基于砗磲线粒体16S基因扩增引物及其应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，涉及一种基因扩增引物，尤其涉及一种基于砗磲线粒体16S基因扩增引物以及应用在鉴定砗磲物种。

背景技术：

砗磲的闭壳肌和足块很肥大，是味鲜质优的烹饪原料；在中医药中，砗磲贝的贝壳被认为与珍珠具有同样的疗效；砗磲的观赏价值主要在于两个方面，一是以贝壳为原材料的各种贝雕、珠链等，一是活体砗磲；砗磲与其他贝类相似，在偶尔受到异物的寄生或者刺激时也能生成珍珠；在当今佛教界流行的宝石种类中可作为驱邪避凶的宝石应首推“佛教七宝”；砗磲在海洋中扮演着非常重要的角色，是评价珊瑚礁生态是否健康的重要指标之一。近年来由于各地滥捕，造成砗磲资源锐减，今后应采取措施保护有限野生资源，并开展砗磲的基础生物学及人工养殖技术研究，发展砗磲养殖业,以满足人们的消费需求，砗磲将是一种非常有养殖前景的海洋经济贝类。

砗磲隶属于双壳纲，异齿亚纲，帘蛤目，是海洋中最大的双壳贝类。截至目前发现并命名的有2个属共10种，主要分布在太平洋和印度洋，我国有六种，分布在台湾和南海，我国重点保护水生野生动物名录里将库氏砗磲列为一级国家保护海洋生物。

利用形态特征对砗磲进行物种鉴定和系统发育的分析变得异常困难，特别对于一些近缘物种，单利用形态特征很难区分开来。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种基于砗磲线粒体16S基因扩增引物，通过PCR扩增特异16S片段来鉴别砗磲种类。对比分析美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GenBank数据中已有的砗磲16S序列并设计特异性引物，通过重复试验，确定了可以鉴别砗磲物种的反向引物，并找出最佳反应条件。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：提供基于砗磲线粒体16S基因扩增引物：

F:GGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATG

Tri_squ_YZ_R(鳞砗磲引物):TCTAAGTATAATGGATCTTTGCAT

Tri_max_YZ_R(长砗磲引物):CATTTACTAAATATTCAAATCCCTC

Tri_gig_YZ_R(库氏砗磲引物):TCTCTTTCTAATGGATCTTTGCTT

Tri_cro_YZ_R(番红砗磲引物):TCTTAGATAAAATGGATCTATGCGC

Hip_hip_YZ_R(砗蚝引物):CTTCTAACGGTTTTACAACATTAGA。

采用本发明的砗磲线粒体16S基因扩增引物，可以迅速，准确的鉴别出砗磲物种。

附图说明

图1为砗蚝实物图；

图2为图1砗磲的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为鳞砗磲实物图；

图4为图3砗磲的琼脂糖凝胶电泳图；

图5为番红砗磲实物图；

图6为图5砗磲的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明的砗磲线粒体16S基因扩增引物的筛选方法采用四个步骤：a、在美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载我国已有的砗磲科序列，如序列表中的序列所示；并根据砗磲科序列设计引物；b、通过PCR筛选出能较好扩增16S基因的正向引物；c、从上述得到的砗磲序列中，通过比对找出特异性序列片段设计引物；d、利用设计的特异性引物进行PCR，对砗磲物种的鉴别。

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

1.样品采集：于2015年～2016年，从中国南北沿海共采集砗磲2个属6个种类的50个个体。

2.在美国国立生物技术信息中心(NCBI，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上下载已有的5种砗磲16S序列:番红砗磲、大砗磲、鳞砗磲、长砗磲、砗蚝。

3.DNA提取：用天根海洋动物组织DNA提取试剂盒提取砗磲的DNA。

4.找到扩增16S较好的正向引物：通过NCBI，找到在我国分布的五种砗磲的16S基因序列，设计了砗磲科的引物(说明：由于无鳞砗磲和其它砗磲具有明显的不同，无需通过分子手段进行区别)。选取部分采集的砗磲个体通过正反引物两两组合进行PCR扩增，PCR热循环退火温度范围为55℃，由1％琼脂糖凝胶电泳比挑选出较好的F。

5.结合特异性反向引物鉴别砗磲物种：

通过比对序列设计验证不同砗磲的引物，针对特异性序列设计反向引物如下：

Tri_squ_YZ_R(鳞砗磲引物):TCTAAGTATAATGGATCTTTGCAT

Tri_max_YZ_R(长砗磲引物):CATTTACTAAATATTCAAATCCCTC

Tri_gig_YZ_R(库氏砗磲引物):TCTCTTTCTAATGGATCTTTGCTT

Tri_cro_YZ_R(番红砗磲引物):TCTTAGATAAAATGGATCTATGCGC

Hip_hip_YZ_R(砗蚝引物):CTTCTAACGGTTTTACAACATTAGA，

通过反向引物R和F组合，PCR热循环退火温度范围为60℃，扩增产物用1％的琼脂糖电泳进行检测。

6.验证引物扩增条件：上述F与验证R扩增引物的50μL PCR反应体系为：

反应条件:(三步法)

98℃10sec，60℃5sec，72℃30sec，循环35圈。

7.验证引物扩增结果：取砗磲进行验证，如说明书附图2、4、6琼脂糖凝胶电泳图所示，左边第一个孔为2000Marker，第二孔到第六个孔分别对应的反向引物为，Tri_gig_YZ_R(库氏砗磲引物)，Hip_hip_YZ_R(砗蚝引物)，Tri_max_YZ_R(长砗磲引物)，Tri_squ_YZ_R(鳞砗磲引物)，Tri_cro_YZ_R(番红砗磲引物)。

图1所示的砗磲通过提取DNA后，进行PCR，结果如说明书附图2所示，从图2的琼脂糖凝胶电泳图可以看出第三个孔有明显亮带，因此可以证明该砗磲是砗蚝。

图3所示的砗磲通过提取DNA后，进行PCR，结果如说明书附图4所示，从图4的琼脂凝胶电泳图可以看出第五个孔有明显亮带，因此可以证明该砗磲是鳞砗磲。

图5所示的砗磲通过提取DNA后，进行PCR，结果如说明书附图6所示，从图6的琼脂凝胶电泳图可以看出第六个孔有明显亮带，因此可以证明该砗磲是番红砗磲。

因此，采用本发明的砗磲线粒体16S基因扩增引物，可以迅速，准确的鉴别出砗磲物种。

以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 海南大学

<120> 基于砗磲线粒体16S基因扩增引物及其应用

<130> 2016

<160> 12

<210> 1

<211>345

<212>DNA

<213>Tridacna_squamosa （鳞砗磲）

<400> 1

CCTTAAAGTA GCGTGATAAG TCGGCCTTTA ATTGGGGTCT GGTATGAAAG GGTTGACGTC 60

GGAAAAACTG TCTCGGAAGA ACTAAGTGAA ATTTACTTTT AAGTGAAAAG GCTTAAATTA 120

AAGTAAAAGA CGAGAAGACC CTGTCGAGCT TGAGGGATTT GAATGTTTAT TAAACGTGAT 180

TAGGAGTTTG GCTGGGGCAG CAATGGAGAT ACCCTCCGTT TTTAATGCAA AGATCCATTA 240

TACTTAGAAT AATGAAAAAA GAAAAAAGCT ACCGCAGGGA TAACAGCACA AGACCGCCTC 300

AGAGGTCGTA TCGAAGGCGG TAAGTGTGAC CTCGATGTTG GATTA 345

<210> 2

<211>491

<212>DNA

<213> Tridacna derasa （无鳞砗磲）

<400> 2

AAAACATCTC TTCTAGAACT ATATTAGAAG TAGGCCCTGC CCGGTGCCCT GCGGGGTTAA 60

CGGCGGTGTT AAGCCTTAAA GTAGCGTGAT AAGTTGGCCT TTAATTGGGG TCTGGTATGA 120

AGGGGTTGAC GTCGGAGAAA CTGTCTCGGA AAGATAAAAT GAAATTTACG TCCTAGTGAA 180

AAGGCTGGGA TGGCTGTAAA AGACGAGAAG ACCCTGTCGA GCTTGAGGGA TATGAATGTT 240

TTAACAACAT GATTAGGAGT TTGGCTGGGG CAGCAATGGA GGTAGCCTCC ATTTTTAAAG 300

CAAAGATCCA TTAGAAAGAG ATAATGATAA AAGGAAAAAG TTACCGCAGG GATAACAGCA 360

CAAGACCGCC TCAGAGGTCG TATCGAAGGC GGTGAGTGTG ACCTCGATGT TGGATTAGGG 420

TGAACCCTTT CGTGCAGGAG CGAAAGTTGG TGGGACTGTT CTTCCTTTAA TACCCTACAT 480

GATCTGAGTT C 491

<210> 3

<211>503

<212>DNA

<213> Tridacna maxima （长砗磲）

<400> 3

CGCCTGTTTA TCAAAAACAT CTCTTCTAGC ATGATATTAG AAGTAGGCCC TGCCCGGTGC 60

CTTGCGAGGT AAACGGCGGT GTTAAACCTT AAAGTAGCGT GATAAGTCGG CCTTTAATTG 120

GGGTCTGGTA TGAAGGGGTT GACGTCGGAA AAACTGTCTC AGAAAAATTA AATGAAATTT 180

ACTTTTAAGT GAAAAGGCTT AAATGAGAGT AAAAGACGAG AAGGCCCTGT CGAGCTTGAG 240

GGATTTGAAT ATTTAGTAAA TGTGATTAGG AGTTTGGCTG GGGCAGCAAT GGAGATAGCC 300

TCCGTTTTTA AAGCAAAGAT CCATTATGTT CAAGATAATG AAAAAGGAAA AAGCTACCGC 360

AGGGATAACA GCACAAGACC GCCTCAGAGG TCGTATCGAA GGCGGTAAGT GTGACCTCGA 420

TGTTGGATTA GGGTAAACCT CTTTGTGCAG GAGCAAAGTG GGTAGGACTG TTCTTCCTTT 480

AATCCCCTAC ATGATCTGAG TTC 503

<210> 4

<211>500

<212>DNA

<213> Tridacna gigas （库氏砗磲）

<400> 4

TCGCCTGTTT TTCAAAAACA TCTCTTCTAG AACTATATTA GAAGTAGGCC CTGCCCGGTG 60

CCCTGCGGGG TTAACGGCGG TGTTAAGCCT TAAAGTAGCG TGATAAGTTG GCCTTTAATT 120

GGGGTCTGGT ATGAAGGGGT TGACGTCGGA GAAACTGTCT CGGAAAGATA AAATGAAATT 180

TACGTCCTAG TGAAAAGGCT GGGATGGCTG TAAAAGACGA GAAGACCCTG TCGAGCTTGA 240

GGGATATGAA TGTTTTAACA ACATGATTAG GAGTTTGGCT GGGGCAGCAA TGGAGGTAGC 300

CTCCATTTTT AAAGCAAAGA TCCATTAGAA AGAGATAATG ATAAAAGGAA AAAGTTACCG 360

CAGGGATAAC AGCACAAGAC CGCCTCAGAG GTCGTATCGA AGGCGGTGAG TGTGACCTCG 420

ATGTTGGATT AGGGTGAACC CTTTCGTGCA GGAGCGAAAG TTGGTGGGAC TGTTCTTCCT 480

TTAATACCCT ACGTGATCTG 500

<210> 5

<211>504

<212>DNA

<213> Tridacna crocea （番红砗磲）

<400> 5

TCGCCTGTTT ATCAAAAACA TCTCTTCTAG TATGATATTA GAAGTAGGCC CTGCCCGGTG 60

CCTTGCGAGG TAAACGGCGG TGTTAAACCT TAAAGTAGCG TGATAAGTCG GCCTTTAATT 120

GGGGTCTGGT ATGAAAGGGT TGACGTCGGA AAAACTGTCT CGGAAGAATT AAGTGAAATT 180

TACTTTTAAG TGAAAAGGCT TAAATTAAAG TAAAAGACGA GAAGACCCTG TCGAGCTTGA 240

GGGATTTGAA TGTTTATCAA ACGTGATTAG GAGTTTGGCT GGGGCAGCAA TGGAGGTAGC 300

CTCCGTTTTT AGCGCATAGA TCCATTTTAT CTAAGATAAT GAAAAAAGAA AAAAGCTACC 360

GCAGGGATAA CAGCACAAGA CCGCCTCAGA GGTCGTATCG AAGGCGGTAA GTGTGACCTC 420

GATGTTGGAT TAGGGTAAAC CTCTTTGTGC AGGAGCAAAG CGGGTAGGAC TGTTCTTCCT 480

TTAATCCCCT ACATGATCTG AGTT 504

<210> 6

<211>450

<212>DNA

<213> Hippopus hippopus （砗蚝）

<400> 6

GAAGTATACT GGAAGTAGGC CCTCGCCCGG TGCCCTGCGG GGTTAACGGC GGTGTTAAAC 60

CTTAAAGTAG CGTGATAGAT TGGCCTTTAA TTGGGGTCTG GTATGAATGG GTTGACGTCG 120

GAAATGCTGT CTCAAAAAAA TATAATGAAA TTTACTTTTC AGTGAAAAGG CTGAAATTTG 180

AGTAAAAGAC GAGAAGACCC TATCGAGCTT GAGGGATTCT AATGTTGTAA AACCGTTAGA 240

AGGAGTTTGG CTGGGGCAGC AACGGAGGTA ACCTCCGTTT TTAAGTCGAA GATCCATTAG 300

ATTGGTTAAT GATAAGAGGA AAAAGTTACC GTAGGGATAA CAGCACCAGA CCGCCTCAGA 360

GGCCGTATCG AAGGCGGAAG GTGTGACCTC GATGTTGGAT CACGGTGAAC CGCATGGTGC 420

AGGAGCTATG CAGGTGGGAG TGTTCTTCCT 450

<210> 7

<211>24

<212>DNA

<213> 正向引物

<400> 7

F: GGCCTTTAATTGGGGTCTGGTATG

<210> 8

<211>24

<212>DNA

<213>鳞砗磲引物

<400> 8

TCTAAGTATAATGGATCTTTGCAT

<210> 9

<211>25

<212>DNA

<213>长砗磲引物

<400> 9

CATTTACTAAATATTCAAATCCCTC

<210> 10

<211>24

<212>DNA

<213>库氏砗磲引物

<400> 10

TCTCTTTCTAATGGATCTTTGCTT

<210> 11

<211>25

<212>DNA

<213>番红砗磲引物

<400> 11

TCTTAGATAAAATGGATCTATGCGC

<210> 12

<211>25

<212>DNA

<213>砗蚝引物

<400> 12

CTTCTAACGGTTTTACAACATTAGA