核酸的检测方法以及试剂盒、装置的制作方法

专利名称：核酸的检测方法以及试剂盒、装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够对通过核酸扩增方法扩增的核酸进行检测的核酸检测方法和试剂盒、装置。
背景技术：
在分子生物学研究领域、基因检查等临床应用领域中，特异性扩增靶标核酸片段的方法成为非常重要的技术。在这样的基因扩增方法中，除了最通用的PCR法 (Polymerase Chain Reaction)以外，还开发出了无需PCR法中不可缺少的复杂温度控制的LAMP(Loop-Mediated Isothermal Amplification) ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)法等的等温扩增方法。作为通过PCR法、LAMP法、ICAN法等扩增出的特定核酸区域的检测方法，大致可以分为对作为扩增产物的DNA进行检测的方法、和对作为副产物的焦磷酸(二磷酸)进行检测的方法这两类。检测双链核酸的最一般方法已知有对扩增反应后的溶液实施琼脂糖电泳，使之结合Khidium Bromide、SYBR Green等荧光性嵌入剂，并观察特异性的荧光的方法(非专利文献1)。但是，电泳后用Khidium Bromide等荧光性嵌入剂进行染色的方法需要30分 1小时左右的泳动时间，而且需要用于检测荧光的紫外线照射装置、荧光检测器等昂贵的机械。此外，作为无需进行电泳、而对PCR产物进行检测和定量的方法，已知有通过预先在PCR开始前的反应液中添加荧光性嵌入剂，并使用荧光分光光度计测定荧光强度，来测定扩增DNA量的方法(专利文献1)。但是，荧光性嵌入剂与引物等单链核酸结合，因而导致不依赖于双链核酸量的背景信号增强、检测灵敏度降低的问题。与此相对，已知有通过用优先与结合了单链核酸的嵌入剂反应的化合物进行处理，来降低背景信号的方法(专利文献 2)。但是，在采用这些方法的情况下，需要用于检测荧光的装置、设备。作为上述以外的方法，例如已知有使用荧光标记的引物进行核酸扩增反应、并通过荧光偏光来检测该核酸扩增产物的方法(专利文献幻。但是，这需要对未进入扩增产物的荧光标记引物的分离操作，不仅烦杂，而且由于引物的分离操作，存在所得核酸扩增片段的收获量减少、结果导致检测灵敏度降低的隐患。此外，一般而言，标记核苷酸、标记引物非常昂贵，在成本方面也存在问题。此外，还已知使偏振光通过核酸扩增反应中的反应液，并通过测定该偏振光的旋光度或圆偏光二色性来检测核酸扩增产物的方法(专利文献4)。但是，旋光度、圆偏光二色性的测定需要特殊装置。现有技术文献专利文献专利文献1 特开平5-237000号公报专利文献2 国际公开第2002/103053号
专利文献3 特开平9-187275号公报专利文献4 特开2002-186481号公报非专利文献非专利文献 1 =Molecular Cloning second edition, vol. 1,6. 15(1989)

发明内容
发明所要解决的问题本发明的课题是提供无需特殊装置、简便且高精度地目测检测采用核酸扩增方法扩增的核酸的核酸检测方法、和核酸检测装置或试剂盒。解决问题的方法本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果发现通过在核酸扩增反应的前或后添加因与核酸结合而色调发生变化的染料，通过在可见光下进行观察，能够检测核酸扩增的有无。而且独立发现通过添加与结合双链核酸的染料相比、优先和与单链核酸结合了的染料、未与核酸结合的染料反应的化合物，改变或者消除来源于除了与双链核酸结合了的染料以外的色调，能够简便且高精度地目测检测上述核酸扩增片段。而且，还制作了利用本方法的目测核酸检测试剂盒、装置，从而完成了本发明。S卩，本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测方法，其包括(1)使被检物与染料接触并反应的步骤；(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。优选在所述步骤(1)的前或后包括使与染料反应的物质与被检物接触的步骤 ⑶。所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。此外，本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其包含(a)保持了能够与核酸结合的染料的载体；(c)被检物通过载体(a)的路径；和(d)在可见光下观察由被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。优选在所述载体(a)与判定部位(d)之间具有(b)保持与染料反应的物质的载体。所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。所述染料优选是选自三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、嶸嗪类染料、吖嗪类染料、 夹氧杂蒽类染料、和菲啶馈盐类染料中的1种以上的染料。此外，所述染料优选是选自结晶紫、龙胆紫B、维多利亚蓝B、甲基紫、夜光蓝、甲基绿、甲苯胺蓝0、天青B、亚甲基蓝、亮甲酚蓝、甲基橙、派洛宁Y、溴化乙锭和中性红中的1种以上的染料。所述与染料反应的物质优选是选自氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂中的1种以上的化合物。
所述酸优选是选自盐酸、硫酸、硝酸、乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸和乳酸中的1种以上的酸。所述碱优选是选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钾、氨和三乙基胺中的1 种以上的碱。所述氧化剂优选是选自过氧化氢、高锰酸钾、氯酸钾、重铬酸钾、溴酸钠、溴酸钾、 卤素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钠、二氧化氯、氯胺、四氧化锇、二甲基亚砜和间氯过苯甲酸中的 1种以上的氧化剂。所述还原剂优选是选自硼氢化钠、氰化硼氢化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、2-巯基乙醇、DL-二硫苏糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇和三2-羧基乙基膦中的1种以上的还原剂。所述pH缓冲剂优选是选自戈氏缓冲液(Good’ s Buffers)、甘氨酸、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、乙酸、和碳酸中的1种以上的PH缓冲剂。此外，本发明涉及核酸的检测装置或试剂盒，其包含(e)保持能够与核酸结合的染料、并具备能够因外力而形成开口从而释放出染料的开口部的载体；(f)将释放出的染料引导向判定部位的路径；和(d)保持导入的被检物、在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与保持的被检物之间的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。优选存在于所述判定部位的被检物还包含与染料反应的物质。所述染料优选是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或pH缓冲剂的处理而发生变化的染料。发明效果根据本发明的方法，无需使用特殊的检测仪器，即可在核酸扩增后通过染料的色调变化目测检测核酸扩增的有无。而且，通过氧化剂、还原剂、酸、碱、PH缓冲剂引起的染料的色调变化，能够目测检测核酸扩增的有无。此外，由于能够用可见光进行检测，能够提供使用可见区域分光光度计(其是一种通用性高的装置)等的简便的核酸检测方法。


[图1]显示本发明的色谱型核酸检测装置的一个例子的示意图。[图2]显示本发明的滤器型核酸检测装置的一个例子的示意图。[图3]显示本发明的吸引型核酸检测装置的一个例子的示意图。[图4]显示本发明的流路型核酸检测装置的一个例子的示意图。[图5]显示本发明的管型核酸检测装置的一个例子的示意图。[图6]在实施例5中，向LAMP反应液中添加了甲基绿时的吸收光谱图。[图7]在实施例5中，向LAMP反应液中添加甲基绿后、再添加了KOH时的吸收光谱图。[图8]在实施例6中，向LAMP反应液中添加了甲苯胺蓝0时的吸收光谱图。[图9]在实施例6中，向LAMP反应液中添加甲苯胺蓝0后，再添加了亚硫酸钠时的吸收光谱图。
发明的
具体实施例方式以下对本发明进行具体说明。1.核酸的检测方法本发明的包含在被检物中的核酸的检测方法包括(1)使被检物与染料接触并反应的步骤、(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。在使被检物与染料接触并反应的步骤(1)中，只要被检物与染料接触、两者之间发生反应即可，可以以任何形式接触。在本发明中，检测对象是核酸，双链核酸包括双链DNA、双链RNA、DNA与RNA的杂合链、以及PNA等人工核酸的双链。而且，即使是单链核酸，当其多个混合存在、且能被染料染色时，也能够采用本发明的检测方法进行确认。对被检物没有特殊限制，只要包含核酸即可。不但可以是核酸扩增方法的反应液， 也可以是来自微生物、动物细胞或植物细胞的抽提液，还可以是来自食品的抽提液。核酸扩增方法只要是以PCR法为代表的扩增核酸序列的方法即可，可以是任何核酸扩增方法。例如，除了 PCR法以外，可以示例出LCR(Ligase Chain Reaction)法、 SDA(Strand Displacement Amplification)法、RCA(Rolling Circle Amplification) 法、CPT(Cycling Probe Technology) Q-Beta ReplicaseAmplification Technology 法、ICAN(Isothermal and Chimeric primer-initiatedAmplification of Nucleic Acids) LAMP (Loop-Mediated Isothermal Amplificaton of DNA) NASBA (Nucleic acid Sequence-based Amplification method) ^去、以及 TMA(Transcription mediated amplification method)法等公知的方法，但不限于此。Q-Beta Replicase Amplification Technology法、RCA法、NASBA法、SDA法、TMA法、LAMP法、ICAN法等是在一定温度下进行扩增反应的方法，其他的PCR法、LCR法等是在温度循环中进行扩增反应的方法。此外，利用逆转录酶等将RNA逆转录为DNA、以该DNA作为模板采用上述的核酸扩增方法可以间接地对RNA进行检测。在本发明中，作为染料，可以列举出三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、噁嗪类染料、吖嗪类染料、吩嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、菲啶镇(phenanthridium)类染料、 偶氮类染料、内酯类染料、磺内酯(sultone)类染料、靛青类染料、花青类染料、羊杂菁 (oxonol)类染料、苯乙烯型(styryl)类染料、吓啉类染料、硫代夹氧杂蒽类染料、方酸镇盐 (squarainium)类染料、克酮酸(croconium)类染料、azulenium类染料、二硫醇金属盐类染料、萘醌类染料、蒽醌类染料、靛酚(indophenol)类染料、香豆素类染料、香豆素酮类染料、 吡喃备t盐类染料、硫代吡喃错盐系、噻唑类染料、喹啉类染料、二苯甲酮类染料、硫代二苯甲酮类染料和它们的混合物。优选为三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料、囔嗪类染料、吖嗪类染料、吩嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、菲啶镇类染料、偶氮类染料、靛青类染料、内酯类染料、 磺内酯类染料和它们的混合物。而且，在本发明中，三苯基甲烷类染料是指具有下述式(1)或式O)[化1]
权利要求
1.包含在被检物中的核酸的检测方法，该检测方法包括(1)使被检物与染料接触并反应的步骤；(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其还包括C3)在步骤(1)之前或之后，使与染料反应的物质与被检物接触的步骤。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，所述染料是色调通过氧化剂、还原剂、酸、 碱、或PH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
4.包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其具有(a)保持有能够与核酸结合的染料的载体；(c)被检物通过载体(a)的路径；和(d)在可见光下观察被检物与染料的反应生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
5.根据权利要求4所述的检测装置或试剂盒，其中，在载体(a)与判定部位(d)之间还具有(b)保持与染料反应的物质的载体。
6.根据权利要求4所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱或PH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
7.根据权利要求6所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是选自三苯基甲烷类染料、噻嗪类染料^恶嗪类染料、吖嗪类染料、夹氧杂蒽类染料、和菲啶备t盐类染料中的1种以上的染料。
8.根据权利要求6所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是选自结晶紫、龙胆紫B、 维多利亚蓝B、甲基紫、夜光蓝、甲基绿、甲苯胺蓝0、天青B、亚甲基蓝、亮甲酚蓝、甲基橙、派洛宁Y、溴化乙锭和中性红中的1种以上的染料。
9.根据权利要求5所述的检测装置或试剂盒，其中，所述与染料反应的物质是选自氧化剂、还原剂、酸、碱、或PH缓冲剂中的1种以上的化合物。
10.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述酸是选自盐酸、硫酸、硝酸、 乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸和乳酸中的1种以上的酸。
11.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述碱是选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸钾、氨和三乙胺中的1种以上的碱。
12.权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述氧化剂是选自过氧化氢、高锰酸钾、氯酸钾、重铬酸钾、溴酸钠、溴酸钾、商素、浓硫酸、硝酸、次氯酸钠、二氧化氯、氯胺、四氧化锇、二甲基亚砜和间氯过苯甲酸中的1种以上的氧化剂。
13.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述还原剂是选自硼氢化钠、氰化硼氢化钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、次硫酸钠、焦亚硫酸钾、硫代硫酸钠、谷胱甘肽、抗坏血酸、2-巯基乙醇、DL- 二硫苏糖醇、1-硫代甘油、半胱氨酸、三丁基膦、氨基乙硫醇和三2-羧基乙基膦中的1种以上的还原剂。
14.根据权利要求9所述的检测装置或试剂盒，其中，所述pH缓冲剂是选自戈氏缓冲液(Good’ s Buffers)、甘氨酸、磷酸、邻苯二甲酸、柠檬酸、巴比妥酸、琥珀酸、乙酸、和碳酸中的1种以上的PH缓冲剂。
15.一种核酸的检测装置或试剂盒，其具有(e)保持能够与核酸结合的染料、并具备能够因外力而形成开口从而释放出染料的开口部的载体；(f)将释放出的染料引导向判定部位的路径；和(d)保持导入的被检物，在可见光下观察因从载体(e)经由路径(f)导入的染料与保持的被检物之间的反应而生成的物质，并目测判定核酸的存在的判定部位。
16.根据权利要求15所述的检测装置或试剂盒，其中，存在于判定部位的被检物还包含与染料反应的物质。
17.根据权利要求15所述的检测装置或试剂盒，其中，所述染料是色调通过氧化剂、还原剂、酸、碱、或PH缓冲剂的处理而发生变化的染料。
全文摘要
简便且高精度地目测检测采用核酸扩增方法扩增的核酸，而无需特殊装置。本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测方法，该检测方法包括(1)使被检物与染料接触并反应的步骤；(2)在可见光下观察该反应生成的物质，目测判定核酸的存在的步骤。此外，本发明涉及包含在被检物中的核酸的检测装置或试剂盒，其具有(a)保持了能够与核酸结合的染料的载体；(c)被检物通过载体(a)的路径；和(d)在可见光下观察由被检物与染料的反应而生成的物质、并目测判定核酸的存在的判定部位。
文档编号C12N15/09GK102356161SQ20108001236
公开日2012年2月15日 申请日期2010年3月15日 优先权日2009年3月19日
发明者加藤智久, 友野润, 宫本重彦, 高桥孝治 申请人:株式会社钟化