,SEQIDNO34,SEQIDNO36、SEQIDN0:38、或SEQIDNO:40中示出的序列在严格条件下杂交。可以用本文提供的信息和生物
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人员所知的那些技术从大豆之外的植物分离本发明植物靶基因相应的其它cDNA。例如，可以从植物cDNA文库分离下述核酸分子，其来自植物且与SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、M、25、27、29或者30的核苷酸序列在严格条件下杂交。如此处所用，关于DNA与DNA印迹杂交，术语“严格条件”指在IOXDenhart，s溶液、6XSSC、0.5%SDS、和100μg/ml变性鲑精DNA中在60°C过夜杂交。随后在62°C依次用3XSSC/0.1%SDS、随后用IXSSC/0.1%SDS，最后用0.IXSSC/0.SDS洗涤印迹，每次30分钟。也如此处所用，在优选的实施方案中，用语“严格条件”指在6XSSC溶液在65°C杂交。在另一个实施方案中，“高度严格条件”指在10XDenhart，s溶液、6XSSC、0.5%SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中在65°C过夜杂交。随后在65°C依次用3XSSC/0.1%SDS、随后用IXSSC/0.1%503，最后用0.IXSSC/0.1%SDS洗涤印迹，每次30分钟。Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138:267-284描述了核酸杂交的方法；本领域众所周知。备选地，可以从植物细胞分离mRNA，而且可以用反转录酶制备cDNA。可以基于SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、29、或者30中显示的核苷酸序列设计聚合酶链式反应扩增的合成的寡核苷酸引物。可以用cDNA，或者备选地，基因组DNA作为模板和合适的寡核苷酸引物，根据标准的PCR扩增技术扩增本发明植物靶基因相应的核酸分子。如此扩增的核酸分子可以被克隆入合适的载体并用DNA序列分析表征。如上述讨论，线虫和植物胞内把长度大于约19-M个核苷酸的双链RNA的片段切割成长度约19-个核苷酸的siRNA，并且这些siRNA是RNA干扰现象的实际介质。图14a-t中的表格示出了大豆GLABRA-样基因SEQIDNO:1、同源域-样基因SEQIDNO:4、海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因SEQIDNO:9、未知基因SEQIDNO:16、ringH2指-样基因SEQIDNO19、锌指-样基因SEQIDNO:22和MIOX-样基因SEQIDNO27以及其各自片段与同源物的示例性的21聚体，如表中示出的SEQIDNO所示。此表也可用于通过从每一个21聚体加或减去合适的核苷酸数目计算19、20、22、23或者M聚体。本发明表达载体编码至少一个双链RNA，所述双链RNA长度可以在靶基因约19个核苷酸到约500个连续的核苷酸或高达靶基因全长的范围内。本发明表达载体编码的双链RNA可以以miRNA方式实施，所述miRNA靶向于靶基因一部分相应的单一位点，所述靶基因一部分包含其19、20、或21个连续的核苷酸。备选地，本发明表达载体编码的双链RNA可具有长度为从约19、20、或21个核苷酸到约600个连续的核苷酸。在另一个实施方案中，本发明表达载体编码的双链RNA具有长度为从约19、20、或21个核苷酸到约400个连续的核苷酸，或者为从约19、20、或21个核苷酸到约300个连续的核苷酸。如此处公开，实施本发明并不必需双链RNA和靶基因之间100%序列同一性。优选地，本发明的双链RNA包含19-核苷酸部分，所述19-核苷酸部分与靶基因的19个连续核苷酸部分基本相同。尽管为了抑制优选包含与本发明植物靶基因一部分相同的核苷酸序列的双链RNA，本发明能够容忍可能预料的序列变异，所述可能预料的序列变异起因于基因操作或者合成、遗传突变、品系多态性、或者进化趋异。因此本发明的双链RNA也包括包含与靶基因有至少1、2、或者更多个核苷酸错配的双链RNA。例如，本发明考虑在图14a-t中例示的21聚体双链RNA序列可包含1、2、或更多核苷酸的添加、缺失或者取代，只要获得的序列仍然干扰此植物靶基因功能。本发明的双链RNA和植物靶基因之间的序列同一性可以由本领域所知的序列比较禾口比对算法(见Gribskov禾口Devereux,SequenceAnalysisPrimer,StocktonPress,1991，和彼处引用的参考)和通过，例如，植入BESTFIT软件程序的Smith-Waterman算法，使用缺省参数(如UniversityofWisconsinGeneticComputingGroup)计算核苷酸序列间的差异百分数来优化。优选抑制性RNA和靶基因的至少19个连续的核苷酸之间大于80%序列同一性，90%序列同一性或甚至100%序列同一性。当本发明表达载体编码双链RNA，所述双链RNA长度长于约21个核苷酸，例如，从约50个核苷酸至约1000个核苷酸时，编码的双链RNA将在植物细胞中被随机地切割为约19-24个核苷酸的siRNA。本发明的较长双链DNA的切割将产生均来自于此较长双链RNA的19聚体、20聚体、21聚体、22聚体、23聚体或M聚体的双链RNA的库。本发明表达载体产生的siRNA具有对应于植物靶基因的完整序列上的约19-M个连续核苷酸片段的序列。例如，本发明表达载体产生的来自SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、四、30、32、34、36、38或40中示出的靶基因的siRNA的库可包含多种RNA分子，所述RNA分子选自图14a-14t中与SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、29、30、32、34、36、38或40的21聚体核苷酸基本相同的寡核苷酸。本发明表达载体编码的siRNA的库也可含有具有任何21个连续核苷酸序列的特异性RNA分子的组合，所述连续核苷酸序列来自图14a-14t中示出的SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、29、30、32、34、36、38或40。此外，由于植物中多种特异化的Dicer产生大小通常在从19nt到范围之内的siRNA(见Henderson等人，2006.NatureGenetics38721-725.)，本发明表达载体编码的siRNA可以在从约19个连续核苷酸到约M个连续核苷酸范围之内。类似地，本发明表达载体编码的siRNA的库可包含多种RNA分子，所述RNA分子具有来自SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、四、30、32、34、36、38或40的任何19、20、21、22、23或对个连续核苷酸序列。备选地，本发明表达载体编码的siRNA的库可包含多种RNA分子，所述RNA分子具有来自SEQIDNO:1、3、4、6、7、9、11、12、14、16、18、19、21、22、24、25、27、29、30、32、34、36、38或40的任何19、20、21、22、23、和/或M个连续核苷酸序列的组合。本发明表达载体可以任选地编码双链RNA，所述双链RNA在任一末端或两个末端包含单链突出端。优选地，此单链突出端在此双链RNA分子的每一链的3’末端包含至少两个核苷酸。此双链结构可以通过单一自身互补RNA链(即，形成发夹环)或者两个互补RNA链形成。RNA双链体形成可以在细胞内或细胞外起始。当本发明的双链RNA形成发夹环时，它可以任选地包含如美国2003/0180945A1中示出的内含子或核酸间隔区，所述核酸间隔区是互补RNA链之间的一段序列，以稳定细胞中发卡转基因。制备多种双链RNA分子的方法陈述于，例如，WO99/53050和美国专利号6，506，559中。可以引入一定量的RNA，所述一定量允许递送至少每个细胞一个拷贝。双链物质的更高剂量可以产生更有效的抑制作用。如上述描述，本发明分离的表达载体包含编码双链RNA分子的核酸，其中在宿主植物细胞中表达此载体导致与宿主植物细胞的野生型种类相比增加的寄生线虫抗性。本发明分离的表达载体能够介导宿主植物细胞中编码的双链RNA的表达，这意味着此重组体表达载体包括一个或者多个调节序列，如，启动子，基于用于表达的宿主植物细胞选择所述调节序列，所述调节序列有效地连接于编码此双链RNA的核酸。在一个实施方案中，此核酸分子还包含位于此核酸分子任何末端侧翼的启动子，其中此启动子驱动每一条单个DNA链表达，从而产生杂交并形成双链RNA的两条互补RNA。在另一个实施方案中，此核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列在一个转录单元上转录为双链RNA的两条链，其中有义链从此转录单元的5’末端转录而反义链从3’末端转录，其中3至500个碱基或者更多的碱基对分隔开这两条链，其中转录后RNA转录本自身折叠形成发卡。根据此发明，此发卡转录本的间隔区区域可以是任何DNA片段。根据本发明，如果将引入的多核苷酸掺入非染色体自主复制子中或者整合入植物染色体，则它可以在植物细胞中稳定地维持。备选地，引入的多核苷酸可以存在于染色体外的非复制载体上并且被瞬时表达或者瞬时有活性。不论存在于染色体外非复制载体内或者整合入染色体的载体内，此多核苷酸优选地位于植物表达盒。植物表达盒优选地包含能够驱动植物细胞中基因表达的调节序列，所述调节序列被有效连接从而每个序列可以实现其功能，例如，通过聚腺苷酸化信号终止转录表达。优选地聚腺苷酸化信号是那些来自于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)t_DNA，例如已知是Ti-质粒pTiACH5的章鱼碱合酶的基因3(Gielen等人，1984，EMBOJ.3835)或其功能等价物，但是植物中全部其他功能活性的终止子也适合。因为植物基因表达非常经常不限于转录水平，植物表达盒优选地包含其他有效连接的序列，如翻译增强子例如超驱动序列，所述超驱动序列包含增强每个RNA多肽比率的来自烟草花叶病毒的5’非翻译前导序列(Gallie等人，1987，Nucl.AcidsResearch15:8693-8711)。植物表达载体的实例包括那些详述于Becker，D等人，1992,Newplantbinaryvectorswithselectablemarkerslocatedproximaltotheleftborder,PlantMol.Biol.20:1195-1197；Bevan,M.W.，1984,BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation,Nucl.Acid.Res.12:8711-8721；禾口VectorsforGeneTransferinHigherPlants；于TransgenicPlants,卷1,EngineeringandUtilization，编著Kung禾ΠR.Wu，AcademicPress,1993,S.15-38中的实例。本发明的表达盒中有用的启动子包括任何启动子，其能够启动处于植物根中的植物细胞中的转录。如此启动子包括，但不限于那些可以从植物、植物病毒和细菌得到的启动子，所述细菌包含在植物中表达的基因，例如农杆菌属(Agrobacterium)和根瘤菌属(lihizobium)。优选能够表达与寄生线虫接触的细胞中编码的双链RNA的启动子。备选地，启动子可以驱动远离线虫接触位点的植物组织中的双链RNA表达，并且此双链RNA可以随后由植物运输到与寄生线虫接触的细胞，特别是线虫进食位点细胞或靠近线虫进食位点的细胞，例如合胞体细胞或者巨大细胞。优选地，本发明的表达盒包含根特异性启动子，病原体诱导启动子或线虫诱导启动子。更为优选地，线虫诱导启动子是寄生线虫进食位点特异性启动子。寄生线虫进食位点特异性启动子可以对于合胞体细胞或巨大细胞有特异性，或对于这两种细胞均有特异性。本发明中有特定用途的是合胞体位点优选的，或者线虫进食位点诱导的启动子，包括但不限于来自共同拥有的共同未决WO2008/095887中公开的Mtn3-样启动子，共同拥有的共同未决W02007/096275公开的Mtn21-样启动子，共同拥有的共同未决W02008/077892公开的过氧化物酶-样启动子，共同拥有的共同未决TO2008/0717公开的海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样启动子和共同拥有的共同未决WO2008/095888公开的At5gl2170_样启动子的启动子。以上所有申请在此处引用作为参考。此外，启动子TobRB7、AtRPE,AtPyklO、Gemini19和AtHMGl已经显示出受线虫诱导(线虫诱导的启动子的综述见Arm.Rev.Wiytopathol.(2002)40:191-219；同样见美国专利号6，593，513)。分离另外的线虫诱导的启动子的方法陈述于美国专利号5，589，622和5，824，876中。也可以通过诱导的启动子促进植物基因表达(综述见Gatz，1997,Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.48:89-108)。其他诱导的启动子包括来自芸苔属(Brassica)的hsp80启动子，可由热激诱导；PPDK启动子由光诱导；来自烟草，拟南芥属，和玉米的PR-I启动子可由感染病原体诱导；和Adhl启动子由缺氧和冷胁迫诱导。化学诱导的启动子尤其适用于如果要求时间特异性的基因表达。如此启动子的非限制实例是水杨酸诱导的启动子(PCT申请号WO95/19443)，四环素诱导的启动子(feitz等人，1992，PlantJ.2:397-404)和乙醇诱导的启动子(PCT申请号WO93/21334)。备选地，此启动子可以是组成型的，发育阶段优选的，细胞类型优选的，组织优选的或者器官优选的。组成型的启动子在大多数的情况下是有活性的。组成型启动子的非限制实例包括CaMV19S禾口35S启动子(Odell等人，1985，Nature313:810-812)、sXCaMV35S启动子(Kay等人，1987，Science236:1299-1302),Sepl启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，PlantCell2:163-171)，拟南芥肌动蛋白启动子、泛素启动子(Christensen等人，1989，PlantMolec.Biol.18:675-689)；pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81:581-588)，玄参花叶病毒!35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984,EMBOJ.3=2723-2730)、GRP1_8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利号5，683，439)，来自农杆菌T-DNA的启动子，如甘露碱合酶，胭脂碱合酶，和章鱼碱合酶，核酮糖二磷酸羧化酶的小亚基(ssuRUBISCO)的启动子等。在另一个实施方案中，本发明的表达载体包含双向启动子，驱动两个核酸分子的表达，以此一个核酸分子编码与双链RNA第一链基本相同的序列，所述双链RNA的第一链与植物靶基因基本相同，该植物靶基因选自本文所描述的GLABRA-样基因、同源域-样基因、海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因、未知基因、ringH2指-样基因、锌指-基因、或MIOX-样基因，而另一个核酸分子编码与第一链互补的此双链RNA的第二链，其中当两个序列都转录时此两条链能够形成双链RNA。双向启动子是能够介导向两个方向表达的启动子。备选地，本发明的表达载体包含两个启动子，第一个启动子介导双链RNA的第一链转录，所述双链RNA的第一链与植物靶基因一部分基本相同，该植物靶基因选自本文所描述的GLABRA-样基因、同源域-样基因、海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因、未知基因、ringH2指-样基因、锌指-样基因、或MIOX-样基因，而第二个启动子介导此双链RNA的第二链转录，所述此双链RNA的第二链与第一链互补且当两个序列都转录时能够形成双链RNA。例如，第一个启动子可以是组成型的或组织特异性的而第二个启动子可以是组织特异性的或病原体诱导的。本发明也在转基因植物中实施，所述转基因植物包含本发明的表达载体。此实施方案的转基因植物能够表达前述双链RNA从而抑制GLABRA-样靶基因、同源域-样靶基因、海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样靶基因、未知靶基因、ringH2指-样靶基因、锌指-样靶基因或者MIOX-样靶基因。此实施方案的转基因植物因此是抗线虫的。根据本发明，植物是单子叶植物或者双子叶植物。本发明的转基因植物可以是任何对植物寄生线虫感染易感的物种，此类物种包括，但不限于，苜蓿属(Medicago)、茄属(Solanum)、芸苔属(Brassiea)、黄瓜属(Cucumis)、古月桃属(Juglans)、棉属(Gossypium)、苹果属(Malus)、葡萄属(Vitis)、金鱼草属(Antirrhinum)、科杨属(Populus)、草莓属(Fragaria)、拟南芥属(Arabidopsis)、云杉属(Picea)、辣椒属(Capsicum)、藜属(Chenopodium)、菊属(Dendranthema)、牵牛属(Pharbitis)、松属(Pinus)、豌豆属(Pisum)、禾酉属(Oryza)、玉蜀黍属(Zea)、小麦属(Triticum)、Triticale、黑麦属(Secale)、黑麦草属(Lolium)、大麦属(Hordeum)、大豆属(Glycine)、黄杉属(Pseudotsuga)、高凉菜属(Kalanchoe)、甜菜属(Beta)、向日葵属(Helianthus)、烟草属(Nicotiana)、南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、驴食豆属(Onobrychis)、红花草属(trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹤草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、萝卜属(Raphanus)、芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、曼陀罗属(Datura)、直菪属(Hyoscyamus)、矮牵牛属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、Majorana、Ciahorium、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、Heterocallis、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、Panieum、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、Salpiglossis、Browaalia、菜豆属(Phaseolus)、燕麦属(Avena)和葱属(Allium)。优选地植物是作物植物，如小麦、大麦、高粱、黑麦、黑小麦、玉米、稻、甘蔗、豌豆、苜蓿、大豆、胡萝卜、芹菜、西红柿、马铃薯、棉花、烟草、胡椒、卡诺拉油菜(canola)、油菜(oilseedrape)、甜菜(beet)、甘蓝、花椰菜、椰菜或莴苣。可以用任何方法转化本发明的表达载体进入植物细胞以生产本发明的转基因植物。转化或转染宿主细胞包括植物细胞的适宜的方法为植物生物
技术领域：
所公知。一般地转化双子叶植物的方法公开于，例如，在美国专利号4，940，838、5，464，763等中。转化特定双子叶植物例如，棉花的方法，陈述于美国专利号5，004，863；5,159，135；和5，846，797中。可以用美国专利号4，992，375；5，416，011；5，569，834；5，824，877；6，384，301和EP0301749B1中示出的大豆转化方法。转化方法可以包括直接和间接的转化方法。合适的直接方法包括聚乙二醇诱导的DNA摄取、脂质体介导的转化(US4，536，475)、用基因枪的生物射弹方法(FrommME等人，Bio/Technology.8(9):833-9,1990；Gordon-Kamm等人，PlantCell2:603,1990)，电穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干胚，和显微注射。如果要从转化的细胞中再生完整的植物，优选地在质粒上定位额外的可选择的标记基因。直接转化技术同等地适于双子叶植物和单子叶植物。转化也可以通过借助土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌感染(例如EPO116718)、借助病毒载体的病毒感染(EPO067553；US4,407,956；WO95/34668；WO93/03161)或者借助花粉(EPO270356；WO85/01856；US4,684,611)来实施。基于土壤杆菌属的转化技术(特别对于双子叶植物)是本领域熟知的。土壤杆菌属菌株(例如根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)或者发根土壤杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)包含质粒(Ti或者Ri质粒)和用土壤杆菌属感染后转移到植物中去的T-DNA元件。T-DNA(转移DNA)整合到植物细胞的基因组中。T-DNA可以定位在Ti或者Ri质粒上或者单独地包含在所谓的双元载体中。土壤杆菌属介导的转化的方法描述于，例如，HorschRB等(1985)kience225:12中。土壤杆菌属介导的转化最适合于双子叶植物，但是也已经适应于单子叶植物。通过土壤杆菌转化植物描述于，例如，WhiteFF,VectorsforGeneTransferinHigherPlants,TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,S.D.Kung禾口R.Wu编辑，AcademicPress,1993，第15—38页JenesB等TechniquesforGeneTransfer,TransgenicPlants,第1卷，EngineeringandUtilization,S.D.Kung禾口R.Wu编辑，AcademicPress,1993，第128—143页；Potrykus(1991)AnnuRevPlantPhysiolPlantMolecBiol42:205-225中。转化可以造成瞬时或稳定转化和表达。本发明的转基因植物可以是使用已知的植物育种方法，与类似的转基因植物或者用缺乏本发明的核酸的转基因植物或者用非转基因植物杂交来制备种子。此外，本发明的转基因植物可以包含，和/或是与另一种包含一种或者多种核酸的转基因植物杂交，因此在植物和/或其后代中产生转基因的“堆积”。然后，将种子生长以获得包含本发明核酸的杂交可育转基因植物。杂交可育转基因植物可以具有通过母代亲本或者通过父代亲本遗传而来的特定表达盒。第二植物可以是近交系植物。杂交可育转基因植物可以是杂种。任何这些杂交可育转基因植物的种子也包括于本发明中。本发明的种子可以收获自可育转基因植物并用于生长本发明的转化植物的后代，包括包含DNA构建体的杂交植物株系。“基因堆积”也可以通过植物转化来转移两种或多种基因到细胞核中来完成。在转化期间，可以将多个基因依次或者同时引入到细胞核中。通过用靶向多个相连的部分目标序列的单一转基因，通过基因沉默机制，特别是RNA干扰，可以下调植物或靶标病原体物种的多个基因。也可以过表达在单独启动子控制下的堆积的多个基因以达到需求的单一或多个表型。也可以向植物中引入包含过表达基因和沉默靶标的基因堆积的构建体产生单一或者多个农艺学重要的表型。在这些堆积的实施方案中，本发明的表达载体进一步包含核酸序列，所述核酸序列编码除如本文所述编码线虫抗性的序列之外的其他性状。根据本发明，表达载体的编码双链RNA的序列可以与任何感兴趣的多核苷酸序列的组合堆积来创造需要的表型。组合可以产生具有多种性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于疾病抗性、除草剂耐受、产量增强、寒冷和干旱耐受。可以通过任意方法，包括但不限于通过常规方法或遗传转化杂交育种植物，来产生这些堆积的组合。如果通过遗传转化堆积性状，目标多肽序列可以以任何顺序依次地或者同时组合。例如，如果要引入两种基因，那么两种序列可以包含于分开的转化盒中或者在相同的转化盒上。序列的表达可以通过相同或者不同的启动子驱动。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明转基因植物的方法。本发明的这个实施方案包括的步骤为，首先，制备包含编码上述双链RNA的核酸的表达载体。在本方法的第二步中，将此表达载体转化入受体植物。在这一实施方案的第三步中，产生一个或多个此转化的受体植物的转基因后代。在这一实施方案的第四步中，选择有线虫抗性的转基因后代。可以用，例如，描述于美国专利公开2008/0153102中的发根测定或生根外植体测定，通过田间测试转基因后代的线虫抗性，或通过任何其他测试植物线虫抗性的方法，实施线虫抗性测试。由于增加的线虫感染抗性是希望被遗传入多种植物的一般性状。增加的线虫感染抗性是希望被遗传入多种植物的一般性状。本发明可以用于减少任何植物寄生线虫造成的作物破坏。优选地，寄生线虫属于诱导巨大细胞或合胞体细胞的线虫科，比19如长针科(Longidoridae)，毛刺科(Trichodoridae)，异皮科(Heterodidae)，根结科(Meloidogynidae)，短体科(Pratylenchidae)或小垫刃科(Tylenchulidae)。特别地，在异皮科和根结科中。当寄生线虫是球胞囊线虫属(Globodera)时，示例性靶向的物种包括，但不限于，蓍草球胞囊线虫(G.achilleae)、蒿球胞囊线虫(G.artemisiae)、枸杞球胞囊线虫(G.hypolysi)、G.mexicana、欧蓍草球胞囊线虫(G.millefolii)、乔巴特棘皮线虫(G.mali)、马铃薯白线虫(G.pallida)、马铃薯金线虫(G.rostochiensis)、烟草球胞囊线虫(G.tabacum)、和弗吉亚球胞囊线虫(G.virginiae)。当寄生线虫是异皮线虫属(Heterodera)时，示例性靶向的物种包括，但不限于，燕麦异皮线虫(H.avenae)、胡萝卜异皮线虫(H.carotae)、鹰嘴豆异皮线虫(H.ciceri)、十字花科异皮线虫(H.cruciferae),龙爪稷异皮线虫(H.delvii)、微褐藻异皮线虫(H.elachista)、菲利普异皮线虫(H.filipjevi)、冈比亚异皮线虫(H.gambiensis)、大豆异皮线虫(H.glycines)、豌豆异皮线虫(H.goettingiana)、荞麦异皮线虫(H.graduni)、啤酒花异皮线虫(H.humuli)、大麦异皮线虫(H.hordecalis)、麦类异皮线虫(H.Iatipons)、燕麦异皮线虫(H.major)、苜蓿异皮线虫OLmedicaginis)、水稻同居异皮线虫(H.oryzicola)、巴基斯坦异皮线虫(H.pakistanensis)、玫瑰异皮线虫(H.rosii)、甘蔗异皮线虫(H.sacchari)、甜菜异皮线虫(H.schachtii)、蜀黍异皮线虫(H.sorghi)、三叶草异皮线虫(H.trifolii)、荨麻异皮线虫OLurticae)、木豆异皮线虫(H.vigni)和玉米异皮线虫(H.zeae)0当寄生线虫是根结线虫属(Meloidogyne)时，示例性靶向的物种包括，但不限于，高粱根结线虫(M.acronea)、(M.arabica)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、短尾根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、奇氏根结线虫(M.chitwoodi)、咖啡根结线虫(M.cofeicola)、短小根结线虫(M.esigua)、禾草根结线虫(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、南方根结线虫(M.incognita)、印度根结线虫(Μ.indica)、Μ.inornata、爪哇根结线虫(Μ.javantca)、Μ.lini、苹果根结线虫(Μ.mali)、小头根结线虫(M.microc印hala)、小突根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、萨拉斯根结线虫(M.salasi)和花生根结线虫(M.thamesi)。下述实施例并不意为限制本发明权利要求的范围，而是意为某些实施方案的示例。任何在示例性的方法中对于本领域技术人员可见的变化意为落入本发明范围。实施例1靶基因克隆和载体构建使用可得到的大豆靶基因cDNA克隆序列，用PCR分离长度约为200_500bp的DNA片段，所述DNA片段用于构建表1中描述的和实施例2中讨论的双元载体。将此PCR产物克隆入TOPOPcr2.1载体Gnvitrogen,Carlskid，CA)，且插入片段由测序确定。用此法分离靶基因GmTPP-样、GmGLABRA-样、和GmMIOX-样的基因片段。备选地，使用可得到的大豆靶基因的cDNA克隆序列鉴定长度约为200-300bp的DNA片段，所述DNA片段用于构建表1中描述的和实施例2中讨论的双元载体。合成被识别的大豆靶基因的DNA序列，将其克隆入pUC19(Invitrogen)载体，且由测序验证。使用DNA合成分离靶基因GmHD-样，GmRingH2指-样，GmUNK,和GmZF-样的基因片段。为了获得大豆靶基因GmHD-样、GmTPP、未知、GmRingH2指-样和GmZF-样基因的全长cDNA，使用来自SCN感染的大豆根的总RNA和来自hvitrogen的GeneRacer试剂盒(L1502-1)实施5，RACE。大豆靶基因GmHD-样、GmTPP、未知、GmRingH2指-样和GmZF-样基因的全长序列被装配成cDNA，其对应于6个基因靶标，被命名为SEQIDNO:4、SEQIDNO:9、SEQIDNO:16、SEQIDN0:19、和SEQIDNO:22。使用cDNA序列信息确定大豆靶基因GmGLABRA-样和GmMIOX-样基因的全长序列，所述全长序列命名为SEQIDNO1和SEQIDNO:27。使用大豆胞囊线虫(SCN)诱导的启动子生成表达双链RNA构建体的植物转化双元载体，所述双链RNA构建体描述于SEQIDNO:3、6、11、18、21、对、和四。为此，描述于SEQID而3、6、11、18、21、24、和29的基因片段有效连接于30旧秀导的611110^3启动子(W02008/095887)或者At海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样启动子(W02008/071726)，如表1中指定的。获得的植物双元载体含有植物转化可选择的标记，由修饰的拟南芥AHAS基因组成，所述基因赋予除草剂Arsenal((BASFCorporation,FlorhamPark,NJ)耐受性。表1测试的构建体启动子启动子SEQIDNO:dsRNA茎有义片段SEQIDNO:大豆基因輕大豆基因靶SEQIDNO:RTJ150AtTPP4311海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样9，12，14RAW486AtTPP4324锌指-样22,25RAW479AtTPP4321RingH2指-样19RAW484AtTPP436同源域-样4,7RAW483AtTPP4318未知16MSB98AtTPP433GLABRA-样1RTP2615-1GmN34229MIOX-样27,30实施例2靶向大豆靶基因的双链RNA的生物测定在共有的共同未决美国专利公开2008/0153102中公开的生根植物测定系统中使用表1中描述的双元载体。在用实施例1中描述的双元载体转化后产生转基因根。将多重转基因根株系传代培养并以大约500J2/孔的水平，用表面净化的race3SCN第二阶段幼虫(J2)接种。线虫接种后4周，计数每一孔中的胞囊数目。对于每一转化构建体，计算每一株系的胞囊数目以测定构建体的平均胞囊数和标准误差。将每一转化构建体的胞囊数值与平行测试的空载体对照的胞囊数值对比以确定测试的构建体是否导致胞囊数的减少。包含描述于SEQIDNO3、6、11、18、21、24、和四的发卡茎序列的构建体的生物测定结果导致在指定的构建体中测试的很多株系中减少的大豆胞囊线虫胞囊计数的一般趋势，所述指定的构建体包含与每一描述的基因有效相连的SCN诱导的启动子。实施例3鉴定双元构建体靶向的额外的大豆序列如实施例2中公开的，当有效连接于SCN诱导的启动子和表达于大豆根中时，构建体RAW484导致靶向SEQIDNO:4的双链RNA分子的表达和减少的胞囊计数。由SEQIDNO:6描述的RAW484中包含的GmHD-样基因有义片段，对应由SEQIDNO4描述的GmHD-样序列的核苷酸592-791。至少一个从表达自RAW484的双链RNA分子加工所获得的21聚体可以靶向由SEQIDNO7描述的另一个大豆序列。图2显示了表达自RAW484的由GmHD-样靶基因SEQIDNO:5描述的双链RNA分子的鉴定的靶和由SEQIDNO:8描述的GM50634465的氨基酸比对。图6显示了表达自RAW484的由GmHD-样靶基因SEQIDNO4描述的双链RNA分子的鉴定的靶，由SEQIDNO:6描述的包含在RAW484中的GmHD-样基因的有义片段，和由SEQIDN0:7描述的GM50634465的核苷酸比对。图IOa显示了示出彼此氨基酸序列同一性百分数的矩阵表，所述氨基酸序列为由SEQIDNO:5描述的GmHD-样基因全长氨基酸序列和由RAW484表达的由SEQIDNO:8描述的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。图IOb显示了示出相互的DNA序列同一性百分数矩阵表，所述DNA序列为由SEQIDNO4描述的GmHD-样基因的全长转录本序列，由SEQIDNO6描述的包含于RAW484中的GmHD-样基因的有义片段，和由SEQIDN0:7描述的RAW484表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。如实施例2中公开的，当构建体有效连接于SCN诱导的启动子且在大豆根中表达时，所述构建体RTJ150导致靶向SEQIDNO9的双链RNA分子的表达和导致减少的胞囊计数。由SEQIDNO11描述的，包含在RTJ150中的GmTPP-样基因的有义片段，包含对应于由SEQIDNO:9描述的GmTPP-样序列的基因的外显子和内含子序列。包含在RTJ150中的GmTPP-样基因的有义片段的外显子区域，对应于SEQIDNO11的核苷酸1到20和核苷酸144到552。SEQIDNO11的核苷酸1到20对应于由SEQIDNO9描述的GmTPP-样序列的核苷酸1Π5到1154。SEQIDNO11的核苷酸144到552对应于由SEQIDNO9描述的GmTPP-样序列的核苷酸1155到1563。SEQIDNO11的核苷酸21到143对应于GmTPP-样基因的内含子序列。至少一个从表达自RTJ150的双链RNA分子的加工所获得的21聚体可以靶向其他大豆序列例如SEQIDN0:12禾口SEQIDNO14。图3显示了由GmTPP-样靶基因SEQIDNO:10描述的表达自RTJ150的双链RNA分子的鉴定的靶和由SEQIDNO13描述的GM4712M00和由SEQIDNO15描述的GMsq97c08的氨基酸比对。图7显示了由GmTPP-样靶基因SEQIDNO:9描述的表达自RTJ150的双链RNA分子的鉴定的靶，由SEQIDNO:11描述的包含于RTJ150中的GmTPP-样基因的有义片段和由SEQIDNO12描述的GM4712M00和由SEQIDNO14描述的GMsq97c08的核苷酸比对。图IOc显示了示出相互的氨基酸序列同一性百分数的矩阵表，所述氨基酸序列为由SEQIDNO:10描述的GmTPP-样基因全长氨基酸序列和由SEQIDNO13和SEQIDNO15描述的由RTJ150表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。图IOd显示了示出相互的DNA序列同一性百分数的矩阵表，所述DNA序列为由SEQIDNO9描述的GmTPP-样基因的全长转录本序列，由SEQIDNO11描述的包含于RTJ150中的GmHD-样基因的有义片段，和由SEQIDNO:12和SEQIDNO14描述的由RTJ150表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。如实施例2中公开的，当有效连接于SCN诱导的启动子且在大豆根中表达时，构建体RAW486导致靶向SEQIDNO:22的双链RNA的表达和导致减少的胞囊计数。由SEQIDNO:描述的，包含在RAW486中的GmZF-样基因的有义片段，对应由SEQIDN0:22描述的GmZF-样序列的核苷酸643-841。至少一个从表达自RAW486的双链RNA分子加工所获得的21聚体可以靶向由SEQIDNO:25描述的其他大豆序列。图4显示了表达自RAW486的由GmZF-样靶基因SEQIDNO23描述的双链RNA分子的鉴定的靶和由SEQIDNO26描述的大豆基因索引序列TCM8286的氨基酸比对。图8显示了表达自RAW486由GmZF-样靶基因SEQIDNO22描述的双链RNA分子鉴定的靶、由SEQIDNO24描述的包含于RAW486中的GmHD-样基因的有义片段和由SEQIDNO25描述的大豆基因索引序列TCM8286的核苷酸比对。图IOe显示了示出相互的氨基酸序列同一性百分数的矩阵表，所述氨基酸序列为由SEQIDNO23描述的GmZF-样基因全长氨基酸序列和由SEQIDNO25描述的由RAW486表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。图IOf显示了示出相互的DNA序列同一性百分数的矩阵表，所述DNA序列为由SEQIDNO:22描述的GmZF-样基因的全长转录本序列，由SEQIDNOJ4描述的包含于RAW486中的GmZF-样基因的有义片段，和由SEQIDNO25描述的由RAW486表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。如实施例2中公开的，当有效连接于SCN诱导的启动子且在大豆根中表达时，构建体RTP2615-1导致靶向SEQIDNO27的双链RNA的表达和导致减少的胞囊计数。由SEQIDNO:描述的，包含于RTP2615-1中的GmMIOX-样基因的有义片段，对应由SEQIDNO:27描述的GmMIOX-样序列的核苷酸361到574。至少一个从表达自RTP2615-1的双链RNA分子加工所获得的21聚体可以靶向由SEQIDNO:30描述的另一个大豆序列。图5显示了表达自RTP2615-1由GmMIOX-样靶基因SEQIDNO28描述的双链RNA分子的鉴定的靶和由SEQIDNO31描述的GM50229820的氨基酸比对。图9显示了表达自RTP2615-1由GmMIOX-样靶基因SEQIDNO:27描述的双链RNA分子的鉴定的靶、由SEQIDNO:描述的包含于RTP2615-1中的GmMIOX-样基因的有义片段和由SEQIDNO:30描述的hyseq序列GM06MC048445_0229820的核苷酸比对。图IOg显示了示出相互的氨基酸序列同一性百分数的矩阵表，所述氨基酸序列为由SEQIDNO描述的GmMIOX-样基因的全长氨基酸序列和由SEQIDNO31描述的由RTP2615-1表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。图IOh显示了示出相互DNA序列同一性百分数的矩降表，所述DNA序列为由SEQIDNO27描述的GmMIOX-样基因的全长转录本序列，由SEQIDNO:描述的包含于RTP2615-1中的GmMIOX-样基因的有义片段，和由SEQIDNO30描述的由RTP2615-1表达的双链RNA分子的另外的大豆转录本靶。实施例4MIOX-样同源物如实施例2中公开的，当有效连接于SCN诱导的启动子且在大豆根中表达时，构建体RTP2615-1导致靶向SEQIDNO,21的双链RNA的表达和导致减少的胞囊计数。如实施例1中公开的，由SEQIDNO27描述的基因的推定的全长转录本序列包含具有如SEQIDNO:28公开的氨基酸序列的开放阅读框。使用由SEQIDNO:30描述的氨基酸序列鉴定来自其他受寄生线虫感染的植物物种的同源基因。鉴定具有分别与SEQIDN0:27和SEQIDNO28同源的DNA和氨基酸序列的样品基因并且由SEQID:32、34、36、38、和40以及SEQIDNO:33、35、37、39和41来描述它们。图11显示了鉴定的同源物与SEQIDNO28的氨基酸比对。图13a显示了示出鉴定的同源物与SEQIDNO相互的氨基酸同一性百分数的矩阵表。图12显示了鉴定的同源物SEQIDN0:32、34、36、38、和40与SEQIDNO:27和由SEQIDNO29描述的包含在RTP2615-1中的有义链的DNA序列比对。图1显示了示出SEQIDN0:27、由SEQIDNO:描述的包含在RTP2615-1中的有义链、和鉴定的同源物SEQIDN0:32、34、36、38、和40相互的DNA序列同一性百分数的矩阵表。无需使用常规以外的实验，本领域技术人员将认识到，或将能够确认很多本文描述的本发明的特定实施方案的等价物。此类等价物意为由下述权利要求所包含。权利要求1.分离的表达载体，所述表达载体编码双链RNA，所述双链RNA包含第一链和与第一链互补的第二链，其中第一链与编码锌指-样蛋白质的多核苷酸的一部分基本相同，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或SEQIDNOJ6中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性。2.分离的表达载体，所述表达载体包含编码双链RNA分子库的核酸，所述双链RNA分子库包含多种RNA分子，所述各RNA分子包含双链区域，所述双链区域具有的长度约为19、20、21、22、23、或M个核苷酸，其中所述RNA分子来自编码锌指-样蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质与具有SEQIDNO:23或SEQIDNOJ6中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性。3.能够表达至少一种双链RNA的转基因植物，所述双链RNA与编码锌指-样蛋白质的多核苷酸的一部分基本相同，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或SEQIDN0:26中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性，其中双链RNA抑制所述多核苷酸在植物根中的表达。4.制备转基因植物的方法，所述转基因植物能够表达双链RNA，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与编码锌指-样蛋白质的多核苷酸的一部分基本相同，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或SEQIDNO:26中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性，所述第二链与第一链互补，所述方法包括步骤(i)制备表达载体，所述表达载体包含编码双链RNA的核酸，其中所述核酸一旦在植物中表达能够形成双链转录本；()用所述表达载体转化受体植物；(iii)产生一个或多个所述受体植物的转基因后代；和(iv)就对线虫感染的抗性选择后代。5.赋予植物线虫抗性的方法，所述方法包含步骤(i)制备表达载体，所述表达载体包含编码双链RNA的核酸，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链与编码锌指-样蛋白质的多核苷酸的一部分基本相同，所述蛋白质与具有SEQIDN0:23或SEQIDNOJ6中示出的序列的大豆锌指-样蛋白质具有至少80%序列同一性，所述第二链与第一链互补，其中所述核酸一旦在植物中表达能够形成双链转录本；()用所述核酸转化受体植物；(iii)产生一个或多个所述受体植物的转基因后代；和(iv)就线虫抗性选择后代。全文摘要本发明提供了编码双链RNA的表达载体(所述双链RNA靶向某些维持寄生线虫感染需要的植物基因)，抗线虫的转基因植物(所述转基因植物表达此双链RNA)，和与其相关的方法。靶向的植物基因是GLABRA-样基因、同源域-样基因、海藻糖-6-磷酸磷酸酶-样基因、与SEQIDNO16具有至少80％同源性的未知基因、ringH2指-样基因、锌指-样基因或MIOX-样基因。文档编号C12N15/82GK102361987SQ201080012675公开日2012年2月22日申请日期2010年3月19日优先权日2009年3月20日发明者A·威格,B·麦凯格申请人:巴斯夫植物科学有限公司