变体axmi-r1δ-内毒素基因和使用它们的方法

专利名称：变体axmi-r1δ-内毒素基因和使用它们的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫蛋白的新基因。这些蛋白质和编码它们的核酸序列在制备杀虫制剂中并且在产生转基因抗害虫植物中有用。
背景技术：
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis) (Bt)是形成孢子的革兰氏阳性土壤细菌，其特征在于它产生晶状包含体的能力，其中所述的晶状包含体特异性毒害某些目和种的昆虫，但是对植物和其他非靶向的生物无害。出于这个原因，包括苏云金芽孢杆菌菌株或其杀虫蛋白质的组合物可以作为环境可接受的杀虫剂用来控制农业昆虫害虫或多种人或动物疾病的昆虫媒介。来自苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ -内毒素)具有主要针对鳞翅目、双翅目和鞘翅目幼虫的强力杀虫活性。这些蛋白质也显示出针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、虱目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蜱螨亚纲(Acari)害虫目以及其他无脊椎动物如线形动物门(Nemathelminthes)、扁形动物门(Platyhelminthes) 禾口 Sarcomastigorphora 白勺 舌j"生(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis family tree. 在 Advanced Engineered Pesticides 中，Marcel Dekker, Inc. , New York, N. Y.)。 这些蛋白质起初主要基于它们的杀昆虫活性分类为CryI至CryV。主要类型是鳞翅目特异性(I)、鳞翅目与双翅目特异性(II)、鞘翅目特异性(III)、双翅目特异性(IV)和线虫特异性(V)与(VI)。所述蛋白质进一步划分成亚家族；赋予每个家族内部更高度相关的蛋白质区分字母如CrylA、CrylB、CrylC等。每个部分内部甚至更密切相关的蛋白质给予名字，如 CrylCU Cry 1C2 等。基于氨基酸序列同源性而非昆虫靶专一性，最近描述了 Cry基因的一种新命名法 (Crickmore 等人.(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813)。在这种新分类中，每种毒素赋予一个独特名称，包含初阶(阿拉伯数字)、次阶(大写字母)、三阶(小写字母)和四阶(另一个阿拉伯数字)。在这个新分类法中，罗马数字已经更换为初阶中的阿拉伯数字。序列同一性小于45%的蛋白质具有不同的初阶，并且次阶和三界的标准分别是78%和 95%。晶体蛋白不显示杀昆虫活性直至它在昆虫中肠中被摄取和溶解。摄取的前毒素由昆虫消化道中的蛋白酶水解成活性有毒分子。(Hiifte和Whiteley (1989)Microbiol. Rev. 53 :242-255)。这种毒素与靶幼虫中肠中的顶部刷状缘受体结合并插入顶膜，产生离子通道或孔，从而导致幼虫死亡。δ -内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人Q001)Trends Genetics 17 193-199)。第一个保守的结构性结构域由7 个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由以希腊钥匙构型排列的3个β-片层组成，并且结构域III由“薄卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd等人， 2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因
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最初在二十世纪八十年代早期鉴定Cry3型δ内毒素。Cry3Aal δ内毒素(以前也称作cryC和cryIIIA)先前已经从苏云金芽孢杆菌圣迭戈变种菌株(Bacillus thuringiensis var san diego) (Herrnstadt 等人(1987)Gene. 57 :37-46)、苏云金芽抱杆菌拟步甲亚种(Bacillus thuringiensis tenebrionis) (Hofte 等人(1987)Nucleic acids Res. 15 :7183 ；McPherson 等人(1988)Bio/technology 6 :61-66Sekar 等人(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 :7036-7040)和 EG2158 (Donovan 等人(1988)Mol Mol Gen Genet. 214(3) :365-72)分离。Cry3Aa常常在某种天然芽孢杆菌菌株中作为长斜方形晶体的主要组分观察到，并且作为72kDa蛋白质产生，该蛋白质随后由孢子形成相关蛋白酶通过蛋白酶解加工过程加工成66kDa毒素。这种66kDA蛋白质已知产生针对鞘翅目科罗拉多马铃薯甲虫的活性。因为昆虫可能造成的毁坏和通过控制害虫改善产量，对于发现新形式的杀虫毒素存在持续需要。发明概述提供了用于赋予杀虫活性至细菌、植物、植物细胞、组织和种子的组合物和方法。 组合物包括编码杀虫多肽和杀昆虫多肽的序列的核酸分子、包含这些核酸分子的载体和包含所述载体的宿主细胞。组合物也包括杀虫多肽序列和针对那些多肽的抗体。所述核苷酸序列可以在用于生物(包括微生物和植物)中转化和表达的DNA构建体或表达盒中使用。所述核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在生物中表达的合成序列，所述的生物包括，但不限于微生物或植物。组合物还包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体地，提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸分子。另外，包括与该杀虫蛋白相对应的氨基酸序列。尤其，本发明提供了分离核酸分子，其包含编码变体CRY3的核苷酸序列。也包括与本发明核苷酸序列互补或本发明序列杂交的核苷酸序列。提供了用于产生本发明多肽和用于使用这些多肽控制或杀死鳞翅目、鞘翅目、线虫或双翅目害虫的方法。也包括用于检测样品中本发明核酸和多肽的方法和试剂盒。本发明的组合物和方法在产生具有增强的害虫抵抗性或耐受性的生物中有用。这些生物和包含所述生物的组合物对于农业目的而言是所希望的。本发明的组合物也用于产生具有杀虫活性的经改变或改良的蛋白质，或用于检测产品或生物中杀虫蛋白或核酸的的存在。附图简述

图1显示注释的AXMI-Rl序列(SEQ ID NO 2)。加下划线的区域代表环区域(Li、 L2和L3)。直条形代表结构域I (DI)、结构域II (DII)和结构域III (DIII)之间的边界。箭头指示为产生变体所靶向的一些区域。图 2 显示 Axmi 164 (SEQ ID NO 13)、Axmi 161 (SEQ ID NO 44)、Axmi 152 (SEQ ID NO :45)、Axmi 151 (SEQ ID NO :26)、Axmi 146 (SEQ ID NO :27)、Axmi 141 (SEQ ID NO :28)、 Axmi129(SEQ ID NO 29),Axmi128(SEQ ID NO 30),Axmi127(SEQ ID NO 31),Axmi120(SEQ ID NO32)、Axmi116(SEQ ID NO33)、Axmi114(SEQ ID NO34)、AxmilOl(SEQ ID NO :35)、 Axmi091(SEQ ID NO :36)、Axmi087(SEQ ID NO :37)、Axmi037(SEQ ID NO :38)、Axmi029(SEQ ID NO :39)、Axmi028(SEQ ID NO :40)、Cry8Bbl(SEQ ID NO :41)、Cry8Bcl(SEQ ID NO :42)、 Cry7Aa (SEQ ID NO :43)、AxmiRlPermutP3c7 (evo21) (SEQ ID NO : 13)禾口 Axmi-Rl (SEQ IDNO:2)的比对。发明详述本发明涉及用于调节生物中、尤其植物或植物细胞中害虫抵抗性或耐受性的组合物和方法。“抵抗性”意指害虫(例如，昆虫)在摄取或接触本发明多肽时被杀死。“耐受性”意指损害或减少害虫的运动、采食、繁殖或其他功能。所述方法涉及用编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列转化生物。尤其，本发明的核苷酸序列用于制备拥有杀虫活性的植物和微生物。因而，提供转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。本文中提供包含编码变体Cry3氨基酸序列的核酸序列的组合物，其中该变体具有杀虫活性，特别地是针对鞘翅目害虫的杀虫活性。“变体Cry3”氨基酸序列意指除天然存在的Cry3氨基酸序列之外的Cry3序列，其中该氨基酸序列具有与表16中所述的替换相对应的一个或多个氨基酸替换。对于Cry3序列表，见Crickmore等人(1998)，Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 :807-813,并且对于定期更新，见在 www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_ Crickmore/Bt/index 处的 Crickmore 等人(2003) "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature” (苏云金芽孢杆菌毒素命名法)。在一些实施方案中，天然存在的或“野生型”Cry3序列是SEQ ID NO :1中所述的Axmi-Rl核苷酸序列，其编码SEQ ID NO 2中所述的氨基酸序列。AXMI-Rl序列对应于 GENBANK 检索号P0A379中描述的cry3Aa序列。然而，将会理解可以在任意Cry3蛋白如任意Cry3A、Cry3B或Cry3C蛋白的相应位置处产生表16中描述的替换。“相应位置” 可以通过将靶序列与SEQ ID NO 2比对来确定。见，例如，图2中所示的比对结果。cry3Aa蛋白的晶体结构先前已经测定(Li等人，1991，Nature353 :815-821)。该晶体结构描述了多种环区域，并且相对于该蛋白质的三维结构显示蛋白酶解加工的位点。该种结构表明此毒素排列成与其他S-内毒素序列的结构相一致的3个结构域(一般称作结构域I、II和III)。该毒素的每个结构域具有基于此晶体结构定义的环区域。在该晶体结构发表之前并且自此之后，已经存在众多尝试以描述与Bt内毒素并且尤其cry3-型内毒素的结构与毒性功能相关的广泛简单规则和蛋白酶解在这种活性中的作用。例如，Van Rie等人，1997(美国专利5，659，123)提出通过鉴定不利影响毒性的位置，而后随机替换这些环内部某些位置处的氨基酸，在视为“环”的区域内进行结构域 II的修饰而鉴定导致毒性改善的氨基酸。类似地，Wu和DeanCJ. Mol. Biol.，1996，255 628-640)将丙氨酸随机插入环II残基减弱了蛋白质功能。mi等人(Febs Letters, 2000, 473 :227-232)对环I残基的随机诱变在大多数情况下产生不稳定的蛋白质和减弱的蛋白质功能，并且在两种情况下据报道产生具有增加的毒性和改变的结合特性的蛋白质。对于 cry3Bb毒素(English等人，美国专利6，023，013，作为RE39，580再公布)，据报道在该毒素中的某些替换导致改善的玉米根虫活性，但在大多数情况下，这些改变在与Van Rie所提出或mi和Dean所研究的残基不同的残基中出现。此外，已经在正常由胰蛋白酶样或胰凝乳蛋白酶样蛋白酶切割的cry3A毒素区域中做出修饰，试图改善对鞘翅目并且特别对西方玉米根虫的cry3A活性。Chen等人(美国专利7，030, 295)报道在该蛋白质中特定位置处插入被描述为“组织蛋白酶G切割位点”(或 “胰凝乳蛋白酶/组织蛋白酶G切割位点”;Walters等人，2008，Applied and Environ. Micro. 74 :367-374)的合成四肽AAPF (SEQ ID NO :20)可以导致改善的cry3A活性。
cry3A的胰蛋白酶切割是本领域熟知的，并且已经显示在天然cry3A肽中的大约 R158-N159 区域内天然发生(Carroll 等人 1989Biochem J. 261 :99-105)。另外，还已知胰凝乳蛋白酶在这个区域中的Hisl6Herl62接头处切割(Carroll等人1997J Invert. Biol. 70 :41-49)。Walters等人OOOS)显示通过胰凝乳蛋白酶在该区域中其天然位置 (Hisl61-Serl62接头处)切割修饰的Cry3A( “mCry3A”，其含有胰凝乳蛋白酶/组织蛋白酶G蛋白酶识别位点)。没有报道Cry 3A的这个区域中的天然存在氨基酸序列的诱变导致对鞘翅目害虫改善的杀虫活性。因而，本发明提供相对于相应的野生型序列具有改善的杀虫活性的变体Cry3序列。在多种实施方案中，与AXMI-Rl的杀虫活性相比，变体Cry3杀虫序列具有改善的杀虫活性。“改善的活性”意指靶害虫的死亡率增加、采食减少或者生长减少。活性的改善是相对于野生型序列(例如，AXMI-R1)的活性而言活性增加至少约5%、至少约10%、至少约 20 %、至少约30 %、至少约40 %、至少约50 %、至少约60 %、至少约70 %、至少约80 %、至少约90%、至少约100%、至少约1. 5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍或更大。在一些实施方案中，靶害虫是鞘翅目害虫。在一些实施方案中，本文中所包括的杀虫序列包含SEQ ID NO :1中所述axmi-Rl 序列的变体。“axmi-Rl的变体”意指与AXMI-Rl相对应的核苷酸或氨基酸序列，其中已经在AXMI-Rl序列的某些区域(即，“靶突变区域”)内部导入一个或多个突变。除非另外说明，在靶突变区域外部的氨基酸区域与AXMI-Rl序列相同。相同的区域是相同的氨基酸序列或是编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。将会理解，核苷酸序列可以与野生型核苷酸序列不同，但是因遗传密码子的简并性仍编码野生型氨基酸序列。在其他实施方案中，Cry3的靶突变区域对应于Li等人(1991，Nature353 815-821，通过引用的方式完整并入本文中，尤其就Cry3Aa蛋白的结构描述方面)中描述的所提出的加工和孔形成区域。在多种实施方案中，靶突变区域对应于SEQ ID NO :2的第480 至490位氨基酸位置和第510至530位。在一些实施方案中，变体Cry3序列含有表16中描述的一个或多个突变，包括表16中所列突变的任意组合，直至并且包括在表16中描述的每个位置处的突变。在一些实施方案中，本发明的变体Cry3序列具有选自与SEQ ID NO :2的第158、 482,483和519位相对应的氨基酸位置中的一个或多个替换。在另一个实施方案中，变体 Cry3 序列没有以下替换:P154H、V155H、R315W、R315D、R315M、R315L、G316K、G316N、G316V 或G316A。在又一个实施方案中，本发明的变体Cry3序列没有美国专利6，023，013的表2 中所列突变的任意组合。在另一个实施方案中，变体Cry3序列选自由SEQ ID NO :6、8、10、13、15、17、19和 21-43组成的组。在又一个实施方案中，本文中所包括的的变体Cry3序列由加工和孔形成区中的一个或多个突变和受体结合区中的一个或多个突变组成。本文中所包括的变体具有相对于野生型Cry3的杀虫活性而言改善的杀虫活性。在一些实施方案中，改善的杀虫活性针对鞘翅目害虫，例如，根虫害虫。可以进一步修饰本发明的变体Cry3序列以导入本领域描述的一个或多个Cry3 突变。例如，除美国专禾U 5，659，123 和 6，023，013 ；Wu 和 Dean (J. Mol. Biol.，1996，255 628-640)；或Wu等人(Febs Letters, 2000,473 :227-232)中描述的一个或多个突变之外，本文中所包括的变体AXMI-Rl序列可以包含表16中所列的一个或多个替换或其任意组合。 额外地，变体AXMI-Rl序列可以包含如上文讨论的一个或多个组织蛋白酶G切割位点的插入(例如，在天然胰凝乳蛋白酶或胰蛋白酶切割位点处或其附近)。在本发明的又一个实施方案中，可以将表16中描述的突变导入与AXMI-Rl具有同源性的任意氨基酸序列的相应位置以导入或改善针对目的害虫、尤其鞘翅目害虫如根虫害虫的毒性。见，例如，图2中与AXMi-Ri比对的氨基酸序列，或例如GENBANK 检索号 P0A379. 1、AAA22336. 1、AAA22542. 1、AAS79487. 1、AAU29411. 1、AAW82872. 1、AAA73184. 1、 CAA51996. 1、1DLC_A、Q45744. UQ06117. UAAA74198. UP17969. It 中所述的同源氨基酸序列。可以使用本文中所述的比对程序之一比对同源氨基酸序列以鉴定用于突变的相应位置。备选地，同源氨基酸序列的晶体结构或其另外的三维表示可以叠加到(在Li等人1991， Nature 353 =815-821中描述的)Cry3A的晶体结构上并且比对相应位置。CryiBB蛋白的晶体结构在美国专利6，023，013中描述。所述序列用于构建随后转化至目的生物中的表达载体，作为探针用于分离其他同源(或部分同源的)基因，并且用于通过本领域已知方法(如结构域互换或DNA改组法) 产生改变的杀虫蛋白。所述蛋白质用于控制或杀死鳞翅目、鞘翅目、双翅目和线虫害虫种群并且用于产生具有杀虫活性的组合物。“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”意指针对一种或多种害虫具有毒害活性的毒素，其中所述的害虫包括，但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目或线虫纲的成员，或者与这种蛋白质具有同源性的蛋白质。杀虫蛋白已经从包括例如芽孢杆菌属物种、双酶梭状芽孢杆菌 (Clostridium bifermentans)禾口 Paenibacillus popilliae 的生物分离。杀虫蛋白包括从本文中公开的全长核苷酸序列推导的氨基酸序列和因使用下游可变起始位点或因产生具有杀虫活性的更短蛋白质的加工作用而短于全长序列的氨基酸序列。加工可以在表达该蛋白质的生物中或在摄取该蛋白质后的害虫中发生。分离的核酸分子及其变体和片段本发明的一个方面涉及分离或重组的核酸分子，其包含编码杀虫蛋白和多肽或其生物学活性部分的核苷酸序列，以及这样的核酸分子，其足以用作杂交探针来鉴定编码具有序列同源性区域的蛋白质的核酸分子。如本文中所用，术语“核酸分子”意图包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如，mRNA)和使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的，但优选是双链DNA。“分离的”或“重组的”核酸序列(或DNA)在本文中用来指不再处于其天然环境 (例如处于体外或处于重组细菌宿主或植物宿主细胞)中的核酸序列(或DNA)。在一些实施方案中，分离或重组的核酸不含在衍生该核酸的生物的基因组DNA中天然分布于该核酸侧翼的序列(即，位于该核酸的5'端和3'端处的序列)(优选地是蛋白质编码序列)。出于本发明的目的，用来指核酸分子时，“分离”排除分离的染色体。例如，在多种实施方案中， 分离的编码δ -内毒素的核酸分子可以含有小于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0. 5kb或0. Ikb 的核苷酸序列，所述的核苷酸序列在衍生该核酸分子的细胞的基因组DNA中天然分布于该核酸分子侧翼。在多种实施方案中，基本上不含细胞物质的S-内毒素蛋白包括具有少于约30^^20^^10%或5% (以干重计)的非δ-内毒素蛋白(本文中也称作“杂质蛋白”) 的制备物。
编码本发明蛋白质的核苷酸序列包括编码Cry3变体的核苷酸序列以及其片段和互补序列。“互补序列”意指与给定核苷酸序列充分互补，从而它可以与给定核苷酸序列杂交以因而形成稳定双链体的核苷酸序列。本发明也包括作为编码杀虫蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”意指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的部分。核苷酸序列的片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或它可以是使用下文公开的方法时可以作为杂交探针或PCR引物使用的片段。取决于预期用途，作为编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、 300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400 个连续核苷酸，或者直至本文中公开的编码杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数目。“连续”核苷酸意指彼此紧密相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段将会编码保留杀虫蛋白的生物学活性并且因而保留杀虫活性的蛋白质片段。“保留活性”意指该片段将具有参考杀虫蛋白(即，本文中公开的杀虫性变体Cry3序列)的至少约30%、至少约50%、至少约70%、 80^^90^^95%或更高的杀虫活性。在一个实施方案中，杀虫活性是杀鞘翅目活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomo 1. 83 2480-2485 ；Andrews ^ 人(1988)Biochem. J. 252:199-206 ；Marrone ^ 人(1985)J. of Economic Entomology78 :290-293 ；和美国专利号5，743，477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段(其编码本发明蛋白质的生物学活性部分) 将编码至少约 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450 个连续氨基酸，或者直至本发明的全长杀虫蛋白中存在的氨基酸总数。在一些实施方案中，该片段是蛋白酶解切割片段。例如，该蛋白酶解切割片段可以相对于SEQ ID NO :2具有至少约100个氨基酸、约120个、约130个、约140个、约150个或约160个氨基酸的N端截短。在多种实施方案中，该蛋白酶解切割片段可以对应于分别与SEQ ID NO :2的氨基酸位置158-159或位置160-161相对应的天然胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶切割位点，或可以对应于任意人工插入的切割位点，如 Walters 等人，2008，Applied and Environ. Micro. 74 :367-374 中所述的组织蛋白酶G切割位点。本发明的优选杀虫蛋白由与本文所包括的变体Cry3序列充分相同的核苷酸序列编码。“充分相同”意指使用标准参数，使用本文中所述的比对程序之一，与参考序列(例如，天然或变体Cry3序列，包括天然或变体Cry3A、Cry3B或Cry3C序列，或者选自SEQ ID NO :2、6、8、10、13、15、17、19和21-43的序列，或者编码这些天然或变体Cry3蛋白序列任一者的核苷酸序列)相比，具有至少约60 %或65 %序列同一性、约70 %或75 %序列同一性、 约 80%或 85%序列同一性、约 90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%^； 更多序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将会认识到通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、可读框定位等，可以适当调整这些值以确定两个核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，所述序列为最佳比较目的进行比对。这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置数的函数(即，同一性百分数=相同位置数/总位置数(例如，重叠位置)x 100)。在一个实施方案中，这两个序列具有相同的长度。在另一个实施方案中，贯穿整个参考序列(即，本文中所包括的变体
9Cry3序列)计算同一性百分数。可以使用与下文所述那些技术相似的技术，在容许或不容许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分数。在计算同一性百分数中，一般计数精确匹配。使用数学算法，可以完成两个序列之间同一性百分数的确定。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul, (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 2264 的算法，该算法如 Karlin 和 Altschul, (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 5873-5877中那样修改。这种算法被并入Altschul等人，(1990) J. Mol. Biol. 215 :403的 BLASTN和BLASTX程序。BLAST核苷酸搜索可以在采用BLASTN程序，评分=100、字长度= 12的情况下执行以获得与本发明的杀虫样核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以在采用BLASTX程序，评分=5，字长度=3的情况下执行以获得与本发明的杀虫蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得用于比较目的空位比对结果，空位BLAST(在BLAST 2.0 中)可以如Altschul等人，(1997)Nucleic Acids Res. 25 :3389中所述那样使用。备选地，PSI-Blast可以用来执行迭代搜索，其检测分子之间远缘关系。见上文Altschul等人， (1997)。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用相应程序(例如，BLASTX 和BLASTN)的默认参数。比对可以通过目测法手工地进行。用来比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等人 (1994) Nucleic acids Res. 22 :4673-4680)。ClustalW 比较序列和比对氨基酸或 DNA 序列的完整性，并且因而可以提供关于完整氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在一些市售DNA/氨基酸分析软件包中使用，如Vector NTI软件包的ALIGNX模块Qnvitrogen Corporation,Carlsbad,CA)。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸同一性百分数。用于分析ClustalW比对结果的软件程序的非限制实例是GENED0C 。GENED0C (Karl Nicholas)允许评估多种蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用来比较序列的数学算法的另一个非限制性实例是是Myers和Miller，(1988) CABIOS 4 :11-17的算法。 此种算法被并入了 ALIGN程序(版本2.0)，所述的ALIGN程序是GCG Wisconsin Genetics 软件包，第 10 版(从 Accelrys，Inc. ,9685 Scranton Rd.，San Diego, CA, USA 可获得)的一部分。当使用ALIGN程序以比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。除非另外说明，使用 Needleman 和 Wunsch 算法(1970) J. Mol. Biol. 48(3) 443-453的GAP第10版将会用来确定序列同一性或相似性，使用以下参数对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，使用GAP权重50和长度权重3及nwsgapdna. cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性或％相似性，使用GAP权重8和长度权重2及BL0SUM62评分程序。 也可以使用等同程序。“等同程序”意指任何序列比较程序，其中对于所讨论的任意两个序列而言，与GAP第10版所产生的相应比对结果比较时，所述的序列比较程序产生具有相同核苷酸或残基匹配和相同序列同一性百分数的比对结果。本发明也包括变体核酸分子。编码杀虫性变体Cry3蛋白的核苷酸序列的“变体” 包括编码本文公开的变体杀虫蛋白，但是因为遗传密码简并性而保守地相异的那些序列， 以及如上文所讨论那样充分相同的那些序列。变体核苷酸序列也包括合成方式衍生的核苷酸序列，所述核苷酸序列例如通过使用位点定向诱变法产生，但如下文所讨论仍编码本发明中所公开的杀虫蛋白。由本发明包括的变体蛋白是有生物活性的，即，它们继续拥有
10参考蛋白(即，本文中所包括的变体Cry3序列)的想要的生物学活性，即，杀虫活性。“保留活性”意指该变体将具有该参考蛋白的至少约30%、至少约50%、至少约70%或至少约 80%的杀虫活性。在一些实施方案中，本文中所述的变体杀虫蛋白相对于SEQ ID N0:2中所述的AXMI-Rl蛋白显示改善的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla 禾口 Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人(1985) J. of Economic Entomology78 :290-293 ；和美国专利号5，743，477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。技术人员将会进一步理解，可以通过突变本发明的核苷酸序列引入变化，从而导致编码的杀虫蛋白的氨基酸序列变化，而不改变该蛋白质的生物学活性。因而，分离的变体核酸分子可以通过将一个或多个核苷酸替换、添加或缺失导入本文公开的相应核苷酸序列来产生，从而将一个或多个氨基酸替换、添加或缺失导入所编码蛋白质的靶突变区域中。突变可以通过标准技术如位点定向诱变法和PCR介导诱变法导入。此类变体核苷酸序列也由本发明包括。例如，可以在一个或多个预测的、非必需氨基酸残基处产生保守性氨基酸替换。 “非必需”氨基酸残基是可以从杀虫蛋白的参考序列改变，但是不实质地改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基为生物学活性所需要的。“保守性氨基酸替换”是其中氨基酸残基以具有相似侧链的氨基酸残基替换的替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、 天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β -分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。Δ-内毒素通常具有5个保守的序列结构域和3个保守的结构性结构域(见，例如，de Maagd等人.Q001)Trends Genetics 17:193-199)。第一个保守的结构性结构域由7个α螺旋组成并且参与膜插入和孔形成。结构域II由以希腊钥匙构型排列的3个 β-片层组成，并且结构域III由“薄卷饼型”形式的2个反平行β-片层组成(de Maagd 等人，2001，上文)。结构域II和III参与受体识别和结合，并且因此被视为毒素特异性的决定因素。可以在保留功能的非保守区域做出氨基酸替换。通常，不对保守氨基酸残基或不对位于保守基序内部的氨基酸残基做出此类替换，其中此类残基对蛋白质活性是必需的。 保守并且可能对蛋白质活性是必需的残基的实例包括例如，在相似或相关毒素与本发明序列的比对结果中所含的全部蛋白质之间相同的残基(例如，在同源蛋白的比对结果中相同的残基)。保守并且可以允许保守性氨基酸替换并仍保持活性的残基的实例例如包括，在相似或相关毒素与本发明序列的比对结果中所含的全部蛋白质之间仅具有保守性替换的残基(例如，在同源蛋白比对结果中所含的全部蛋白质之间仅具有保守性替换的残基)。然而，本领域技术人员将会理解，功能性变体可以在保守残基中具有少量保守或非保守的改变。备选地，变体核苷酸序列可以通过沿着全部或部分的靶突变区域随机导入突变(如通过排列或饱和诱变法)产生，并且可以对得到的突变体筛选赋予杀虫活性的能力以鉴定保留活性或显示改善的活性的突变体。诱变后，可以重组地表达编码的蛋白质，并且可以使用标准测定法技术测定该蛋白质的活性。使用如PCR、杂交等方法，可以鉴定相应的杀虫序列，此类序列与本发明的序列具有实质同一'性。见，例如，Sambrook 禾口 Russell (2001)Molecular Cloning :A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY),禾口 Innis 等人(1990)PCR Protocols :A Guide to Methods and Applications(Academic Press,NY)。在杂交方法中，全部或部分的杀虫性核苷酸序列可以用来筛选cDNA或基因组文库。用于构建cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的并且在上文Sambrook等人， 2001中公开。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其他寡核苷酸，并且可以用可检测基团如32p或任何其他可检测性标记物(如其他放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)标记。可以通过标记基于本文中公开的已知的编码杀虫蛋白的核苷酸序列的合成寡核苷酸产生用于杂交的探针。可以额外地使用基于核苷酸序列或编码的氨基酸序列中保守的核苷酸或氨基酸残基设计简并引物。探针一般包含核苷酸序列的区域，所述的区域在严格条件下与编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列或其片段或变体的至少约12个、至少约25个、至少约50个、75个、100个、125个、150个、175个或200个连续核苷酸杂交。用于制备杂交用探针的方法通常是本领域已知的并且在通过引用方式并入本文的上文Sambrook等人，2001中公开。例如，本文中公开的完整杀虫蛋白序列或其一个或多个部分可以作为能够与相应的杀虫蛋白样序列和信使RNA特异性杂交的探针使用。为在多种条件下实现特异性杂交，此类探针包括下述序列，所述序列是独特的并且优选地具有至少约10个核苷酸长度或至少约20个核苷酸长度。此类探针可以用来通过PCR从所选的生物扩增相应的杀虫性序列。该项技术可以用来从想要的生物中分离额外的编码序列或作为诊断性测定法用来确定生物中编码序列的存在。杂交技术包括铺板DNA文库的杂交筛选法(蚀斑或菌落；见，例如，Sambrook 等人(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual，2 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)0此类序列的杂交可以在严格性条件下实施。“严格条件”或“严格杂交条件”意指这样的条件，在所述条件下探针将会与其靶序列杂交至比其与其他序列杂交可检测性更大的程度(例如，高于背景至少2倍)。严格条件具有序列依赖性并且会在不同的环境中不同。 通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定与探针100%互补的靶序列(同源性探测)。备选地，可以调节严格性条件以允许序列中的一些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。通常，探针是小于约1000个核苷酸长度，优选地小于500个核苷酸长度。一般而言，严格性条件将会是这些条件，其中盐浓度在pH 7. O至8. 3上小于约 1. 5M Na离子，一般约0. 01至1. OM Na离子浓度(或其他盐)并且对于短探针(例如10至 50个核苷酸)，温度是至少约30°C，并且对于长探针(例如多于50个核苷酸)，是至少约 60°C。也可以通过添加去稳定剂如甲酰胺实现严格条件。示例性低严格性条件包括在37°C 用30至35%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液杂交，并且在50至 55°C于IX至2XSSC(20X SSC = 3. OM NaCl/0. 3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性中等严格性条件包括在37°C于40至45%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS中杂交，并且在55至60°C于0. 5X
12至IXSC中洗涤。示例性高严格性条件包括在37°C于50%甲酰胺，IM NaCl, 1% SDS中杂交， 并且在60至65°C于0. IXSSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0. 至约SDS0 杂交的持续时间一般是小于约M小时，通常约4至约12小时。特异性一般是杂交后洗涤的函数，关键因素是终末洗涤溶液的离子强度和温度。 对于 DNA-DNA 杂合体，Tm 可以从 Meinkoth 和 Wahl (1984) Anal. Biochem. 138 :267-284 的等式=Tm = 81. 50C +16. 6 (log Μ) +0. 41(% GC) -0. 61(% form)-500/L 近似；其中 M 是单价阳离子的摩尔浓度，％ GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分数，％ form是杂交溶液中甲酰胺的百分数，并且L是该杂合体的长度(碱基对)。Tm是50%互补性靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在确定的离子强度和PH下)。Tm因每错配下降约1°C;因此，可以调节Tm、杂交和/或洗涤条件以杂交至具有想要的同一性的序列。例如，如果寻求具有 ^ 90%同一性的序列，则1可以降低10°C。通常，选择严格性条件比在确定的离子强度和 PH下特定序列及其互补序列的解链温度低约5°C。然而，极严格性条件可以利用比解链温度(Tm)低1、2、3或4°C的杂交和/或洗涤；中等严格性条件可以利用比解链温度(Tm)低 6、7、8、9或10°C的杂交和/或洗涤；低严格性条件可以利用比解链温度(Tm)低11、12、13、 14、15或20°C的杂交和/或洗涤。使用该等式、杂交与洗涤组合物和想要的Tm，普通技术人员将会理解杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化被内在地描述。如果想要的错配程度产生小于45°C (水溶液)或32°C (甲酰胺溶液)的Tm，则优选增加SSC浓度，从而可以使用更 1 白勺￠: Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, I 部分，第 2 章(Elsevier, New York)；禾口 Ausubel 等人编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology, % 2 章(Greene Publishing 禾口 Wiley-Interscience, New York)。见 Sambrook 等人(1989) Molecular Cloning :A Laboratory Manual(2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)中存在对核酸杂交的广泛指导。分离的蛋白质及其变体和片段杀虫蛋白也包括在本发明内。“杀虫蛋白”意指本文中所包括的杀虫性变体Cry3 序列。也提供其片段、生物学活性部分和变体，并且可以用来实施本发明的方法。“分离的蛋白质”或“重组蛋白”用来指不再处于其天然环境(例如在体外或处于重组细菌或植物宿主细胞)中的蛋白质。“片段”或“生物学活性部分”包括本文中所包括变体Cry3序列并且显示杀虫活性的多肽片段。杀虫蛋白的生物学活性部分可以是例如10、25、50、100、150、200、250个或更多氨基酸长度的多肽。此类生物学活性部分可以通过重组技术制备并评价杀虫活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人 (1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ；和美国专利号 5，743，477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。如此处所用，片段包含参考蛋白的至少8个连续氨基酸。 然而，本发明包括其他片段，如蛋白质中多于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、 400、450、500、550、600、650个或更多个氨基酸的任意片段。“变体”意指具有与SEQ ID NO 2的氨基酸序列至少约60%、65%、约70%、75%、 约 80%、85%、约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体也包括由下述核酸分子编码的多肽，其中所述核酸分子在严格条件下与编码本文中所包括的变体Cry3序列的核酸分子或其互补序列杂交。变体包括因诱变而在氨基酸序列上相异的多肽。由本发明包括的变体蛋白质是有生物活性的，即它们继续拥有变体Cry3蛋白的想要的生物学活性，即保留杀虫活性。在一些实施方案中，该变体相对于参考蛋白(例如，相对于SEQ ID N0:2或相对于特定的变体Cry3蛋白)具有改善的活性。用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。见，例如，Czapla和Lang(1990) J. Econ.Entomol. 83 :2480-2485 ；Andrews 等人(1988)Biochem. J. 252 :199-206 ；Marrone 等人(1985) J. of Economic Entomology 78 :290-293 ；和美国专利号 5，743，477，所述全部文献均通过引用方式完整地并入本文。细菌基因，如本发明的axmi基因，相当经常地拥有靠近可读框起点的多个甲硫氨酸起始密码子。常常，在这些起始密码子中一个或多个密码子处的翻译起始将会导致功能性蛋白质的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌(如芽孢杆菌属物种) 也将密码子GTG识别为起始密码，并且在GTG密码子处启动翻译的蛋白质含有在第一氨基酸处的甲硫氨酸。在罕见情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，然而在这种情况下TTG编码甲硫氨酸。另外，常常不先验地确定在细菌中天然地使用这些密码子中的哪些。因而，可以理解备选甲硫氨酸密码子之一的使用可以也导致杀虫蛋白的产生。这些杀虫蛋白包含于本发明中并且可以在本发明的方法中使用。将会理解在植物中表达时，需要更改备选起始密码子至ATG以正确翻译。本发明也包括针对本发明多肽或针对其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域熟知的(见，例如，Harlow 禾口 Lane(1988) Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；美国专利号 4, 196, 265)。改变或改善的变体认识到可以通过多种方法进一步改变杀虫蛋白的DNA序列，并且这些改变可以产生编码蛋白质的DNA序列，其中所述的蛋白质具有与本发明杀虫蛋白所编码的氨基酸序列不同的氨基酸序列。这个蛋白质可以以多种方式改变，所述方式包括本文中所包括的变体 Cry3序列的一个或多个氨基酸的氨基酸替换、缺失、截短和插入，包括在一个或多个靶突变区域内多达约2个、约3个、约4个、约5个、约6个、约7个、约8个、约9个、约10个、约15 个、约20个、约25个、约30个、约35个、约40个、约45个、约50个、约55个、约60个、约 65个、约70个、约75个、约80个、约85个、约90个、约100个、约105个、约110个、约115 个、约120个、约125个、约130个、约135个、约140个、约145个、约150个、约155个或更多个氨基酸替换、缺失或插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，可以通过在DNA中突变来制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这也可以通过几种形式的诱变法之一和 /或在定向进化中完成。在一些方面中，氨基酸序列中所编码的变化将不会实质地影响蛋白质的功能。此类变体会拥有想要(或改善)的杀虫活性。然而，可以理解，杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力可以将此类技术用于本发明的组合物而得到改善。例如，可以在DNA复制期间显示高碱基错误掺入率的宿主细胞如XL-IRed(Mratagene，La Jolla, CA)中表达杀虫蛋白。在此类菌株中增殖后，可以分离DNA(例如通过制备质粒DNA或通过PCR扩增并将所得的PCR片段克隆至载体中)，在非诱变性菌株中培养杀虫蛋白突变体，并且鉴定具有杀虫活性的突变基因，例如通过开展检测杀虫活性的测定法。一般而言，将所述蛋白质混合并用于饲喂测定法中。见,例如 Marrone 等人(1985) J. of Economic Entomology 78:290-293。 此类测定法可以包括使植物与一种或多种害虫接触并测定植物存活和/或造成害虫死亡的能力。导致毒性增加的突变的实例Ikhnepf等人(1998)Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 775-806。备选地，可以在氨基或羧基端对许多蛋白质的蛋白质序列做出改变，而不明显影响活性。这可以包括通过现代分子方法(如PCR)导入的插入、缺失或改变，所述的PCR包括通过在PCR扩增中所用的寡核苷酸中包括氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增。备选地，添加的蛋白质序列可以包括完整的蛋白质编码序列，如本领域常见用来产生蛋白质融合物的那些序列。此类融合蛋白常常用来(1)增加目的蛋白的表达， (2)导入结合结构域、酶活性或表位以促进蛋白质纯化、蛋白质检测或本领域已知的其他实验用途，(3)将蛋白质定向分泌或翻译至亚细胞细胞器，如革兰阴性细菌的周质空间或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白质的糖基化。本发明的变体核苷酸和氨基酸序列也包括从诱变性和重组生产方法如DNA改组法衍生的序列。采用这种方法，一种或多种不同的杀虫蛋白编码区可以用来产生拥有想要的特性的新杀虫蛋白。以这种方式，从包含具有实质序列同一性并且可以在体外或体内同源重组的序列区的相关序列多核苷酸群中产生重组多核苷酸的文库。例如，使用这种方法，可以在本发明的杀虫性基因和其他已知的杀虫性基因之间改组编码目的结构域的序列基序以获得编码蛋白质的新基因，其中所述蛋白质具有改善的目的特性，如增加的杀昆虫活性。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。见，例如Stemmer (1994) Natl. Acad. Sci. USA 91 :10747-10751 ；Stemmer (1994) Nature 370 :389-391 ；Crameri 等人 (1997) Nature Biotech. 15 :436-438 ；Moore 等人(1997) J. Mol. Biol. 272 :336-347 ；Zhang 等人(1997)Proc. Natl. Acad. ki. USA 94 :4504-4509 ；Crameri 等人(1998) Nature391 288-291 ；和美国专利号 5，605，793 和 5，837，458。结构域互换或改组是用于产生改变的杀虫蛋白的另一种机制。结构域可以在杀虫蛋白之间互换，从而产生具有改善的杀虫活性或靶谱的杂合或嵌合毒素。用于产生重组蛋白和测试其杀虫活性的方法是本领域熟知的(见，例如，Naimov等人Q001)Appl. Environ. Microbiol. 67 :5328-5330 ；de Maagd 等人(1996)Appl. Environ. Microbiol. 62 1537-1543 ；Ge 等人(1991) J. Biol. Chem. 266 :17954-17958 ；Schn印f 等人(1990) J. Biol. Chem. 265 :20923-20930 ；Rang 等人 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65 :2918-2925)。可以在用于目的植物中表达的表达盒中提供本发明的杀虫序列。“植物表达盒”意指能够在植物细胞中导致蛋白质从可读框中表达的DNA构建体。一般，这些植物表达盒含有启动子和编码序列。常常地，此类构建体也会含有3'非翻译区。此类构建体可以含有促进该肽共翻译或翻译后运输至某些胞内结构如叶绿体(或其他质体)、内质网或高尔基体的“信号序列”或“前导序列”。“信号序列”意指已知或怀疑导致跨细胞膜共翻译或翻译后肽运输的序列。在真核生物中，这一般涉及分泌至高尔基体中，伴有一定所得的糖基化。细菌的杀昆虫性毒素常常合成为前毒素，所述前毒素在靶害虫的肠中蛋白酶解地活化(Chang(1987)Methods Enzymo 1. 153 :507-516)。在本发明的一些实施方案中，信号序列位于天然序列中或可以从
15本发明的序列衍生。“前导序列”意指任意序列，其中所述的序列在翻译时产生足以触发肽链共翻译性运输至亚细胞细胞器的氨基酸序列。因而，这包括通过进入内质网中、进抵至液泡、质体(包括叶绿体)、线粒体等的前导序列靶向运输和/或糖基化。“植物转化载体”意指为高效转化植物细胞必需的DNA分子。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并且可以组织成多于一个“载体"DNA分子。例如，双元载体是使用两个非连续DNA载体来编码用于转化植物细胞的全部必要顺式和反式作用功能的植物转化载体(Hellens 和 MullineauxQOOO) Trends in Plant Science 5:446-451)。“载体，，指设计用于不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”指具有在外来细胞中掺入、整合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。该盒将会包括与本发明序列有效连接的5' 和3'调节序列。“有效连接”意指启动子与第二序列之间的功能性连接，其中所述启动子序列启动并且介导与第二序列相对应的DNA序列的转录。通常，有效连接意指连接的核酸序列是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区的情况下，是连续且处于相同的可读框中。 该表达盒可以额外地含有至少一个待共转化入生物的额外基因。备选地，可以在多个表达盒上提供额外的基因。“启动子”指发挥指导下游编码序列转录的功能的核酸序列。启动子，连同其他转录性和翻译性调节核酸序列(又称作“调控序列”)，对于目的DNA序列的表达是必需的。这种表达盒提供有用于插入处在调节区转录性调控下的杀虫性序列的多个限制性位点。所述表达盒将会在5’ -3’转录方向包含在植物中有功能的转录与翻译起始区 (即，启动子)、本发明的DNA序列和转录与翻译终止区(即，终止区)。启动子可以是天然的或类似的，或对植物宿主和/或对本发明的DNA序列是外来或异源的。另外，启动子可以是天然序列或备选地是合成性序列。在启动子相对于植物宿主是“天然”或“同源”的情况下，意指该启动子存在于导入该启动子的天然植物中。在启动子相对于本发明的DNA序列是“外来”或“异源”的情况下，意指该启动子对于有效连接的本发明DNA序列而言不是天然的或天然存在的启动子。终止区可以相对于转录起始区是原有的，可以相对于有效连接的目的DNA序列是原有的，可以相对于植物宿主是原有的，或可以来自另一来源(即，相对于启动子、目的DNA序列、植物宿主或其任意组合是外来或异源的)。方便的终止区是从根瘤农杆菌 (A. tumefaciens)的Ti质粒可得到的，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。也见Guerineau 等人(1991)Mol.Gen. Genet. 262 :141-144 ；Proudfoot(1991)Cell 64 :671-674 ；Sanfacon 等人(1991)Genes Dev. 5 :141-149 ；Mogen 等人(1990)Plant Cell 2 :1261-1272 ；Munroe 等人(1990)Gene 91 :151-158 ；Ballas 等人(1989)Nucleic Acids Res. 17 :7891-7903 ；禾口 Joshi 等人(1987)Nucleic Acid Res. 15 :9627_9639。根据需要，基因可以为转化的宿主细胞中增加的表达进行优化。即，基因可以为改善的表达而使用宿主细胞优选的密码子合成，或可以按宿主细胞优选的密码子选择频率使用密码子进行合成。通常，基因的GC含量将会增加。见，例如，Campbell和Gowri (1990) Plant Physiol. 92 :1-11对宿主优选密码子选择的讨论。用于合成植物优选基因的方法是本领域可获得的。见，例如，通过引用的方式并入本文的美国专利号5，380，831和 5，436，391 以及 Murray 等人，1989，Nucleic Acids Res. 17 :477_498。
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在一个实施方案中，将杀虫蛋白靶向叶绿体用于表达。以这种方式，在不直接将杀虫蛋白插入叶绿体的情况下，表达盒将会额外地含有核酸，所述核酸编码引导杀虫蛋白至叶绿体的转运肽。此类转运肽是本领域已知的。见，例如，Von Heijne等人(1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9 :104-126 ；Clark ^ 人(1989)J. Biol. Chem. 264 :17544-17550 ； Della-Cioppa 等人(1987)Plant Physiol. 84 :965-968 ；Romer ^ 人(1993)Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 :1414-1421 ；和 Shah 等人(1986) Science 233 :478-481。待靶向至叶绿体的杀虫基因可以为叶绿体中的表达进行优化以引起植物细胞核和这种细胞器之间密码子选择的差异。以这种方式，目的核酸可以使用叶绿体优选的密码子合成。见，例如，通过引用方式并入本文的美国专利号5，380，831。棺物转化本发明的方法涉及导入核苷酸构建体至植物中。术语“导入”意指如此方式向植物呈递核苷酸构建体，从而该构建体进入该植物的细胞的内部。本发明的方法不要求使用用于导入核苷酸构建体至植物的特定方法，只要该核苷酸构建体进入植物的至少一个细胞的内部即可。用于导入核苷酸构建体至植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的方法。“植物”意指完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织指已经使外源核酸序列或DNA片段掺入或整合入植物细胞中的植物。这些核酸序列包括为外源或在未转化的植物细胞中不存在的那些核酸序列以及可以为内源或在未转化的植物细胞中存在的那些核酸序列。“异源”通常指这些核酸序列，所述核酸序列相对于它们存在其中的细胞或天然基因组的部分而言不为内源并且已经通过感染、转染、显微注射法、电穿孔法、微量投射法添加至细胞。本发明的转基因植物表达本文中公开的一种或多种变体Cry3序列。在多种实施方案中，转基因植物还包含一个或多个用于昆虫抵抗性的额外基因，例如，一个或多个用于控制鞘翅目害虫的额外基因(例如，CryljB Cry 1A、CrylB, CrylC, CrylD, CrylE和CrylF 家族的成员；Cry2，如 Cry2A 家族的成员；Cry9,如 Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E 和 Cry9F家族的成员；Cry34/35 ；VIP，如VIP3 ；或本领域已知针对鞘翅目害虫具有毒性的任何修饰的Cry3A或CryIBB序列。本领域技术人员将会理解该转基因植物可以包含赋予目的农学性状的任意基因。植物细胞的转化可以通过本领域已知的几项技术之一完成。可以修饰本发明的杀虫基因以获得或增强在植物细胞中的表达。一般，表达这种蛋白质的构建体会含有驱动该基因转录的启动子以及允许转录终止和多腺苷酸化的3'非翻译区。此类构建体的组织是本领域熟知的。在一些情况下，可能有用的是使该基因工程化，从而所得的肽被分泌，或靶向在植物细胞内部。例如，该基因可以工程化以含有促进肽转移至内质网的信号肽。也可以优选使植物表达盒工程化以含有内含子，从而要求内含子的mRNA加工用于表达。一般，这种“植物表达盒”将会插入“植物转化载体”中。该植物转化载体可以由实现植物转化所需要的一个或多个DNA载体组成。例如，本领域中的常规实践是使用由多于一个连续DNA区段组成的植物转化载体。这些载体常常在本领域中称作“双元载体”。双元载体以及带有辅助质粒的载体最经常地用于农杆菌介导的转化，其中为实现有效转化所需要的DNA区段的大小和复杂度是相当大的，并且有利的是将多项功能分离至单独的DNA分子上。双元载体一般含有这样的质粒载体，其含有为T-DNA转移所需的顺式作用序列(如左边界和右边界)、被工程化以能够在植物细胞中表达的选择标记和“目的基因”(被工程化以能够在对于产生转基因植物所需要的植物细胞中表达的基因)。这种质粒载体上也存在为细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以允许有效转移至植物细胞并且在其中表达的的方式排列。例如，选择标记基因和杀虫基因位于左边界与右边界之间。第二种质粒载体常常含有介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞的反式作用因子。如本领域理解，这种质粒常常含有允许农杆菌感染植物细胞和通过在边界序列处切割来转移DNA和vir-介导的DNA 转移的毒力功能(Vir 基因)(Hellens 和 MullineauxQOOO) Trends in Plant Science 5 446-451)。一些类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOl、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法如微量投射法、显微注射法、电穿孔法、聚乙二醇法等转化植物不是必需的。通常，植物转化方法涉及转移异源DNA至靶植物细胞中(例如不成熟或成熟的胚、 悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，随后施加最大阈水平的适宜选择(取决于选择标记基因)以从未转化细胞物质的群体中回收转化的植物细胞。外植体一般转移至相同培养基的新鲜补给物并例行地培养。随后，在补充有最大阈水平选择剂的再生培养基上放置后，转化的细胞分化成苗。苗随后转移至选择性生根培养基用于回收生根的苗或小植物。转基因小植物随后生长成成熟的植物并且产生能育性种子(例如Hiei等人(1994) The Plant Journal 6 :271-282 ;Ishida 等人(1996)Nature Biotechnology 14:745—750)。夕卜植体一般转移至相同培养基的新鲜补给物并例行地培养。对用于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见 Ayres 禾口 Park (1994) Critical Critical Reviews in Plant Science 13 :219-239 和 Bommineni 和 Jauhar (1997)Maydica 42 :107_120。由于转化的材料含有许多细胞；转化的和未转化的细胞均存在任意一块的经处理的靶愈伤组织或组织或细胞群体中。杀死未转化的细胞并且允许转化的细胞增殖的能力产生转化的植物培养物。除去未转化细胞的能力常常是快速回收转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制条件。转化方案以及用于导入核苷酸序列至植物中的方案可以根据为转化所靶向的植物或植物细胞的类型即单子叶植物或双子叶植物而变化。可以通过几种方法之一进行转基因植物的产生，所述的方法包括，但不限于显微注射法、电穿孔法、直接基因转移法、通过农杆菌导入异源DNA至植物细胞中(农杆菌介导的转化法)、用粘附至粒子的异源外来DNA轰击植物细胞、射弹粒子加速法、气溶胶束转化法(美国公开申请号20010(^6941 ；美国专利号4，945，050 ；国际
发明者V·海因里希斯 申请人:阿森尼克斯公司