Axmi115变体灭虫基因及其使用方法
【专利摘要】提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀虫活性的组合物和方法。毒素编码序列可以用于DNA构建体或表达盒中以在植物和细菌中表达。组合物还包括转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。具体地，提供了多聚核苷酸序列以及由此所编码的毒素蛋白。还提供了与那些氨基酸序列特异性结合的抗体。具体地，本发明包括编码融合蛋白的核苷酸序列及其生物学活性变体和片段，其中所述融合蛋白含有SEQ?ID?NO:43的C末端部分。融合蛋白还可以含有SEQ?ID?NO:45的N末端部分。本发明还包括SEQ?ID?NO:47和1-14的核苷酸序列，或编码SEQ?ID?NO:48和15-31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物学活性变体和片段。
【专利说明】AXM1115变体灭虫基因及其使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年4月5日提交的美国第61/471848号临时申请的优先权，其内容作为整体通过引用并入本文。
[0003]电子提交的序列表的引用
[0004]序列表的官方文本以ASCII格式通过EFS-Web电子提交，其文件名称为“2916693-093977-SEQLIST.txt”，创建于2012年4月2日，大小为241千比特，并且与说明书同时提交。该ASCII格式的文件含有的序列表是说明书的一部分，并且作为整体通过引用并入本文。
发明领域
[0005]本发明涉及分子生物学领域。提供了编码杀虫(pesticidal)蛋白的新基因。这些蛋白和编码它们的核酸序列可以用于制备杀虫制剂以及生产抗害虫转基因植物。
[0006]发明背景
[0007]苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensi)是革兰氏阳性产孢子土壤细菌,其特征在于能够产生针对某些昆虫目和种具有特异性毒性，但是对植物和其它非靶标有机体却无害的晶状包涵体。由此，包含苏云金芽孢杆菌菌株或其灭虫(insecticidal)蛋白的组合物可用作环境可接受的灭 虫剂，以控制农业害虫或引起多种人或动物疾病的昆虫媒介。
[0008]来自于苏云金芽孢杆菌的晶体(Cry)蛋白(δ-内毒素)具有主要针对鳞翅目(Lepidopteran)、半翅目(Hemipteran)、双翅目(Dipteran)和鞘翅目(Coleopteran)幼虫的强效灭虫活性。这些蛋白还显示出针对膜翅目(Hymenoptera)、同翅目(Homoptera)、風毛目(Phthiraptera)、食毛目(Mallophaga)和蝶螨目(Acari)害虫以及其它无脊椎动物(例如线形动物门(Nemathelminthes)>扁形动物门(Platyhelminthes)和Sarcomastigorphora 的活性(Feitelson(1993)The Bacillus Thuringiensis familytree.1n Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York，N.Y.)0 该晶体蛋白直到被摄取并且溶解于昆虫中肠内才表现出灭虫活性。摄取的原毒素在昆虫消化道中被蛋白酶水解成具有活性的毒素分子(H0fte and Whiteley (1989)Microbiol.Rev.53:242-255)。该毒素在靶标幼虫的中肠内结合到顶端刷状缘受体上，并插入到顶膜中，产生离子通道或孔道，从而导致幼虫死亡。
[0009]除了内毒素之外，苏云金芽孢杆菌在其营养生长期还产生分泌的灭虫蛋白，即营养期杀虫蛋白(Vip)。自从发现第一种Vip毒素以来，在苏云金芽孢杆菌中已经鉴定出了两个主要类型的Vip毒素。一类Vip毒素由毒素双体组成，所述毒素双体由两种组分Vipl和 Vip2 构成(Warren (1997) In N.B.Carozzi and M.G.Koziel (ed.), Advances in insectcontrol: the role of transgenic plants.Taylor&Francis, London, United Kingdom)。Vipl和Vip2的组合对农业上重要的昆虫西部玉米根虫(Diabrotica virgifera)具有高度的灭虫活性，但是对任何鳞翅目昆虫却未表现出任何杀虫活性(Han et al.(1999) Nat.Struct.Biol.6:932-936)。另一类由Vip3毒素组成，其与Vipl或Vip2没有序列相似性。首个被鉴定的Vip3毒素Vip3Aal对玉米和棉花的几种主要鳞翅目害虫，包括秋天行军虫草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)和棉铃虫谷实夜蛾(Helicoverpa zea),具有高度的灭虫活性，但对玉米的一种主要害虫欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)却未显示出活性(Estruchet al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA93:5389-5394)。从苏云金芽抱杆菌菌株中删除vip3Aal基因导致该苏云金芽孢杆菌菌株的灭虫活性显著降低，表明Vip3贡献了苏云金芽抱杆菌菌株总体毒性(Donovan et al.(2001) J.1nvertebr.Pathol.78:45-51 )。还观察到Vip3Aal 通过形成细胞膜孔(Lee et al.(2003) Appl.Environ.Microbiol.69:4648-4657)使昆虫中肠细胞裂解(Yu et al.(1997)Appl.Environ.Microbiol.63:532-536)而杀死昆虫。
[0010]基于苏云金芽孢杆菌的灭虫剂的集中使用已经使小菜蛾(Plutella xylostella)的田间种群的抗性增强(Ferr6and Van Rie (2002) Annu.Rev.Entomol.47:501-533)。最常见的抗性机制是毒素与其特异性中肠受体的结合减少。这可能也会赋予对共用相同受体的其它毒素的交叉抗性(Ferr6and Van Rie (2002) )0
[0011]发明概述
[0012]提供了赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子杀虫活性的组合物和方法。组合物包含编码杀虫和灭虫多肽序列的核酸分子、含有该些核酸分子的载体，以及含有该些载体的宿主细胞。组合物还包含杀虫多肽序列和该些多肽的抗体。核苷酸序列可用于DNA构建体和表达盒中，以进行转化和在有机体(包括微生物和植物)中表达。核苷酸或氨基酸序列可以是已经设计用于在有机体(包括但不限于微生物或植物)中表达的合成序列。组合物还包含含有本发明核苷酸序列的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。 [0013]具体地，提供了编码杀虫蛋白的分离的核酸分子。此外，还包括对应于杀虫蛋白的氨基酸序列。具体地，本发明提供了包含编码融合蛋白的核苷酸序列的分离或重组的核酸分子及其生物学活性变体和片段，其中所述融合蛋白包含SEQ ID N0:43的C末端部分。在多个实施方案式中，融合蛋白包含SEQ ID N0:45的N末端部分。在特定的实施方案中，本发明所包括的核酸分子(包括含有核酸分子的载体、宿主细胞、植物和种子)包括SEQ IDN0:47和1-14中所示的核苷酸序列，或编码SEQ ID N0:48和15-31中所示氨基酸序列的核苷酸序列，包括其生物学活性变体和片段。还包括与本发明核苷酸序列互补的，或与本发明序列或其互补序列相杂交的核苷酸序列。本文中还包括由本发明核酸分子编码的分离或重组的融合蛋白。
[0014]提供了产生本发明的多肽的方法，以及利用那些多肽控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类(nematode)或双翅目害虫的方法。还包括用于检测样品中本发明核酸和多肽的方法和试剂盒。
[0015]本发明的组合物和方法有利于生产具有增强的抗虫性或耐虫性的有机体。这些有机体以及包含有机体的组合物期望用于农业。本发明的组合物还有利于生产具有杀虫活性的经改变或改良的蛋白，或者用于检测产品或有机体中杀虫蛋白或核酸的存在。
[0016]附图简述
[0017]图1显示融合构建体的图示
[0018]图2显示体外叶盘(leaf disk)生物测定的结果。pAG6585含有optAxmill5v01 (N= 14)，pAG6141 含有 optAxmill5v02.01.01 (N=8)。[0019]详细描述 [0020]本发明涉及用于调控有机体特别是植物或植物细胞中害虫抗性或耐受性的组合物和方法。“抗性”意指害虫(例如昆虫)在摄取或与本发明多肽进行其它接触之后被杀死。“耐受性”意指害虫的移动、采食、生殖或其它功能受损或减少。所述方法涉及用编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列转化有机体。具体地，本发明的核苷酸序列有利于制备具有杀虫活性的植物和微生物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物是芽孢杆菌或其它物种的杀虫核酸和蛋白。该序列可以用于构建随后转化到目标有机体中的表达载体、用作分离其它同源(或部分同源)基因的探针，以及用于通过本领域已知方法产生改变的杀虫蛋白，例如与Vipl、Vip2或Vip3毒素家族的成员发生结构域交换或DNA改组。该蛋白可以用于控制或杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目和线虫类害虫群体以及生产具有杀虫活性的组合物。
[0021]“杀虫毒素”或“杀虫蛋白”意指针对一种或多种害虫(包括但不限于鳞翅目、双翅目和鞘翅目或线虫动物门的成员)具有毒性活性的毒素，或与这种蛋白具有同源性的蛋白。已经从如下有机体中分离出了杀虫蛋白，包括例如芽孢杆菌属，双酶梭菌(Clostridiumbifermentans)和日本甲虫类芽抱杆菌(Paenibacillus popilliae)。杀虫蛋白包括由本文所公开的全长核苷酸序列推论得到的氨基酸序列，以及短于全长序列的氨基酸序列(其由于使用了位于下游的任意起始位点或者是由于产生具有杀虫活性的较短蛋白的加工过程所造成)。加工过程可发生在表达蛋白的有机体中，或摄食蛋白后的害虫中。
[0022]因此，本文提供了赋予杀虫活性的新的分离或重组核苷酸序列。这些核苷酸序列编码与已知毒素具有同源性的多肽。还提供了杀虫蛋白的氨基酸序列。此基因翻译得到的蛋白使得细胞能够控制或杀死摄食该蛋白的害虫。
[0023]分离的核酸分子及其变体和片段
[0024]本发明的一个方面涉及包含编码杀虫蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列的分离或重组的核酸分子，以及足以用作杂交探针的核酸分子，其以识别编码具有序列同源性区域的蛋白的核酸分子。本文还包括能够在本文中别处所定义的严格条件下与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。如本文所使用，术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例如，重组DNA、cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物所产生的DNA或RNA类似物。核酸分子可以是单链或双链，但优选是双链DNA。
[0025]本文所使用的“分离的”或“重组的”核酸序列(或DNA)是指不再处于其天然环境中，例如处于体外或者处于重组细菌或植物宿主细胞中的核酸序列(或DNA)。在一些实施方案中，分离或重组的核酸(优选蛋白编码序列)不含在该核酸所来源的有机体基因组DNA中天然位于该核酸侧翼的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。出于本发明的目的，当使用“分离的”描述核酸分子时不包括分离的染色体。例如，在多个实施方案中，编码S-内毒素的分离的核酸分子可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，其在该核酸所来源的细胞基因组DNA中天然位于该核酸分子侧翼。在多个实施方案中，基本上不含细胞物质的δ -内毒素蛋白包括具有少于约30%、20%、10%或5%(干重量)非S-内毒素蛋白(在本文中也被称为“污染蛋白”)的蛋白制剂。
[0026]编码本发明蛋白的核苷酸序列包括如SEQ ID NO:47和1_14所示的序列及其变体、片段和互补序列。“互补序列”意指与给定核苷酸序列充分互补以使其能与给定的核苷酸序列杂交从而形成稳定双链的核苷酸序列。由这些核苷酸序列所编码的杀虫蛋白的相应氛基酸序列如SEQ ID NO:48和15-31所不。
[0027]本发明还包括编码杀虫蛋白的这些核苷酸序列的片段的核酸分子。“片段”意指编码杀虫蛋白的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码杀虫蛋白的生物学活性部分，或者其可以是使用下面所公开的方法能够用作杂交探针或PCR引物的片段。根据预期的用途，编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少约50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400 个连续的核苷酸，或直至编码本文中所公开的杀虫蛋白的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数量。“连续的”核苷酸意指相互之间紧密相邻的核苷酸残基。本发明核苷酸序列的片段会编码保留杀虫蛋白生物学活性并且因此保留杀虫活性的蛋白片段。因此，还包括本文中所公开的多肽的生物学活性片段。“保留活性”意指片段会具有杀虫蛋白的至少约30%、至少约50%、至少约70%、80%、90%、95%或更高的杀虫活性。在多个实施方案中，活性相对于本文中别处所定义的参考杀虫蛋白可以被改进或扩大(例如相对于SEQ ID NO:43或45的活性被改进或扩大)。在一个实施方案中，杀虫活性是杀灭鞘翅目的活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀灭鳞翅目的活性。在另一个实施方案式中，杀虫活性是杀灭线虫类的活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀灭双翅目的活性。在另一个实施方案中，杀虫活性是杀灭半翅目的活性。测量杀虫活性的方法是本领域所熟知的。参见例如Czapla和Lang(1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485; Andrews 等，(1988) Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985)J.0f Economic Entomology78:290-293 ；以及 N0.5，743，477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。 [0028]编码杀虫蛋白的核苷酸序列的片段(所述杀虫蛋白编码本发明蛋白的生物学活性部分)会编码至少约 15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450个连续的氨基酸，或直至本发明全长杀虫蛋白中存在的氨基酸总数量。在一些实施方案中，该片段是蛋白酶水解切割(proteolytic cleavage)片段。例如，蛋酶质水解切割片段可以具有相对于SEQ ID N0:48和15-31至少约100个氨基酸、约120个、约130个、约140个、约150个或约160个氨基酸的N末端或C末端截短。在一些实施方案中，本文中所包括的片段源于C末端结晶结构域的去除，例如，通过蛋白酶水解或通过在编码序列中插入终止密码子。在其它实施方案中，融合蛋白包含SEQ ID N0:43的C末端结构域片段和/或SEQ ID NO:45的N末端结构域片段。
[0029]本发明优选的杀虫蛋白由与SEQ ID NO:47和1_14的核苷酸序列充分一致的核苷酸序列所编码，或者杀虫蛋白与SEQ ID N0:48和15-31所示的氨基酸序列充分一致。在另一个实施方案中，核苷酸序列编码融合蛋白，其中N末端部分与SEQ ID NO: 45的N末端部分充分一致，或者其中N末端部分与SEQ ID NO: 45的N末端部分充分一致并且C末端部分与SEQ ID N0:43充分一致。“充分一致”意指利用标准参数通过本文中描述的一种比对程序而与参考序列相比具有至少约60%或65%序列一致性、约70%或75%序列一致性、约80%或 85% 序列一致性、约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或更高序列一致性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将会认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、读码框定位等，可以对这些数值适当地进行调整，以确定由两条核苷酸序列所编码蛋白的相应的一致性。[0030]为了确定两条氨基酸序列或两条核酸的一致性百分比，出于最佳对比的目的对序列进行比对。两条序列之间的一致性百分比是序列所共有的一致位点的数量的函数(即，一致性百分比=相同位点的数量/位点总数量(例如重叠位点)x 100)。在一个实施方案中，两条序列具有相同的长度。在另一个实施方案中，贯穿整条参考序列(即本文所公开的如SEQID NO: 1-31、47或48任意一条所示的序列)来计算一致性百分比。可以使用与下面描述的那些类似的技术，在允许或不允许空缺的情况下确定两条序列之间的一致性百分比。在一致性百分比的计算中，通常对精确匹配进行计数。空缺，即在比对中在一条序列中存在但在另一条中并不存在的残基所处的位点，被认为是非一致性残基的位点。
[0031]两条序列之间一致性百分比的确定可以使用数学算法来完成。可以用于比对两条序列的数学算法的非限制性不例是Karlin和Altschul (1990) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:2264 的算法，在 Karlin 和 Altschul (1993) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877 中所改进。此算法并入到 Altschul 等，(1990) J.Mol.Biol.215:403 的 BLASTN 和 BLASTX 程序中。可以用BLASTN程序，得分=100，字段长度=12实施BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的类杀虫核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序得分=50，字段长度=3实施BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的杀虫蛋白同源的氨基酸序列。为了获得出于比较目的的空缺比对,可以利用如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25:3389.中所述的Gapped BLAST (在BLAST2.0中)。另外，PS1-Blast可以用于实施检测分子之间远源关系的重复搜索。参见 Altschul 等，(1997)，同上。当利用 BLAST, Gapped BLAST 和 PS1-BLAST 程序时，可以使用各个程序(例如BLASTX和BLASTN)的默认参数。还可通过目测人工实施比对。
[0032]用于序列比较的数学算法的另一个非限制性示例是ClustalW算法(Higgins等，(1994)Nucleic Acids Res.22:4673-4680)。ClustalW 算法比较序列和比对整条氨基酸或DNA序列，因此能够提 供关于整条氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于几种市售的DNA/氨基酸分析软件包中，例如Vector NTI Program Suite (InvitrogenCorporation, Carlsbad, CA)的ALIGNX模块。用ClustalW对氨基酸序列进行比对后,可以估算出氨基酸一致性百分比。用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制示例是GENED0C?。GENED0C? (Karl Nicholas)允许估算多个蛋白之间的氨基酸(或DNA)相似性和一致性。用于序列比较的数学算法的另一个非限制性示例是Myers tMiller (1988) CAB10S4:11-17的算法。此算法并入到ALIGN程序(2.0版本)中，所述ALIGN程序是GCG Wisconsin GeneticsSoftware, VersionlO (可从 Accelrys, Inc.，9685Scranton Rd., San Diego, CA, USA 获得)的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空缺长度罚分为12,空缺罚分为4。
[0033]除非另有说明，将利用使用Needleman和Wunsch (1970) J.Mol.Biol.48(3):443-453算法的GAP VersionlO，利用以下参数确定一致性或相似性:对于核苷酸序列的一致性％和相似性％，使用GAP权重50和长度权重3以及nwsgapdna.cmp评分矩阵；对于氨基酸序列的一致性％和相似性％，使用GAP权重8和长度权重2以及BL0SUM62评分程序。还可以使用等同的程序。“等同的程序”意指对于所研究的任意两条序列而言，当与由GAP VersionlO所产生的相应比对结果相比时，产生具有一致的核苷酸残基匹配以及一致的序列一致性百分比比对结果的任意序列比对程序。[0034]本发明还包括变体核酸分子。编码杀虫蛋白的核苷酸序列的“变体”包括编码本文中公开的杀虫蛋白，但是却由于遗传密码的简并性而保守地不同的那些序列，以及如上文所讨论的充分一致的那些序列。天然存在的等位基因变体可以使用熟知的分子生物学技术来鉴定，例如下文概述的的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体核苷酸序列还包括合成来源的核苷酸序列，其例如通过利用位点定向诱变法制备，但是如下文所讨论仍然编码本发明公开的杀虫蛋白。本发明所包括的变体蛋白是具有生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，即杀虫活性。“保留活性”意指变体将具有天然蛋白的至少约30%、至少约50%、至少约70%或至少约80%的杀虫活性。在一些实施方案中，活性相对于本文中别处所定义的参考杀虫蛋白可以被改进或扩大。测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如 Czapla 和 Lang(1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485;Andrews 等，(1988)Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985) J.0f Economic Entomology78:290-293;以及美国专利N0.5，743，477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。
[0035]技术人员将进一步领会到，可以通过突变本发明的核苷酸序列来引入改变，从而导致编码杀虫蛋白的氨基酸序列发生变化，而不会改变蛋白的生物学活性。因此，可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失引入本文中公开的相应核苷酸序列中而产生分离的变体核酸分子，以将一个或多个氨基酸置换、添加或缺失引入所编码的蛋白中。可以通过标准技术，例如位点定点突变和PCR介导的突变来引入突变。这种变体核苷酸序列也包括在本发明中。
[0036]例如，可以在一个或多个预测的非必需氨基酸残基上进行保守性氨基酸置换。“非必需”氨基酸残基是可以由杀虫蛋白的野生型序列中改变而不会改变生物学活性的残基，而“必需”氨基酸残基则是生物学活性所需的。“保守性氨基酸置换”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸所替换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
[0037]可以在保留功能的非保守性区域中进行氨基酸置换。一般来讲，不会对保守性氨基酸残基或存在于保守性基序(其中这些残基对于蛋白活性而言是必需的)内的氨基酸残基进行这种置换。保守的以及可能对于蛋白活性而言是必需的残基的示例包括例如在与本发明序列相似或相关的毒素的比对中所含的所有蛋白之间相一致的残基(例如在同源蛋白的比对中一致的残基)。保守的但是可以允许保守性氨基酸置换并且仍然保留活性的残基的示例包括例如在与本发明序列相似或相关的毒素的比对中所含的所有蛋白之间仅具有保守性置换的残基(例如，在同源蛋白比对中所含的所有蛋白质之间仅具有保守性置换的残基)。然而，本领域技术人员将会理解，功能性变体可以在保守性残基中具有微小的保守性或非保守性改变。
[0038]另外，可通过沿全部或部分编码序列随机引入突变而产生变体核苷酸序列，例如通过饱和突变法，并且针对赋予杀虫活性的能力对所得的突变体进行筛选，以鉴定保留活性的突变体。突变之后，可以使所编码的蛋白重组表达，并且利用标准测定技术确定蛋白活性。
[0039] 利用例如PCR、杂交等的方法，可以鉴定相应的杀虫序列，此序列与本发明的序列具有基本一致性。参见例如 Sambrook和 Russell (2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)和 Innis 等，(1990)PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, NY).[0040]在杂交方法中，可以利用全部或部分杀虫核苷酸序列对cDNA或基因组文库进行筛选。构建这些cDNA和基因组文库的方法一般是本领域已知的，并且公开于同上的Sambrook和Russell, 2001中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可以用可检测基团例如32P或其它可检测标记例如其它放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子进行标记。可以对基于本文中所公开编码已知杀虫蛋白的核苷酸序列的合成性寡核苷酸进行标记而制备杂交探针。额外地，可以利用基于核苷酸序列或所编码氨基酸序列中的保守性核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针通常包含在严格条件下与编码本发明杀虫蛋白的核苷酸序列或者其片段或变体的至少约12、至少约25、至少约50、75、100、125、150、175或200个连续性核苷酸杂交的核苷酸序列区域。制备杂交探针的方法一般是本领域已知的，并且公开于同上通过引用并入本文的Samtoook和 Russell, 2001 中。
[0041]例如，本文所公开的整条杀虫序列或者其一个或多个部分，可以用作能够与相应的杀虫蛋白类似序列和信使RNAs特异性杂交的探针。为了在多种条件下实现特异性杂交，这些探针包含独特的并且优选长度为至少约10个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。这些探针可用于通过PCR从所选的有机体中扩增相应的杀虫序列。该技术可以用于从期望的有机体中分离额外的编码序列或作为诊断测定法以确定有机体中编码序列的存在。杂交技术包括平板DNA文库的杂交筛选(蚀菌斑或菌落，参见例如Sambrook等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York)。
[0042]因此，本发明包括杂交探针，以及能够与本发明核苷酸序列的全部或部分(例如至少约 300 个核苷酸、至少约 400 个、至少约 500、1000、1200、1500、2000、2500、3000、3500 个，
或直至本文中公开的核苷酸序列的全长)杂交的核苷酸序列。这种序列的杂交可以在严格条件下实施。“严格条件”或“严格杂交条件”意指在该条件下探针与其靶标序列杂交的可检测程度高于与其它序列的杂交(例如，高于背景至少2倍)。严格条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以鉴定出与探针100%互补的靶标序列(同源探测)。另外，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般来讲，探针的长度少于1000个核苷酸，优选长度少于500个核苷酸。
[0043]通常，严格条件将是其中盐浓度为小于约1.5M Na离子，通常约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐类)，PH为7.0-8.3，以及对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度为至少约30°C，对于长探针(例如大于50个核苷酸)温度为至少约60°C的那些。还可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现严格条件。示例性的低严格条件包括用30至35%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS (十二烷基磺酸钠)的溶液于37°C杂交，并且在IX至2XSSC (20XSSC=3.0MNaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50至55°C洗涤。示例性的中等严格条件包括在40至45%甲酰胺、IM NaCl、l%SDS的溶液中于37°C杂交，并且在0.5X至IX SSC中于55至650°C洗涤。示例性的高严格条件包括在50%甲酰胺、IM NaCl、1%SDS的溶液中于37°C杂交，并且在0.1XSSC中于60至65°C洗涤。可选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1%至约1%的SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时,通常约4至12小时。
[0044]特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交，Tni可以从Meinkoth和 Wahl (1984) Anal.Biochem.138:267-284 的公式中估算得到:Tm=81.5°C +16.6 (log Μ) +0.41 (%GC) _0.61 (%form) -500/L ;其中 M 是一价阳离子的摩尔浓度，%GC是DNA中鸟苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，%form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是碱基对中杂交体的长度。Tm是这样的温度(在限定的离子强度和pH下)，在该温度下50%的互补靶序列与完美匹配的探针杂交。每1%的错配，Tm降低约1°C;因此，可以调整Tm、杂交和/或洗涤条件，以与期望一致性的序列杂交。例如，如果要找寻具有> 90% —致性的序列，^可以降低10°C。一般来讲，所选择的严格条件比特定离子强度和pH下特异性序列及其互补物的热熔解点(Tm)低约5°C。然而，非常严格条件可以利用比热熔解点(Tm)低1、2、3或4°C下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用比热熔解点(Tm)低6、7、8、9或I (TC下的杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用比热熔解点(Tm)低11、12、13、14、15或20°C下的杂交和/或洗涤。利用该等式、杂交和洗涤组合物以及期望的Tm，本领域普通技术人员将会理解，隐含描述了杂交严格性和/或洗涤溶液的变化形式。如果错配的期望程度导致Tm小于45°C (水性溶液)或32°C (甲酰胺溶液)，则优选提高SSC的浓度以使能够使用较高的温度。对于核酸杂交的延伸性指导出现于Tijssen(1993)Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes, PartI, Chapter2 (Elsevier, New York);和 Ausubel 等，eds.(1995) Current Protocols inMolecular Biology,Chapter2(Greene Publishing and Wiley-1ntersciencej New York)中。参见See Sambrook等，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。
[0045]分离的蛋白及其变体和片段
[0046]本发明中还包括杀虫蛋白。“杀虫蛋白”意指具有SEQ ID NO:48和15-31所不氣基酸序列的蛋白。还提供了其片段、生物学活性部分和变体，其可以用于实践本发明的方法。“分离的蛋白”或“重组蛋白”用于指不再处于其天然环境中，例如处于体外或者重组细菌或植物宿主细胞中的蛋白。
[0047]“片段”或“生物学活性部分”包括包含与SEQ ID NO:48和15_31所示氨基酸序列充分一致的氨基酸序列并且表现出杀虫活性的多肽片段。杀虫蛋白的生物学活性部分可以是例如长度为 10、25、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350 个或更多氨基酸的多肽。可以通过重组技术来制备这种生物学活性部分，并且评估其杀虫活性。测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如Czapla和Lang (1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485; Andrews 等，(1988) Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985)J.0f Economic Entomology78:290-293;和美国专利 N0.5，743，477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。如本文所使用，片段包含SEQ ID N0:48和15-31的至少8个连续的氨基酸。然而，本发明包括其它片段，例如蛋白中长度大于约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350个或更多氨基酸的任意片段。
[0048]“变体”意指具有与SEQ ID NO: 48和15_31任一项的氨基酸序列至少约60%，约 70%、75%,约 80%、85%,约 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% —致的氨基酸序列的蛋白或多肽。变体还包括在严格条件下与SEQ ID N0:47和1-14所示的核酸分子或其互补物杂交的核酸分子所编码的多肽。变体包括因突变而导致氨基酸序列不同的多肽。本发明所包括的变体蛋白是具有生物学活性的，即它们继续拥有天然蛋白的期望生物学活性，即保留杀虫活性。在一些实施方案中，变体相对于天然蛋白具有改进的活性。测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如Czapla和Lang(1990) J.Econ.Entomol.83:2480-2485; Andrews 等，(1988) Biochem.J.252:199-206;Marrone 等，(1985)J.0f Economic Entomology78:290-293和美国专利N0.5，743，477，所有这些文献作为整体通过引用并入本文。
[0049]细菌基因，例如本发明的axmi基因，在开放阅读框的起始点附近常常具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将导致产生功能性蛋白。这些起始密码子可以包括ATG密码子。然而，细菌例如芽孢杆菌属还会将密码子GTG识别为起始密码子，在GTG密码子处起始翻译的蛋白在第一个氨基酸处含有甲硫氨酸。在极少数情况下，细菌系统中的翻译可以在TTG密码子处起始，不过在这种情况下TTG编码甲硫氨酸。此外，通常不能先验地确定这些密码子中的哪些在细菌中是天然使用的。因此，可以理解的是，使用替代性甲硫氨酸密码子之一也可以导致产生杀虫蛋白。这些杀虫蛋白包括在本发明中，并且可以用于本发明的方法中。将要理解的是，当在植物中表达时，将替代性起始密码子改变成ATG以正确翻译是必需的。
[0050]还包括本发明多肽或者其变体或片段的抗体。产生抗体的方法是本领域熟知的(参见例如 Harlow 和 Lane (1988) Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory, Cold Spring Harbor, NY;美国专利 N0.4, 196, 265)。
[0051]改夺或改讲的夺体
[0052]已认识到可以通过多种方法改变杀虫蛋白的DNA序列，并且这些改变可能导致DNA序列编码具有与由本发明杀虫蛋白所编码不同的氨基酸序列的蛋白。该蛋白可以用多种方式改变，包括SEQ ID N0:48和15-31的一个或多个氨基酸的氨基酸置换、缺失、截短和插入，包括在C末端部分或N末端部分或者二者中多至约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60、约65、约 70、约 75、约 80、约 85、约 90、约 100、约 105、约 110、约 115、约 120、约 125、约 130、约135、约140、约145、约150、约155个或更多个氨基酸的置换、缺失或插入。用于这些操作的方法一般是本领域已知的。例如，可以通过DNA中的突变制备杀虫蛋白的氨基酸序列变体。这还可以通过突变的几种形式之一和/或定向进化来完成。在一些方面中，氨基酸序列中编码的改变将基本上不会影响蛋白的功能。这些变体将拥有期望的杀虫活性。然而，可以理解的是，可以通过对本发明的组合物上使用这些技术来改进杀虫蛋白赋予杀虫活性的能力。例如，可以在DNA复制期间表现出高碱基错误掺入率的宿主细胞(例如XL-1Red(Stratagene, La Jolla, CA))中表达杀虫蛋白。在这些菌株中增殖之后，可以分离DNA (例如通过制备质粒DNA，或通过PCR扩增并将所得PCR片段克隆入载体中)，在未突变菌株中培养杀虫蛋白突变体，并例如通过进行测试杀虫活性的测定从而鉴定具有杀虫活性的已突变基因。一般来讲，将蛋白混合并用于饲喂测定中。参见例如Marrone等，(1985) J.0fEconomic Entomology78:290-293。这种测定可以包括使植物与一种或多种害虫接触,并确定植物存活和/或造成害虫死亡的能力。导致毒性增加的突变的示例存在于Schm5Pf等，(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.62:775-806 中。
[0053]另外，可以在氨基或羧基末端处改变许多蛋白的蛋白序列，而基本上不会影响活性。这可以包括通过现代分子学方法例如PCR引入的插入、缺失或改变，包括由于PCR扩增中使用的寡核苷酸中包含氨基酸编码序列而改变或延伸蛋白编码序列的PCR扩增。另外，所添加的蛋白序列可以包括整个蛋白编码序列，例如本领域常用的用于产生蛋白融合体的那些。这种融合蛋白通常用于(I)增加目的蛋白的表达(2)引入结合结构域、酶活性或便于蛋白纯化、蛋白检测的表位或本领域已知的其它实验用途(3)将蛋白靶向分泌或翻译至亚细胞器官，例如革兰氏阴性细菌的周质间隙或真核细胞的内质网，后者常常导致蛋白的糖基化。
[0054]本发明的核苷酸和氨基酸序列变体还包括突变和重组方法例如DNA改组衍生的序列。利用此种方法，可以利用一个或多个不同的杀虫蛋白编码区域产生拥有期望特性的新杀虫蛋白。以这种方式，由一群相关序列的多聚核苷酸制备重组多聚核苷酸文库，所述相关序列的多聚核苷酸包含基本上序列一致并且能够在体外或体内同源重组的序列区。例如，利用该方法，可以在本发明的杀虫基因和其它已知的杀虫基因之间对编码目的结构域的序列基序进行改组，以获 得编码具有改进的目的特性(例如增加的灭虫活性)的蛋白的新基因。用于这种DNA改组的方案是本领域已知的。参见例如Stemmer (1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature370:389-391;Crameri 等，(1997)Nature Biotech.15:436-438;Moore 等，(1997) J.Mol.Biol.272:336-347; Zhang等，(1997)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA94:4504-4509; Crameri 等，(1998)Nature391:288-291 以及美国专利 N0.5，605，793 和 5，837，458。
[0055]结构域交换或改组是产生改变的杀虫蛋白的另一种机制。可以在灭虫蛋白之间交换结构域，产生具有改进的杀虫活性或靶标谱的杂合体或嵌合体毒素。产生重组蛋白以及对它们进行杀虫活性测试的方法是本领域已知的(参见例如Naimov等，(2001) Appl.Environ.Microbiol.67: 5328-5330 ; de Maagd 等，(1996) Appl.Environ.Microbiol.62:1537-1543;Ge 等，(1991)J.Biol.Chem.266:17954-17958;Schnepf等，(1990) J.Biol.Chem.265: 20923-20930 ; Rang 等，(1999) Appl.Environ.Microbiol.65:2918-2925)。
[0056]因此，在本发明的多种实施方案中，本文中包括的核酸序列(以及包含核酸序列的组合物、载体、宿主细胞、植物和种子)包含一种或多种毒素的一部分和一种或多种不同毒素的一部分。在一个实施方案中，核酸序列包含编码Axmi005 (SEQ ID N0:45中所不)N末端部分和Axmill5 (SEQ ID NO:43中所示)C末端部分的核苷酸序列。在特定的实施方案中，Axmi005的N末端部分包含Axmi005的约第I位至第173位氨基酸残基，或从约第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45 或 50 位至约 150、155、160、165、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、250、300、325或350位氨基酸残基，Axmi 115的C末端部分包含从Axmi 115的约第174位氨基酸残基至约第 803 位氨基酸残基，或从约第 174、175、176、177、178、179、180、185、190、195、200、205、210、220、225、230、250、300、325 或 350 位氨基酸残基至约第 600、650、700、750、760、770、780、790、795、796、797、798、799、800、801、802 或 803 位氨基酸残基。本领域技术人员将认识到，可以在每条氨基酸序列中进行细微的变异和缺失并且仍然保持(或改进)融合蛋白的活性。在一些实施方案中，本发明的核酸序列编码Axmi005/Axmi 115融合蛋白，所述融合蛋白在对应于SEQ ID NO:43的第584、588和771位氨基酸残基的一个或多个位点处具有突变(相对于亲本Axmi005或Axmi115蛋白的相应区域)(参见例如SEQ ID NO:18_22中的变体融合序列)。在其它实施方式中，本文中包括的核苷酸序列如SEQ ID NO:47和1-14中任一项所不，氨基酸序列如SEQ ID N0:48和15-31中任一项所不。
[0057]在多种实施方案中411^005与4111^115的融合导致氨基酸序列与单独的Axmi005或Axmill5相比具有改进的或扩大的活性。“改进的”活性意指与天然蛋白相比使至少一种害虫的死亡增加或使害虫生长、进食或正常生理发育的明显降低增加。“扩大的”活性意指Axmi005和Axmi 115 二者均未显示针对一种害虫的活性。例如，Axmi005的一部分与Axmi 115的一部分融合可以产生具有Axmi005和Axmi 115 二者的活性谱的蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白针对单个害虫的活性相对于Axmi005和/或Axmill5之一或二者得到了改进。
[0058]载体
[0059]本发明的 杀虫序列可以提供于用于在目的植物中表达的表达盒中。“植物表达盒”意指能够使得在植物细胞中由开放阅读框表达蛋白的DNA构建体。通常这些含有启动子和编码序列。这种构建体常常还含有3’非翻译区。这种构建体可以含有“信号序列”或“前导序列”，以便于肽共翻译或翻译后转运至特定的胞内结构，例如叶绿体(或其它质体)、内质网或闻尔基体。
[0060]“信号序列”意指已知的或疑似导致肽共翻译或翻译后跨细胞膜转运的序列。在真核生物中，这通常包括分泌进入高尔基体，伴随一些因此而发生的糖基化。细菌的灭虫毒素常常合成为原毒素，其在革巴标害虫的肠道内被蛋白水解活化(Chang(1987)MethodsEnzymo1.153:507-516)。在本发明的一些实施方案中,信号序列位于天然序列中，或可以由本发明的序列衍生得到。“前导序列”意指当翻译时产生足以引发肽链共翻译转运至亚细胞器官的氨基酸序列的任何序列。因此，这包括通过穿入内质网、穿过囊泡、质体(包括叶绿体、线粒体等)等引导转运和/或糖基化的前导序列。
[0061]“植物转化载体”意指有效转化植物细胞所必需的DNA分子。这种分子可以由一个或多个植物表达盒组成，并且可以组织成多于一个“载体"DNA分子。例如，双元载体是利用两个非连续性编码用于植物细胞转化的所有必要的顺式或反式作用功能的植物转化载体(Hellens 和 Mullineaux (2000) Trends in Plant Science5:446-451 )。“载体，，是指设计用于在不同宿主细胞间转移的核酸构建体。“表达载体”是指具有在外来细胞中并入、整合和表达异源DNA序列或片段的能力的载体。表达盒将包含与本发明的序列可操作连接的5’和/或3’调控序列。“可操作连接”意指启动子和第二序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。一般来讲，可操作连接意味着所连接的核酸序列是连续的，并且有必要连接两个蛋白编码区域时是连续的并且处于相同的读码框中。表达盒可以额外地含有待共转化入有机体的至少一种额外的基因。另外，可以在多个表达盒上提供额外的基因。
[0062]在多种实施方案中，本发明的核苷酸序列可操作连接到启动子上，例如植物启动子。“启动子”是指功能为指导下游编码序列进行转录的核酸序列。启动子连同其它转录和翻译调控核酸序列(也被称为“控制序列”)是目的DNA序列的表达所必需的。
[0063]这种表达盒提供有用于插入处于调控区转录调控之下的杀虫序列的多个限制性位点。
[0064]表达盒将在5’ -3’转录方向包括在植物中行使功能的转录和翻译起始区(即启动子)、本发明的DNA序列以及翻译和转录终止区(即终止区)。启动子相对于植物宿主和/或本发明的DNA序列可以是天然的或类似物，或者是外来的或异源的。额外地，启动子可以是天然序列或另外地合成序列。当启动子相对于植物宿主是“天然的”或“同源的”时，其意指启动子存在于引入该启动子的天然植物中。当启动子相对于本发明的DNA序列是“外来的”或“异源的”时，其意指该启动子对于本发明可操作性连接的DNA序列而言不是天然或天然存在的启动子。
[0065]终止区相对于转录起始区可以是天然的，相对于可操作性连接的目的DNA序列可以是天然的，相对于植物宿主可以是天然的，或者可以衍生自另一种来源(即相对于启动子、目的DNA序列、植物宿主或其任意组合是外来的或异源的)。常规的终止区可以从农杆菌(A.tumefaciens) Ti质粒中获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶的终止区。还参见 Guerineau 等，(1991)Mol.Gen.Genet.262:141_144;Proudfoot (1991)Cell 64:671-674; Sanfacon 等，(1991)Genes Dev.5:141-149;Mogen 等，(1990)PlantCell2:1261-1272;Munroe 等，(1990)Gene91:151-158;Balias 等，(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891-7903;和 Joshi 等，(1987)Nucleic Acid Res.15:9627-9639。
[0066]适当时，可以对基因进行优化，以增加在转化的宿主细胞中的表达。即，基因可以使用宿主细胞偏好的密码子合成以提高表达，或者基因可以以宿主偏好的密码子使用频率利用密码子合成。一般来讲，基因的GC含量将会增加。对于宿主编好的密码子使用的讨论，参见例如Campbell和Gowri (1990)Plant Physiol.92:1-1l0用于合成植物偏好的基因的方法是本领域可获得的。参见例如通过引用并入本文的美国专利Nos.5，380，831和 5,436,391、美国公开 N0.20090137409 以及 Murray 等，(1989) Nucleic AcidsRes.17:477-498。
[0067]在一个实施方案中，杀虫蛋白靶向叶绿体中表达。以这种方式，当杀虫蛋白不是直接插入叶绿体中时，表达盒将额外地含有编码引导杀虫蛋白至叶绿体的转运肽的核酸。这种转运肽是本领域已知的。参见例如Von Heijne等，(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9:104-126 ; Clark 等，(1989) J.Biol.Chem.264:17544-17550 ; Della-Cioppa 等，(1987) Plant Physiol.84:965-968 ; Romer 等，(1993) Biochem.Biophys.Res.Commun.196:1414-1421 和 Shah 等，(1986)Science233:478-481.[0068]可以对待靶向叶绿体的杀虫基因进行优化以在叶绿体中表达，以解决植物细胞核和该细胞器之间密码子使用的差异。以这种方式，目的核酸可以利用叶绿体偏好的密码子合成。参见例如通过引用并入本文的美国专利N0.5，380, 831。
[0069]棺物转化
[0070]本发明的方法包括将核苷酸构建体引入植物中。“引入”意指以构建体能够进入植物细胞内部的方式将核苷酸构建体呈递至植物中。本发明的方法不需要使用特定方法将核苷酸构建体引入植物中，只要核苷酸构建体能够进入植物的至少一个细胞的内部即可。将核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
[0071]“植物”意指整株植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及其子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质、叶片细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。
[0072]“转基因植物”或“转化的植物”或“稳定转化的”植物或细胞或组织是指植物细胞中已经并入或整合入外源核酸序列的植物。这些核酸序列包括外源的或未转化植物细胞中不存在的那些，以及内源的或培养开发部化的植物细胞中存在的那些。“异源的”一般是指对于所存在其中的细胞或天然基因组部分而言不是内源并且已经通过感染、转染、显微注射、电穿孔等添加至细胞中的核酸序列。 [0073]本发明的转基因植物表达本文中公开的一种或多种新的毒素序列。在多个实施方案中，转基因植物进一步包含一个或多个额外的昆虫抗性基因(例如Cryl，例如Cry 1A、CryIB> CrylC、CryID> CrylE 和 CrylF 家族的成员；Cry2,例如 Cry2A 家族的成员；Cry9,例如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E和Cry9F家族的成员，等)。本领域技术人员将理解的是，转基因植物可以包含赋予目标农学性状的任意基因。
[0074]植物细胞的转化可以通过本领域已知的几项技术之一完成。可以对本发明的杀虫基因进行修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。通常表达这种蛋白的构建体将含有驱动基因转录的启动子以及允许转录终止和多聚腺苷酸化的3’非翻译区。此类构建体的构造是本领域熟知的。在一些情况下，可能有用的是使基因工程化以使所得到的肽分泌或另外靶向植物细胞内部。例如，可以使基因工程化，以含有促进肽转移至内质网的信号肽。还优选使植物表达盒工程化以含有内含子，以使对于表达而言需要进行内含子的mRNA加工。
[0075]通常这种“植物表达盒”将插入“植物转化载体”中。这种植物转化载体可以包含实现植物转化所需的一个或多个DNA载体。例如，本领域常见的实践是利用包含多于一个连续性DNA节段的植物转化载体。这些载体在本领域也被称为“双元载体”。双元载体以及带有辅助质粒的载体最常用于农杆菌介导的转化，其中实现充分转化所需的DNA节段的大小和复杂性相当大，并且将功能分配至独立的DNA分子是有利的。双元载体通常含有质粒载体，所述质粒载体含有T-DNA转移所需的顺式作用序列、工程化以能够在植物细胞中表达的选择标记和“目的基因”(工程化以能够在对于产生转基因植物所需要的植物细胞中表达的基因)。这种质粒载体上还存在细菌复制所需的序列。顺式作用序列以允许有效转移至植物细胞中并且在其中表达的方式排列。例如，选择标记基因和杀虫基因位于左边界和右边界之间。一般第二质粒载体含有介导T-DNA从农杆菌转移至植物细胞的反式作用因子。如本领域所理解，这种质粒一般含有允许农杆菌感染植物细胞的毒力功能(Vir基因)，以及通过在边界序列处切割的DNA转移和vir介导的DNA转移(Hellens和Mullineaux (2000)Trends in Plant Science5:446-451 )。可以使用几种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHAlOU EHA105)进行植物转化。第二质粒载体对于通过其他方法例如显微投射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇法等转化植物而言不是必需的。
[0076]一般来讲，植物转化方法涉及将异源DNA转移至靶植物细胞(例如不成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，随后施加最大阈值水平的适宜选择(取决于选择标记基因)，以从一组未分化的细胞团中回收转化的植物细胞。通常将外植体转移至相同培养基的新鲜补给物中并且例行培养。随后，在放置于添加了最大阈值水平的选择剂的再生培养基上后，转化的细胞分化成苗。接着将苗转移至选择性生根培养基中，以回收生根的苗或小植株。转基因的小植株接着生长成成熟植物并且产生可育性种子(例如 Hiei 等，(1994) The Plant Journal6:271-282; Ishida et al.(1996)Nature Biotechnologyl4:745-750)。通常将外植体转移至相同培养基的新鲜补给物中并且例行培养。对用于产生转基因植物的技术和方法的一般描述见于Ayres和Park(1994)Critical Reviews in Plant Science13:219-239 以及 Bommineni 和 Jauhar(1997)Maydica42:107-120中。由于转化的材料含有许多细胞，转化和未转化的细胞均存在于任何一片经处理的靶愈伤组织或组织或细胞群中。杀死未转化细胞并且允许转化的细胞增殖的能力导致产生转化的植物培养物。一般去除未转化细胞的能力是快速回收转化的植物细胞和成功产生转基因植物的限制因素。
[0077]转化步骤以及将核苷酸序列引入植物中的步骤可以根据转化所靶向的植物或植物细胞类型即单子叶植物或双子叶植物而变化。可以通过几种方法之一进行转基因植物的产生，包括但不限于显微注射、电穿孔、直接基因转移、通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞中(农杆菌介导的转化)、用粘附至粒子的异源外来DNA轰击植物细胞、射弹粒子加速、气溶胶束转化(美国公开申请N0.20010026941 ;美国专利N0.4，945,050 ;国际公开N0.W091/00915 ;美国公开申请N0.2002015066)、Lecl转化以及转移DNA的多种其他非粒子直接介导的方法。
[0078]用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。参见例如Svab等，(1990)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA87:8526-8530 ；Svab 和 Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:913-917 ；Svab和Maliga(1993)EMBO J.12:601-606。该方法依赖于粒子枪递送含有选择标记的DNA以及通过同源重组使DNA靶向至质体基因组。额外地，质体转化可以通过利用细胞核编码且导向质体的RNA聚合酶的组织优选性表达将质体携带的沉默转基因反式激活而实现。这种系统已经报道于 Mcfcide 等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA91:7301-7305 中。
[0079]将异源外来DNA整合入植物细胞中后，接着在培养中施加最大阈值水平的适宜选择，以通过定期转移至新鲜培养基从而杀死未转化的细胞以及将在这种选择处理中存活的推定转化的细胞分离和增殖。通过连续传代和用适宜的选择攻击，鉴定转化了质粒载体的细胞并使其增殖。接着可以利用分子和生化方法确认存在整合入转基因植物基因组中的目标外源基因。
[0080]已经转化的细胞可以根据常规方法生长成植物。参见例如McCormick等，(1986)Plant Cell Reports5:81_84。接着这些植物可以生长,用相同的转化株系或不同的株系授粉，并鉴定期望表型特性组成型表达的所得杂交体。可以培育两个或多个世代，以确保期望表型特性的表达稳定维持并且遗传，并且接着收获种子，以确保已经实现期望表型特性的表达。利用这种方法，本发明提供了转化的种子(也被称为“转基因种子”)，其使得本发明的核苷酸构建体例如本发明的表达盒稳定并入其基因组中。
[0081]植物转化的评价
[0082]将异源外来DNA引入植物细胞中后，通过多种方法确认异源基因转化或整合入植物基因组中，例如对与所整合基因相关的核酸、蛋白和代谢物进行分析。
[0083]PCR分析是在移植入土壤前的早期阶段对转化的细胞、组织或苗筛选所并入基因的存在的快速方法(Sambrook 和 Russell (2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。利用对目的基因或农杆菌载体背景等特异性的寡核苷酸引物实施PCR。
[0084]可以通过基因组DNA的Southern印迹分析确认植物转化(上文Sambrook和Russell, 2001)。总地来讲，从转化体中提取总DNA，用适宜的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中分离并转移至硝酸纤维素或尼龙膜上。接着根据标准技术利用例如放射性标记的32P靶DNA片段对膜或“印迹物”进行探测，以确认所引入的基因整合入植物基因组中。
[0085]在Northern印迹分析中，从转化体的特定组织中分离RNA,在甲醒琼脂糖凝胶中分离并根据本领域例行使用的标准步骤(上文Sambrook和Russell, 2001)印迹至尼龙膜上。接着利用本领域已知方法(上文Sambrook和Russell, 2001),通过使膜与来源于杀虫基因的放射活性探针杂交，对由杀虫基因所编码RNA的表达进行测试。
[0086]可以对转基因植物实施Western印迹、生化测定等，以利用与杀虫蛋白上存在的一个或多个表位结合的抗体，通过标准步骤(上文Sambrook和Russell, 2001)确认由杀虫基因所编码蛋白的存在。
[0087]植物中的杀虫活性 [0088]在本发明的另一个方面中，可以产生表达具有杀虫活性的杀虫蛋白的转基因植物。可以利用上面通过示例方式描述的方法产生转基因植物，但是产生转基因植物细胞的方式对于本发明而言并非关键。本领域已知或描述的方法，例如农杆菌介导的转化、生物射弹转化和非粒子介导的方法，可以由实验者酌情使用。表达杀虫蛋白的植物可以通过本领域描述的常规方法进行分离，例如通过转化愈伤组织、对转化的愈伤组织进行选择和由这种转基因愈伤组织再生可育性植物。在这一过程中，可以利用任意基因作为选择标记，只要其在植物细胞中的表达赋予鉴定或选择转化细胞的能力。
[0089]已经开发了用于植物细胞的一些标记，例如氯霉素、氨基糖甙G418、潮霉素等抗性标记。编码参与叶绿体代谢的产物的其他基因也可以用作选择标记。例如，提供对植物除草剂例如草甘膦、溴苯腈或咪唑啉酮的抗性的基因可能特别有用。已经报道了这类基因(Stalker等，(1985) J.Biol.Chem.263:6310-6314 (溴苯腈抗性腈水解酶基因)和Sathasivan 等,(1990)Nucl.Acids Res.18:2188 (AHAS 咪唑啉酮抗性基因))。额外地,本文中公开的基因用作标记，以评估细菌或植物细胞的转化。用于检测转基因在植物、植物器官(例如叶片、莖、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚或其子代中的存在的方法是本领域熟知的。在一个实施方案中，通过测试杀虫活性检测转基因的存在。
[0090]可以对表达杀虫蛋白的可育性植物进行杀虫活性的测试，并且选择显示最佳活性的植物进行进一步育种。测定杀虫活性的方法是本领域可获得的。一般来讲，将蛋白混合并用于饲喂测定中。参见例如 Marrone 等，(1985) J.0f Economic Entomology 78:290-293。
[0091]本发明可以用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物的示例包括但不限于谷物(玉米)、高梁、小麦、向日葵、番爺、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘鹿、烟草、大麦和油籽油菜、芸色属物种(Brassicasp.)、苜猜、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、凤梨、柑桔树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、油橄榄、番木瓜、腰果、全缘叶澳洲坚果、扁桃、燕麦、蔬菜类、观赏植物类和松柏类。
[0092]蔬菜包括但不限于番爺、生菜、青豆、利马豆、豌豆和黄瓜属(Curcumis)成员，例如黄瓜、网纹甜瓜和香甜瓜。观赏植物包括但不限于杜鹃花、八仙花、朱槿、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、一品红和菊花。优选本发明的植物是作物植物(例如玉米、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油籽油菜等)。
[0093]在杀虫控制中的用途
[0094]将包含本发明核苷酸序列或其变体的菌株应用于杀虫控制中或使其他有机体作为杀虫剂的一般方法是本领域已知的。参见例如美国专利N0.5，039，523和EP0480762A2。
[0095]含有本发明核苷酸序列或其变体的芽孢杆菌属菌株或已经遗传改变以含有本发明杀虫基因和蛋白的微生物可以用于保护农作物和农产品免受害虫损害。在本发明的一个方面中，用试剂对产生毒素(杀虫剂)的有机体的完整即未裂解细胞进行处理，所述试剂使得当细胞应用于靶害虫的环境时，细胞中所产生毒素的活性延长。
[0096]或者，通过将杀虫基因引入细胞宿主中产生杀虫剂。杀虫基因的表达直接或间接导致该杀虫剂的胞内产生和维持。在本发明的一个方面中，接着在一定条件下对这些细胞进行处理，所述条件使得当细胞应用于靶害虫的环境时，细胞中所产生毒素的活性延长。所得产物保留毒素的活性。接着可以根据常规技术对这些天然包囊化的杀虫剂进行配制，以应用于靶害虫所在环境，例如土壤、水和植物叶片。参见例如EPA0192319以及其中所引用的参考文献。或者，可以配制表达本发明基因的细胞，以允许应用所得物质作为杀虫剂。
[0097]本发明的活性成分通常以组合物形式应用，并且可以随其他化合物同时或依次应用于待处理的作物区域或植物。这些化合物可以是肥料、除草剂、抗冻剂、表面活性剂、去垢剂、杀虫皂、休眠油、聚合物和/或在单次应用制剂后允许对靶区域长期投药的延时释放或生物可降解载体制剂。其还可以是选择性除草剂、化学杀虫剂、杀病毒剂、杀微生物剂、抗阿米巴药、杀虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫药、杀螺剂或这些制备品中几种制品的混合物，如果需要，连同制剂领域中通常使用的其他农药可接受载体、表面活性剂或应用促进佐剂。适宜的载体和佐剂可以是固体或液体，并且对应于制剂技术中通常使有的物质，例如天然或再生性矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。同样地，制剂可以制备成可食性“饵料”或加工成害虫“陷阱”，以允许靶害虫采食或摄取杀虫制剂。
[0098]应用含有本发明细菌菌株所产生至少一种杀虫蛋白的本发明活性成分或本发明农业化学组合物的方法包括叶面 应用、种子包衣和土壤应用。应用的次数和应用的速率取决于相应害虫的侵袭强度。
[0099]组合物可以配制为粉剂、尘剂、丸剂、粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体、溶液等，并且可以通过常规手段例如对包含多肽的细胞培养物进行干燥、冻干、匀质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩而制备。在含有至少一种这类杀虫多肽的所有这些组合物中，多肽可以以重量比为约1%至约99%的浓度存在。
[0100]可以通过本发明的方法杀死给定区域中鳞翅目、异翅目、双翅目或鞘翅目害虫或减少其数量，或者可以预防性应用至某环境区域以防止易感害虫侵袭。优选害虫摄取或接触杀虫有效量的多肽。“杀虫有效量”意指能够使至少一种害虫死亡或者能够显显减少害虫生长、釆食或正常生理发育的杀虫剂量。该量将根据如以下所述因素变化，例如待控制的特定靶害虫、特定环境、位置、植物、作物或农业地点、环境条件，以及有效杀虫的多肽组合物的应用方法、速率、浓度、稳定性和量。制剂还可以根据气候条件、环境考虑和/或应用频率和/或害虫侵袭的严重程度方面而变化。
[0101]所描述的杀虫组合物可以通过将细菌细胞、晶体和/或孢子悬液或者分离的蛋白组分与期望的农业上可接受的载体进行配制而制备。组合物可以在施用之前以适宜手段配制，例如冻干、冷冻干燥或在水性载体、培养基或合适的稀释剂中，例如盐水落石出或其他缓冲液。所配制的组合物可以是尘剂或颗粒物质形式，或者是在油(植物油或矿物油)中的悬液或者水或油/水乳液，或者作为可湿性粉剂，或者与适用于农业应用的任何其他载体物质组合。术语“农业上可接受的载体”涵盖常规用于杀虫剂配制技术中的所有佐剂、惰性组分、分散剂、表面活性剂、增粘剂、粘合剂等；这些是杀虫剂配制领域的技术人员熟知的。制剂可以与一种或多种固体或液体佐剂混合，并且可以通过多种手段制备，例如通过使用常规配制技术将杀虫组合物与合适佐剂均匀混合、掺和和/或研磨。合适的配制和应用方法描述于通过引用并入本文的US专利N0.6，468，523中。 [0102]“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫、螨、蜱等。昆虫害虫包括选自鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、鱗翅目(Lepidopt era)、食毛目(Mallophaga)、同翅目(Homoptera)、半翅目(Hemiptera)、直翅目(Orthroptera)、缀翅目(Thysanoptera)、革翅目(Dermaptera)、等翅目(Loptera)、風目(Anoplura)、蚤目(Siphonaptera)、毛翅目(Trichoptera)等，特别地选自鞘翅目、鳞翅目和双翅目。
[0103]鞘翅目包括肉食亚目(Adephaga)和多食亚目(Polyphaga)。肉食亚目包括步甲总科(Caraboidea)和豉甲总科(Gyrinoidea)、而多食亚目包括水龟甲总科(Hydrophi1idea)λ 隐翅甲总科(Staphylinoidea)、花萤总科(Cantharoidea)、郭公甲总科(Cleroidea)、叩甲总科(Elateroidea)、花甲总科(Dascilloidea)、泥甲总科(Dryopoidea)、丸甲总科(Byrrhoidea)、扁甲总科(Cucujoidea)、芫菁总科(Meloidea)、花蚤总科(Mordel1idea)、拟步甲总科(Tenebrionoidea)、长蠹总科(Bostrichoidea)、金龟总科(Scarabaeoidea)、天牛总科(Cerambycoidea)、叶甲总科(Chrysomeloidea)和象甲总科(Curculionoidea)。步甲总科包括虎甲科(CicindeIidae)、步甲科(Carabidae)和龙風科(Dytiscidae)。豉甲总科包括豉甲科(Gyrinidae)。水龟甲总科包括水龟甲科(Hydrophilidae)0隐翅甲总科包括葬甲科(Silphidae)和隐翅甲科(Staphylinidae)。花萤总科包括花萤科(Cantharidae)和萤科(Lampyridae)?郭公甲总科包括郭公甲科(Cleridae)和皮蠹科(Dermestidae)。叩甲总科包括叩甲科(Elateridae)和吉丁甲科(Buprestidae)?扁甲总科包括瓢甲科(CoccinelIidae)?芫菁总科包括芫箐科(Meloidae)。拟步甲总科包括拟步甲科(Tenebrionidae)。金龟总科包括黑螺科(Passalidae)和金龟科(Scarabaeidae)。天牛总科包括天牛科(Cerambycidae)。叶甲总科包括叶甲科(Chrysomelidae)。象甲总科包括象甲科(Curculionidae)和小蠹科(Scolytidae)0
[0104]双翅目包括亚目长角亚目(Nematocera)、短角亚目(Brachycera)和环裂亚目(Cyclorrhapha)。长角亚目(Nematocera)包括大蚊科(Tipulidae)、毛螺科(Psychodidae)、蚊科(Culicidae)、螺科(Ceratopogonidae)、摇蚊科(Chironomidae)、蚋科(Simuliidae)、毛蚊科(Bibionidae)和瘿蚊科(Cecidomyiidae)。短角亚目包括水蛇科(Stratiomyidae)、蛇科(Tabanidae)、剑蛇科((Therevidae)、食虫蛇科(Asilidae)、拟蜂蛇科(Mydidae)、蜂蛇科(Bombyliidae)和长足蛇科(Dolichopodidae)。环裂亚目(Cyclorrhapha)包括无缝组(Aschiza)和有缝组。无缝组包括科蚤蝇科(Phoridae)、食虫牙蝇科(Syrphidae)和眼蝇科(Conopidae)。有缝组包括无辧类(Acalyptratae)和有辧类(Calyptratae)?无辧类包括斑蝇科(Otitidae)、实蝇科(Tephritidae)、潜蝇科(Agromyzidae)和果蝇科(Drosophi I idae)。有辧类包括科風蝇科(Hippoboscidae )、狂蝇科(Oestridae)、寄妮科(Tachinidae)、花妮科(Anthomyiidae)、妮科(Muscidae)、M 妮科(Calliphoridae)和麻妮科(Sarcophagidae)0
[0105]鳞翅目包括凤蝶科(PapiIionidae)、粉蝶科(Pieridae)、灰蝶科(Lycaenidae)、蛱蝶科(Nymphalidae)、斑蝶科(Danaidae)、眼蝶科(Satyridae)、弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大香蛾科(Saturniidae)、尺蛾科(Geometridae)、灯蛾科(Arctiidae)、夜蛾科(Noctuidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、透翅蛾科(Sesiidae)和谷蛾科(Tineidaee)0
[0106]对于主要作物的本发明昆虫害虫包括:玉米:玉米螟，欧洲玉米钻心虫(Europeancorn borer);小地老虎(Agrotis ipsilon)，黑地蚕(black cutworm);谷实夜蛾，美洲棉铃虫(corn earworm);草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)，秋夜蛾(fall army worm);西南玉米杆草螟(Diatraea grandiosella)，西南玉米钻心虫(southwestern corn borer)；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellus),小玉米莖钻心虫(lesser cornstalkborer)；小鹿螟(Diatraea saccharalis)，甘鹿钻心虫(surgarcane borer);玉米根叶甲(Diabrotica virgifer a)，西方玉米根虫(western corn rootworm);长角叶甲巴氏亚种(Diabrotica longicornis barberi)，北方玉米根虫(northern corn rootworm)；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica undecimpunctata howardi )，南方玉米根虫(southern corn rootworm);纹路叩甲属(Melanotus spp.)，铁线虫(wireworms);圆头犀金龟(Cyclocephala borealis)，圆头独角仙(挤赠)(northern masked chafer (whitegrub));圆头无斑犀金龟(Cyclocephala immaculata)，南方圆头犀金龟(挤赠)(southernmasked chafer (white grub))；日本金龟(Popillia japontca)，日本甲虫(Japanesebeetle);玉米铜色跳甲(Chaetocnema pulicaria)，玉米跳甲(corn flea beetle);玉米谷_ 甲(Sphenophorus maidis)，玉米谷象(maize billbug);玉米纟益管姆(Rhopalosiphummaidis)，玉米虫牙(corn leaf aphid);玉米根虫牙(Anuraphis maidiradicis，corn rootaphid);美洲谷长鋳(Blissus leucopterus leucopterus)，麦風(chinch bug);赤腿黑虫皇(Melanoplus femurrubrum),赤腿蚱猛(redlegged grasshopper);血黑幢(Melanoplussanguinipes)，迁徙蚱由孟(migratory grasshopper);玉米种也黾(Hylemya pIatura)，玉米种蛆(seedcorn maggot);美洲黍潜叶妮(Agromyza parvicornis)，玉米斑潜叶妮(cornblot leafminer);玉米黄呆蓟马(Anaphothrips obscrurus)，草蓟马(grass thrips)；窃叶蚁(Solenopsis milesta)，窃蚁(thief ant) ； 二斑叶螨(Tetranychus urticae),二点叶螨(twospotted spider mite):高梁:玉米禾螟(Chilo part el Ius )，高梁钻心虫(sOTghum borer);草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；南美玉米苗斑螟，小玉米莖钻心虫；粒肤地老虎(Feltia subterranea),颗粒地老虎(granulate cutworm)；Phyllophaga crinita，挤赠；伪金针虫属(Eleodes)、叩头虫属(Conoderus)和 Aeolus 属，铁线虫；黑甲负泥虫(Oulema melanopus)，谷类植物跳甲(cereal leaf beetle);玉米铜色跳甲，玉米跳甲；玉米谷喙甲、玉米谷象；玉米缢管蚜；蔗黄伪毛蚜(Sipha flava)，甘蔗黄虫牙(yellow sugarcane aphid);美洲谷长虫舂(Blissus leucopterus leucopterus)，麦風；高梁瘦蚊(Contarinia sorghicola)，高梁螺(sorghum midge);朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus),棉红蜘蛛(carmine spider mite) ； 二斑叶螨、二点叶螨:小麦:美洲一星粘虫(Pseudaletia unipunctata)，行军虫(army worm);草地夜蛾，秋夜蛾；南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus Iignosellus),小玉米莖钻心虫；西方灰地老虎(Agrotisorthogonia)，西部切根虫(western cutworm);南美玉米苗斑螟，小玉米莖钻心虫；黑甲负泥虫，禾谷跳甲；三叶草叶象(Hypera punctata)，车轴草叶象甲(clover leaf weevil)；黄瓜十一星叶甲食根亚种，南方玉米根虫；俄罗斯麦姆(Russian wheat aphid);麦二叉虫牙(Schizaphis graminum)，绿虫(greenbug);麦长管虫牙(Macrosiphum avenae)，英国禾谷虫牙(English grain aphid);赤腿黑幢，赤腿蚱猛；殊种黑幢，殊种蚱猛；血黑幢，迀徙蚱猛；小麦瘦蚊(Mayetiola destructor)，黑森瘦蚊(hessian fly);麦红吸衆虫(Sitodiplosismosellana)，麦螺(wheat midge);美洲麦杆妮(Meromyza americana),美洲麦杆黄潜妮(wheat stem maggot);麦疫种妮(Hylemya coarctata)，麦种妮(wheat bulb fly);烟褐花蓟马(Frankliniella fusca)，烟草蓟马(tobacco thrips);莖锯蜂(Cephus cinctus)，麦莖蜂(wheat stem sawfly);郁金香瘤瘦螨(Aceria tulipae)，麦瘿螨(wheat curl mite)；向日葵:向日葵芽卷叶蛾(Suleima helianthana)，向日葵芽蛾(sunflower bud moth)；向日葵斑螟(Homoeosoma electellum)，美洲向日葵螟(sunflower moth);向日葵叶甲(zygogramma exclamationis, sunflower beetle);古月萝卜金龟(Bothyrus gibbosus)，胡萝卜甲虫(carrot beetle);向日葵杆瘦蚊(Neolasioptera murtfeldtiana)，向日葵籽蠓(sunflower seed midge):棉属棺物:烟概夜蛾(Heliothis virescens)，棉卷叶蛾(cotton budworm);谷实夜蛾，美洲棉铃虫(cotton bollworm);甜菜夜蛾(spodopteraexigua)，甜菜粘虫(beet army worm);红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)，棉红铃虫(pink bollworm);墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis)，棉铃象甲(boll weevil);棉虫牙(Aphis gossypii)，棉花姆 虫(cotton aphid);棉跳盲鋳(Pseudatomoscelis seriatus),棉花跳盲鋳(cotton fIeahopper);结翅粉風(Trialeurodes abuti1nea)，带状翅白粉風(bandedwinged whitefly);美国牧草盲鋳(Lygus lineolaris)，牧草盲鋳tarnished plantbug);赤腿黑幢，赤腿蚱猛；殊种黑幢，殊种蚱猛；棉蓟马(Thrips tabaci)，洋葱蓟马(onionthrips);烟褐花蓟马，草蓟马；朱砂叶螨，棉红蜘蛛；二斑叶螨，二点叶螨；歷:小蔗螟，甘鹿钻心虫；草地夜蛾，秋夜蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；葡萄鞘叶甲(Colaspis brunnea,grape colaspis);稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus, rice water weevil);米象(Sitophilus oryzae, rice weevil);黑尾叶蜂(Nephotettix nigropictus)，稻叶蜂(riceleafhopper);美洲谷长鋳，麦風；喜绿鋳(Acrosternum hilare，green stink bug):大豆:大豆夜蛾(Pseudoplusia includens),大豆尺蠖(soybean looper);梨豆夜蛾(Anticarsiagemmatalis)，梨豆毛虫(velvetbean caterpillar)；苜猜绿夜蛾(Plathypena scabra，green cloverworm);玉米螟，欧洲玉米钻心虫；小地老虎，黑地蚕；甜菜夜蛾，甜菜粘虫；烟虫牙夜蛾，棉卷叶蛾；谷实夜蛾，美洲棉铃虫；墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis,Mexicanbean beetle);桃姆(Myzus persicae, green peach aphid);香豆微叶蝶(Empoascafabae),马铃薯叶蝶(potato leafhopper);喜绿畴(Acrosternum hilare),绿臭畴(greenstink bug);赤腿黑蝗，赤腿蚱蜢；殊种黑蝗，殊种蚱蜢；玉米种蝇，玉米种蛆；大豆蓟马(Sericothrips variabilis, soybean thrips);棉蓟马，洋葱蓟马；土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani, strawberry spider mite):二斑叶虫菌，二点叶虫菌:大寿:玉米螟，欧洲玉米钻心虫；小地老虎，黑地蚕；麦二叉蚜，绿虫；美洲谷长蝽，麦虱；喜绿蝽，绿臭蝽；褐臭椿(Fuschistus servus, brown stink bug);玉米种蚬,玉米种蛆；小麦瘿蚊，黑森瘦蚊；麦岩螨(Petrobia latens,brown wheat mite):油好油菜:甘蓝短棒概(Brevicorynebrassicae),甘蓝姆(cabbage aphid);十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae, Fleabeetle);宿带夜蛾(Mamestra configurata, Bertha armyworm);小菜蛾(Diamond-backmoth);地种蚬属某些物种(Delia ssp.),根蛆(Root maggots)。[0107]线虫包括寄生性线虫如根结线虫、胞囊线虫和根腐线虫，包括胞囊线虫属(Heterodera)某些物种、根结线虫属(Meloidogyne)某些物种和球胞囊属(Globodera)某些物种；特别地是胞囊线虫成员，包括但不限于Heterodera glycines (大豆胞囊线虫)；Heterodera schachtii (甜菜胞囊线虫)；Heterodera avenae (谷类胞囊线虫)；和马铃薯金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(Globodera pailiaa)(马铃薯胞囊线虫)。根腐线虫包括短体属(Pratylenchus)某些物种。[0108]用于增加植物产暈的方法[0109]提供了用于增加植物产量的方法。所述方法包括提供表达多肽的植物或植物细胞，所述多肽编码本文中公开的杀虫多肽序列的多聚核苷酸，以及在被害虫侵袭的田间使该植物或其种子生长，其中所述多肽对所述害虫具有杀虫活性。在一些实施方案中，所述多肽对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目或线虫类害虫具有杀虫活性，并且所述田间被鳞翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目或线虫类害虫侵袭。如本文中所定义，植物的“产量”指由植物产生的生物质的质量和/或数量。“生物质”意指任何被测量的植物产物。生物质产生的增加是被测量植物产物的产量上的任意改善。增加植物产量具有几项商业应用。例如，增加植物叶片生物质可以增加用于人或动物消费的叶菜类的产量。另外，增加叶片生物质可以用于增加植物衍生的药用或工业产物的生产。产量的增加可以包含任何统计学上显著的增加，包括但不限于与不表达杀虫序列的植物相比，产量增加至少1%、增加至少3%、增加至少5%、增加至少10%、增加至少20%、增加至少30%、至少50%、至少70%、至少100%或更多。在具体的方法中，植物产量由于表达本文中所公开杀虫蛋白的植物对害虫的抗性增强而增加。杀虫蛋白的表达导致害虫侵袭或采食植物的能力降低。[0110]还可以用一种或多种化学组合物对植物进行处理，所述的化学组合物包括一种或多种除草剂、杀虫剂或杀真菌剂。示例性化学组合物包括:水果/蔬菜除草剂:莠去津(Atrazine)、除草定(Bromacil )、敌草隆(Diuron)、草甘膦(Glyphosate)、利谷隆(Linuron)> 嗪草酮(Metribuzin)、西玛津(Simazine)、氟乐灵(Trifluralin)、吡氟禾草灵(Fluaz if op)、草铵勝(Glufos inate)、氯吡嘧石黄隆(Halosulfuron Gowan )、百草枯(Paraquat)、炔草胺(Propyzamide)、稀禾定(Sethoxydim)、氟丙嘧草酯(ButafenaciI)、氯批11密磺隆、Indaziflam:水果/蔬菜杀虫齐1丨:涕灭威(Aldicarb)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuriengiensis)、甲萘威(Carbaryl)、克百威(Carbofuran)、毒死蝶(Chlorpyrifos)、氯氰菊酯(Cypermethrin)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、阿维菌素(Abamectin)、氟氯氰菊酯 /β -氟氯氰菊酯(Cyfluthrin/ β -Cyf luthrin)、顺式氰戊菊酯(Esfenvalerate)、高三氟氯氰菊酯(入-cyhalothrin)、灭螨酉昆(Acequinocyl )、联苯肼酯(Bifenazate)、甲氧虫酸餅(Methoxyfenoz ide)、双苯氟服(Novaluron )、环虫酸餅(Chromafenoz ide)、P塞虫啉(Thiacloprid)、呋虫胺(Dinotefuran)、啼螨酯(Fluacrypyrim)、螺螨酯(Spirodiclofen)、Y -氯氟氰菊酯(Gama-cyhalothrin)、螺甲螨酯(Spiromesifen)、艾克敌(Spinosad)、氯虫苯甲酰胺(Rynaxypyr)、溴氰虫酰胺(Cyazypyr)、杀铃脲(Triflumuron)、螺虫乙酯(Spirotetramat)、吡虫啉(Imidacloprid)、氟虫双酰胺(Flubendiamide)、硫双威(Thiodicarb)、氰氟虫腙(Metaflumizone)、氟卩定虫胺腈(Sulfoxaflor)、丁氟螨酯(Cyflumetofen)、Cyanopyrafen、可尼丁(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、Spinotoram、硫双威、氟唳虫酸胺(Flonicamid)、甲硫威(Methiocarb)、氨基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin-benzoate)、恶二唑虫(Indoxacarb)Λ Fozthiazate、苯线磷(Fenamiphos)、吡丙醚(Pyriproxifen)、苯丁锡(Fenbutatin-oxid):水果 / 蔬菜杀真菌剂:唑啼菌胺(Ametoctradin)、啼菌酯(Azoxystrobin)、苯噻菌胺(Benthiavalicarb)、P定酉先菌胺(Boscalid)、克菌丹(Captan)、多菌灵(Carbendazim)、百菌清(Chlorothalonil )、含铜杀菌剂(Copper)、氰霜唑(Cyazofamid)、环氟菌胺(Cyflufenamid)、霜脲氰(Cymoxanil )、环丙唑醇(Cyproconazole)、啼菌环胺(Cyprodinil )、苯醚甲环唑(Difenoconazole)、烯酸吗啉(Dimetomorph)、臆菌萘(Dithianon)、咪唑菌酮(Fenamidone)、环酸菌胺(Fenhexamid)、氟卩定胺(Fluazinam)、咯菌臆(Fludioxonil)、氟批菌胺(Fluopicolide)、氟吡菌酰胺(Fluopyram)、氟啼菌酯(Fluoxastrobin)、氟唑菌酰胺(Fluxapyroxad)、灭菌丹(Folpet )、福賽得(Fosetyl )、异菌脲(Iprodione)、丙森锌(Iprovalicarb)、吡唑萘菌胺(Isopyrazam)、醚菌酯(Kresoxim-methyl )、代森猛锌(Mancozeb)、双块酉先菌胺(Mandipropamid)、甲霜灵 / 精甲霜灵(Metalaxyl/mefenoxam)、代森联(Metiram)、苯菌酮(Metrafenone)、臆菌唑(Myclobutanil )、戊菌唑(Penconazole)、批噻菌胺(Penthiopyrad)、卩定氧菌酯(Picoxystrobin)、霜霉威(Propamocarb)、戊唑醇(Propiconazole)、甲 代森锋(Propineb)、碘喹唑酮(Proquinazid)、丙硫菌唑(Prothioconazole)λ 吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、啼霉胺(Pyrimethanil)、苯氧喹啉(Quinoxyfen)、螺环菌胺(Spiroxamine)、硫横(Sulphur)、戊唑醇(Tebuconazole)、甲基硫菌灵(Thiophanate-methyl)、勝菌酯(Trifloxystrobin):谷类棺物除草剂:2.4-D、酰啼磺隆(Amidosulfuron)λ 溴苯臆(Bromoxynil )、唑草酮-E (Carfentrazone-E)、氯麦隆(ChlorotoIuron)、氯横隆(Chlorsulfuron)、块草酸-P (Clodinafop-P)、二氯吡卩定酸(Clopyralid)、麦草畏(Dicamba)、禾草灵酸-M (Dielofop-Μ)、吡氟草胺(Diflufenican)、恶禾草灵(Fenoxaprop)、双氟横草胺(Florasulam)、氟酮横隆-NA (Flucarbazone-NA)、氟噻草胺(Flufenacet)、氟 P定啼磺隆-M (Flupyrsulfuron-M)Λ 氟草烟(Fluroxypyr)、呋草酮(Flurtamone)、草甘膦、碘甲磺隆(1dosulfuron)、碘苯腈(1xynil )、异丙隆(Isoproturon)、MCPA、甲横胺横隆(Mesosulfuron)、甲横隆(Metsulfuron)、二甲戊(Pendimethalin)、唑啉草酯(Pinoxaden)、丙苯横隆(Propoxycarbazone)、节草丹(Prosulfocarb)、甲氧横草胺(Pyroxsulam)、横酉先横隆(Sulfosulfuron)、噻横隆(Thifensulfuron)、月亏草酮(Tralkoxydim)、醚苯横隆(Triasulfuron)、苯横隆(Tribenuron)、氟乐灵、三氟甲磺隆(Tritosulfuron):谷类棺物杀真菌齐1丨:嘧菌酯、联苯吡菌胺(Bixafen)、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、环氟菌胺、环丙唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺(Dimoxystrobin)、氟环唑(Epoxiconazole)、苯镑卩定(Fenpropidin)、丁苯吗啉(Fenpropimorph)、氟批菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑(Fluquinconazole )、氟唑菌酰胺、批唑萘菌胺、醚菌酯、叶菌唑(Metconazole )、苯菌酮、吡噻菌胺、唳氧菌酯、咪鲜胺(Prochloraz )、戊唑醇、碘喹唑酮、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、苯氧喹啉、螺环菌胺、戊唑醇、甲基硫菌灵、肟菌酯;谷类植物杀虫剂:乐果(Dimethoate)、高三氟氯氰菊酯(λ -cyhalthrin)、溴氰菊酯、氯氰菊酯、氟氯氰菊酯、联苯菊酯(Bifenthrin)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、唆虫脉(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran)、Clorphyriphos、抗虫牙威(Pirimicarb)、甲硫威、氟啶虫胺腈;玉米除草剂:莠去津、甲草胺(Alachlor)、溴苯腈、乙草胺(Acetochlor)、麦草畏、二氯吡唳酸、二甲吩草胺((S_) Dimethenamid)、草铵膦、草甘膦、异恶唑草酮(Isoxaf Iutole)、精异丙甲草胺(S-Metolachlor)、甲基横草酮(Mesotrione)、烟11密横隆(Nicosulfuron)、氟嘧横隆(Primisulfuron)、玉嘧横隆(Rimsulfuron)、横草酮(Sulcotrione)、甲酸胺石黄隆(Foramsulfuron)、苯吡唑草酮(Topramezone)、环横酮(Tembotrione)、苯嘧横草胺(Saf Iufenacil )、酮服横草吩(Thiencarbazone)、氟噻草胺、Pyroxasulfon ;玉米杀虫剂:克百威、毒死蝶、联苯菊酯、溴氰虫酰胺、氟虫腈(Fipronil)、 批虫啉、高三氟氯氰菊酯、七氟菊酯(16行111:!!!'；[11)、特丁硫磷(16『131^08)、噻虫嗪、可尼丁、螺环菌胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫苯甲酰胺、溴氰菊酯、硫双威、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、联苯菊酯、風螨脲(Lufenuron)、丁基嘧唳磷(Tebupirimphos)、乙虫腈(Ethiprole)、溴氰虫酰胺、噻虫啉、唳虫脒、呋虫胺、阿维菌素(AVermectiη);玉米杀真菌剂:喃菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、环丙唑醇、醚菌胺、氟环唑、种衣酯(Fenitropan)、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、叶菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、戊唑醇、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戍唑醇、厢菌酯:稻除草剂:丁草胺(Butachlor)、敌稗(Propanil)、四唑喃磺隆(Azimsulfuron)、节嘧横隆(Bensulfuron)、氰氟草酯(Cyhalofop)、杀草隆(Daimuron)、四唑酸草胺(Fentrazamide)、咪唑横隆(Imazosulfuron)、苯噻草胺(Mefenacet)、恶嗪草酮(Oxaziclomefone)、吡嘧石黄隆(Pyraz o sulfur on)、稗草畏(Pyribut icarb)、二氯喹啉酸(Quinclorac)、禾草丹(Thiobencarb)、却草酮(Indanofan)>氟噻草胺、四唑酸草胺、氯吡喃磺隆、恶嗪草酮、双环磺草酮(Benzobicyclon)、环酯草醚(Pyriftalid)、五氟磺草胺(Penoxsulam)、双草醚(Bispyribac)、丙炔恶草酮(Oxadiargyl )、乙氧磺隆(Ethoxysulfuron)、丙草胺(Pretilachlor)、甲基横草酮、Tefuryltrione、恶草酮(Oxadiazone)、恶唑禾草灵、Pyrimisulfan:稻杀虫剂:地亚农(Diazinon)、仲丁威(Fenobucarb)、丙硫克百威(Benfuracarb)、噻嗪酮(Buprofezin)、呋虫胺(Dinotefnran)、氟虫腈、吡虫啉、异丙威(Isoprocarb)、噻虫啉、环虫酰肼、可尼丁、乙虫腈、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰菊酯、唳虫脒、噻虫嗪、溴氰虫酰胺、艾克敌、S P i η ο t ο r am、氨基阿维菌素苯甲酸盐、氯氰菊酯、毒死蜱、醚菊酯(EtofenpiOx)、克百威、丙硫克百威、氟啶虫胺腈;稻杀真菌剂:喃菌酯、多菌灵、环丙酰亚胺(Carpropamid)、双氯氰菌胺(Diclocymet)、苯醚甲环唑、敌痕磷(Edifenphos)、嘧菌腙(Ferimzone)、庆大霉素(Gentamycin)、己唑醇(Hexaconazole)、恶霉灵(Hymexazol )、异稻痕净(Iprobenfos, IBP)、稻痕灵(Isoprothiolane)、异噻菌胺(Isotianil )、春雷霉素(Kasugamycin)、代森猛锋、苯氧菌.胺(Metominostrobin)> 月亏醚菌胺(Orysastrobin)、戍菌隆(Pencycuron)、烯丙苯噻唑(probenazole)、戍唑醇、甲代森锌、咯喹酮(Pyroqui1n)、戍唑醇、甲基硫菌灵、噻酰菌胺(TiadiniI)、三环唑(Tricyclazole)、三氟唳磺隆、维利霉素(Validamycin):棉花除草剂:敌草隆、伏草隆(Fluometuron)、MSMA> 乙氧氟草醚(Oxyf luorfen)、扑草净(Prometryn)、氟乐灵、唑草酮、烯草酮(Clethodim)、精批氟禾草灵(Fluazifop-butyl)、草甘膦、氟草敏(Norflurazon)、二甲戍、嘧草硫醚(Pyrithiobac-sodium)、三氟唳磺隆、吡喃草酮(Tepraloxydim)、草铵膦、丙炔氟草胺(Flumioxazin)、噻苯隆(Thidiazuron):棉花杀虫逝:乙酰甲胺磷(Ac印hate)、涕灭威、毒死蝶、氯氰菊酯、溴氰菊酯、阿维菌素、唳虫脒、甲胺基阿维菌素苯甲酸盐(Emamectin Benzoate)、批虫啉、恶二唑虫、高三氟氯氰菊酯、艾克敌、硫双威、Y-氯氟氰菊酯、螺甲螨酯、啶虫丙醚(Pyridalyl)、氟啶虫酰胺、氟虫双酰胺、杀铃脲、氯虫苯甲酰胺、氟氯氰菊酯、螺虫乙酯、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、呋虫胺、氟虫双酰胺、溴氰虫酰胺、艾克敌、Spinotoram、Y氯氟氰菊酯、4_[ [ (6-氯吡啶-3-基)甲基](2，2_ 二氟乙基)氨基]呋喃-2(5H)_酮、硫双威、阿维菌素、氟啶虫酰胺、啶虫丙醚、螺甲螨酯、氟啶虫胺腈；棉花杀真菌剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、含铜杀菌剂、环丙唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、咪唑菌酮、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰(Maneb )、苯氧菌胺、吡噻菌胺、唳氧菌酯、甲代森锌、丙硫菌唑、批唑醚菌酯、五氯硝基苯(Quintozene)、戍唑醇、氟醚唑(Tetraconazole)、甲基硫菌灵、月亏菌酯:大豆除草齐Π:甲草胺、灭草松(Bentazone)、氟乐灵、氯嘧磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯磺草胺(Cloransulam-Methyl)、恶唑禾草灵、氟磺胺草醚(Fomesafen)、批氟禾草灵、草甘膦、甲氧咪草烟(Imazamox)、咪唑喹啉酸(Imazaquin )、咪唑乙烟酸(Imazethapyr )、精异丙甲草胺、嗪草酮、二甲戍、吡喃草酮、草铵膦;大豆杀虫剂:高三氟氯氰菊酯、灭多威(Methomyl)、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、晾虫脒、呋虫胺、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、艾克敌、Spinotoram、氨基阿维菌素苯甲酸盐、氟虫腈、乙虫腈、溴氰菊酯、氟氯氰菊酯、Y和λ氯氟氰菊酯、4-[[(6_氯吡啶-3-基)甲基](2，2-二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5Η)-酮、螺虫乙酯、Spinodiclofen、杀铃脲、氟啶虫酰胺、硫双威、氟氯氰菊酯;大豆杀真菌剂:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、百菌清、含铜杀菌剂、环丙唑醇、苯醚甲环唑、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、粉唑醇(Flutriafol)、氟唑菌酰胺、吡唑萘菌胺、异菌脲、异噻菌胺、代森锰锌、代森锰、叶菌唑、苯氧菌胺、腈菌唑、吡噻菌胺、啶氧菌酯、戊唑醇、甲代森锌、丙硫菌唑、批唑醚菌酯、戍唑醇、氟醚唑、甲基硫菌灵、厢菌酯;甜菜除草剂:氯草敏(Chloridazon)、双苯胺灵(Desmedipham)、乙氧呋草黄(Ethofumesate)、甲双苯胺灵(Phenmedipham)、野麦畏(Triallate)、二氯吡啶酸、吡氟禾草灵、环草定(LenaciI)、苯嗪草酮(Metamitron)、氯甲喹啉酸(Quinmerac)、噻草酮(Cycloxydim)、氟胺横隆(Trif Iusulfuron)、吡喃草酮、喹禾灵(Quizalofop);甜菜杀虫剂:批虫啉、可尼丁、噻虫嗪、噻虫啉、唳虫脒、呋虫胺、溴氰菊酯、β -氟氯氰菊酯、Y / λ氯氟氰菊酯、4-[ [ (6-氯吡卩定-3-基)甲基](2,2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2(5Η)_酮、七氟菊酯、氯虫苯甲酰胺、Cyaxypyr、氟虫腈、克百威;卡诺拉油菜除草剂:二氯吡啶酸、禾草灵酸、批氟禾草灵、草铵膦、草甘膦、批唑草胺(Metazachlor )、氟乐灵、胺苯磺隆(EthaMetsulfuron)、氯甲喹啉酸、喹禾灵、烯草酮、批喃草酮:卡诺拉油菜杀真菌逝:嘧菌酯、联苯吡菌胺、啶酰菌胺、多菌灵、环丙唑醇、嘧菌环胺、醚菌胺、氟环唑、氟啶胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟硅唑(Flusilazole)、氟唑菌酰胺、异菌脲、吡唑萘菌胺、缩节胺(Mepiquat-chloride)、叶菌唑、苯氧菌胺、多效唑(Paclobutrazole )、吡噻菌胺、卩定氧菌酯、咪鲜胺、丙硫菌唑、吡唑醚菌酯、戍唑醇、甲基硫菌灵、I亏菌酯、乙烯菌核利(Vinclozolin)；卡诺拉油菜杀虫剂:克百威、噻虫啉、溴氰菊酯、吡虫啉、可尼丁、噻虫嗪、啶虫脒、呋虫胺、氟氯氰菊酯、Y和入氯氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯(Fluvaleriate)、乙虫腈、艾克敌、Spinotoram、氟虫双酰胺、氯虫苯甲酰胺、溴氰虫酰胺、4_[[(6_氯吡卩定-3-基)甲基](2,2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5H)-酮。
[0111]以下实施例以说明方式且不以限制方式提供。
实施例
[0112]实施例1.Axmi115融合蛋白的设计和测试
[0113]Axmill5描述于美国专利公开20100004176中(氨基酸序列在本文中如SEQ IDN0:43所示)。该基因与Vip3Aa享有70%的序列同源性。Axmill5的经密码子优化形式(在本文中也被称为Axmill5v01，SEQ ID NO:42中所示)利用大肠杆菌表达载体进行克隆和表达。所产生的蛋白在体外生物测定中显示对多种昆虫害虫具有杀虫活性，包括欧洲玉米螟虫(ECB)、螟蛉(CEW)、秋天行军虫(FAW)和小地老虎(BCW)。
[0114]Axmi005也描述于美国专利公开20100004176中。该基因与Vip3Aa享有94%的序列同源性。Axmi005的经密码子优化形式(optAxmi005,在本文中如SEQ ID N0:44所示)利用大肠杆菌表达载体进行克隆和表达。所产生的蛋白在体外生物测定中显示对多种昆虫害虫具有杀虫活性，包括谷实夜蛾(Hz)、烟芽夜蛾(Hv)、FAW、BCW、甘蔗螟虫(SCB)和梨豆毛虫(VBC)
[0115]与Axmi005相比，Axmill5对Hz和FAW的相对活性较低。而且如上面所指出，Axmi005不具有ECB活性。在鉴定负责差异特异性以及两种蛋白活性的结构域的尝试中，如下面所描述制备表达optAxmi005和Axmi 115经密码子优化形式的融合体的构建体,并图示于图1中。在大肠杆菌中表达蛋白，并在体外生物测定中针对EBC、Hz、FAW和BCW进行测试。当与由PAX5477 (Axmill5v01，在本文中如SEQ ID N0:42所示)所表达的蛋白相比时，由pAX6307 (Axmill5v02.01，在本文中如SEQ ID NO:1所示)所表达的蛋白对被测的所有四种害虫显示出增强的活性。
[0116]将pAX6307中表达的基因(Axmill5v02.01)克隆入由甘蔗泛素启动子驱动蛋白表达的植物表达载体PAG6141中。
[0117]对来自表达Axmill5v0UPAxmill5v02.01的转基因植物的叶片样品进行测试，其中在实验室昆虫生物测定中针对EBC、Hz、FAff和BCW，在田间测试中针对EBC、Hz和FAW。结果显示经改良的Axmill5V02.01对所有被测害虫具有较好的效力。
[0118]质粒说明:
[0119]对来源于Vip3Aa、Axmi005、Axmill5v01、Axmi 163 和 Axmil84DNA 序列的娃片(insilico)翻译的氨基酸序列进行比对，以鉴定所有同源物中的保守性氨基酸(Axmil63和Axmi 184也描述于美国专利公开20100004176中)。
[0120]利用pAX5478 (含 有Axmi005的经密码子优化形式，SEQ ID NO: 44中所示)中存在的optAxmi005序列和pAX5477 (含有Axmi115的经密码子优化形式)中存在的optAxmill5序列，针对Axmi005和Axmill5v01的3个保守区设计引物。通过重叠PCR产生3种融合基因(参见图1)。
[0121]将这些PCR反应产生的融合基因的DNA克隆入大肠杆菌表达载体pRSf IB中。所得表达载体显示于表1中。利用已知方法表达蛋白，并在体外生物测定中对大肠杆菌提取物进行测试。
[0122]表1.融合基因构建体
【权利要求】
1.一种重组核酸分子，其包含编码具有杀虫活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:43的C末端部分。
2.权利要求1的重组核酸分子，其中所述C末端部分与SEQID N0:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
3.权利要求1或2的重组核酸分子，其中所述融合多肽包含SEQID NO:45的N末端部分。
4.权利要求1-3任一项的重组核酸分子，其中所述N末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
5.权利要求1、2、3或4的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一项所示的核苷酸序列； b)编码包含SEQID N0:48和15-31任一项所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)编码包含与SEQID NO: 48和15-31任一项所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的杀虫活性相对于SEQ ID NO:43或45的杀虫活性增强或扩大。
6.权利要求1、2、3、4或5的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列是已经设计用于在植物中表达的合成序列。
7.权利要求1、2、3、4、5或6的重组核酸分子，其中所述核苷酸序列与能够指导所述核苷酸序列在植物细胞中表达的启动子可操作性连接。
8.包含权利要求1-7任一项的重组核酸分子的载体。
9.权利要求8的载体，其进一步包含编码异源多肽的核酸分子。
10.含有权利要求1-7任一项的重组核酸或者权利要求8或9的载体的宿主细胞。
11.权利要求10的宿主细胞，其是细菌宿主细胞。
12.权利要求10的宿主细胞，其是植物细胞。
13.包含权利要求12的宿主细胞的转基因植株。
14.权利要求13的转基因植株，其中所述植株选自由玉米、高梁、小麦、甘蓝、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒属植物、马铃薯、棉花、稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油籽油菜组成的组。
15.包含权利要求1-7任一项的重组核酸分子或者权利要求8或9的载体的转基因种子。
16.具有杀虫活性的重组多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:43的C末端部分。
17.权利要求16的重组多肽，其中所述C末端部分与SEQID NO: 43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
18.权利要求16或17的重组多肽，其中所述多肽包含SEQID NO:45的N末端部分。
19.权利要求16-18任一项的重组多肽，其中所述N末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
20.权利要求16、17、18或19的重组多肽，其中所述多肽包含选自由以下组成的组中的氨基酸序列: a)SEQ ID NO: 48和15-31任一项的氨基酸序列； b)与SEQ ID NO: 48和15-31任一项的氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列，其中多肽的杀虫活性相对于SEQ ID N0:43或45的杀虫活性增强或扩大。
21.权利要求16-20任一项的多肽，其进一步包含编码异源氨基酸序列。
22.包含权利要求16-21任一项的多肽的组合物。
23.权利要求22的组合物，其中所述组合物选自由粉剂、尘剂、丸剂、粒剂、喷雾剂、乳剂、胶体、溶液组成的组。
24.权利要求22的组合物，其中所述组合物通过对细菌细胞培养物进行干燥、冻干、匀质化、提取、过滤、离心、沉淀或浓缩而制备。
25.权利要求22的组合物，其包含重量为约1%至约99%的所述多肽。
26.一种用于控制鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类或双翅目害虫的方法，其包括使所述群体与杀虫有效量的权利要求16-22任一项的多肽或者权利要求23、24或25的组合物接触。
27.一种用于杀死鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类或双翅目害虫的方法，其包括使所述害虫接触或者对所述害虫饲喂杀虫有效量的权利要求16-22任一项的多肽或者权利要求23、24或25的组合物。
28.一种用于产生具有杀虫活性的多肽的方法，其包括在编码多肽的核酸分子表达的条件下培养权利要求10的宿主细胞。
29.基因组中稳定整合了包含核酸分子的DNA构建体的植株，所述核酸分子包含编码具有杀虫活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:43的C末端部分。`
30.权利要求29的植株，其中所述C末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
31.权利要求29或30的植株，其中所述融合多肽包含SEQID NO: 45的N末端部分。
32.权利要求29-31任一项的植株，其中所述N末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
33.权利要求29-32任一项的植株，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一项所示的核苷酸序列； b)编码包含SEQID NO:48和15-31任一项所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)编码包含与SEQID NO: 48和15-31任一项所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的杀虫活性相对于SEQ ID NO:43或45的杀虫活性增强或扩大。
34.权利要求29-33任一项的植株，其中所述植株是植物细胞。
35.一种用于保护植株免受害虫的方法，其包括在植株或其细胞中表达核酸分子，所述核酸分子包含编码具有杀虫活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含SEQ IDNO:43的C末端部分。
36.权利要求35的方法，其中所述C末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
37.权利要求35或36的方法，其中所述融合多肽包含SEQID NO: 45的N末端部分。
38.权利要求35-37任一项的方法，其中所述N末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
39.权利要求35-38任一项的方法，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一项所示的核苷酸序列； b)编码包含SEQID NO:48和15-31任一项所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)编码包含与SEQID NO: 48和15-31任一项所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的杀虫活性相对于SEQ ID NO:43或45的杀虫活性增强或扩大。
40.权利要求35-39任一项的方法，其中所述植株产生对鳞翅目、半翅目、鞘翅目、线虫类或双翅目害虫具有杀虫活性的杀虫多肽。
41.一种用于增加植株产量的方法,其包括在田间种植基因组中稳定整合了包含核酸分子的DNA构建体的植株或其种子，所述核酸分子包含编码具有杀虫活性的融合多肽的核苷酸序列，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:43的C末端部分。
42.权利要求41的方法，其中所述C末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
43.权利要求41或42的方法，其中所述融合多肽包含SEQID NO:45的N末端部分。
44.权利要求41-43任一项的方法，其中所述N末端部分与SEQID NO:43的约第174位氨基酸至约第803位氨基酸或者其变体或片段相对应。
45.权利要求41-44任一项的方法，其中所述核苷酸序列选自由以下组成的组: a)SEQ ID NO: 47 1_14任一项所示的核苷酸序列； b)编码包含SEQID NO:48和`15-31任一项所示氨基酸序列的多肽的核苷酸序列； c)编码包含与SEQID NO: 48和15-31任一项所示氨基酸序列具有至少95%序列一致性的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列，其中融合多肽的杀虫活性相对于SEQ ID NO:43或45的杀虫活性增强或扩大。
【文档编号】C12N15/82GK103635579SQ201280027517
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2012年4月4日 优先权日:2011年4月5日
【发明者】D·莱特宁, N·M·德塞, V·海恩瑞奇斯 申请人:阿森尼克斯公司