专利名称：：一种用gdf5基因预示和鉴定秦川牛体尺大小的分子标记方法
技术领域：
：本发明属于动物分子遗传学领域，特别是涉及一种用GDF5基因预示和鉴定秦川牛体尺大小的分子标记方法，该方法能够检测秦川牛体长和腰角宽，为培育肉牛新品种提供了新的方法。
背景技术：
：秦川牛产于陕西省渭河流域关中平原地区，因"八百里秦川"而得名。以东起渭南、蒲城，西至扶风、歧山等15个县市为主产区，为中国五大良种黄牛之一。秦川牛以其抗逆性强、耐粗饲、肉质好而闻名于世，被誉为"国之瑰宝"。体尺大小是决定品种优劣和生产性能高低的重要指标，而且研究牛体尺大小已经成为一个突出的问题。在长期的选育过程中，随着秦川牛从役用到现在的肉役兼用，一部分体形较小的个体已经遭到淘汰，但选育较大体形秦〗11牛个体仍是秦j11牛肉用选育的重要目标。生长分化因子5(Growthdifferentiatefactor5，GDF5)，也被称为软骨形态发生蛋白1(cartilage-derivedmorphogeneticprotein1，CDMP1)，是转化生长因子b(transforminggrowthfactor-b，TGF-b)基因家族中的一员，其作用与骨形态发生蛋白(bonemorphogeneticproteins,BMPs)紧密相关(Miyamoto等，2007)。在人和小鼠上许多研究证实(Luyten等，1997;Francis-West等，1999;Edwards等，2001;Mikic等，2004;Nickel等，2005;Harada等，2007;Asuya等，2007)，GDF5主要作用于机体内骨、软骨、腱、关节内韧带发生和生长及以后的维持，对于机体形态大小具有决定左右。、体尺大小是一个复杂的性状，它受到基因和不同环境因素(包括日常进食和出生前环境)共同影响，通过遗传力估计，大约80%以上在体尺大小的变异由遗传学决定。GDF5基因被发现在人的身高、坐高及其他体形指标方面有着明显的作用(Weedon等2008;Sanna等，2008;Lettre等，2008;Southam等，2007)，它与成人、幼儿、胚胎及组织的骨骼形成和生长有着紧密联系(Chang等，1994;Chujo等，2006)。2006年，Chujo等研究发现通过增加临时细胞基质来保持和修复脊椎骨长度，从而在兔子上建立了脊椎骨长度退化模型。1994年，Chang等研究发现GDF5在长骨的原始软骨中显著表达，而在椎骨和肋骨中很少表达；少量的表达将会导致四肢骨的生长受阻，影响机体的体形大小；进而减少了GDF5基因的转录，影响脊椎骨、四肢骨及连接关节等的生长，造成身材变小。同年，Voight等研究报道GDF5和UQCC基因己经被发现作为身高等体形指标的重要候选基因。综上所述，国内外大量的研究报道都证实了GDF5基因可以用来预示和鉴定人的身高和坐高，鉴于此，申请人在GDF5基因作为预示和鉴定秦川牛体长和腰角宽的候选基因方面进行了研究。以下是和本申请相关的参考文献MiyamotoY.，MabuchilA.，ShiD.Q.，KuboT.，TakatoriY.，SaitoS.，FujiokaM.，SudoA.，UchidaA.，YamamotoS.，OzakiK.，TakigawaM.，TanakaT.，NakamuraY.，JiangQ.，IkegawaS.(2007)Afunctionalpolymorphisminthe5，UTRofGDF5isassociatedwithsusceptibilitytoosteoarthritis.Nat.Genet.，39，529-533。LuytenF.P.(1997)Cartilage-derivedmorphogeneticprotein-1.Int.J.Biochem.CellBiol.，29，1241-1244。Francis-WestP.H.，AbdelfattahA.，ChenP.，AllenC.，ParishJ.，LadherR.，AllenS.，MacPhersonS.，LuytenF.P.，ArcherC.W.(1999)MechanismsofGDF-5actionduringskeletaldevelopment.Development.，126，1305-1315。EdwardsC丄，Frances-WestP.H.(2001)Bonemorphogeneticproteinsinthedevelopmentandhealingofsynovialjoints.SeminArthritisRheu.,31，33-42。MikicB.(2004)MultipleeffectsofGDF5deficiencyonskeletaltissues,implicationsfortherapeuticbioengineering.Ann.Biomed.Eng.,32，466-476。NickelJ.，KotzschA.，Se固W.，MuellerT.D.(2005)AsingleresidueofGDF5definesbindingspecificitytoBMPreceptorIB.J.Mol.Biol.，349，933-947。HaradaM.，TakaharaM.，ZheP.，OtsujiM.，IuchiY.，TakagiM.，OginoT.(2007)Developmentalfailureoftheintra-articularligamentsinmicewithabsenceofgrowthdifferentiationfactor5.OsteoarthrilisCartilage,j_J^468-474。MasuyaH.，NishidaK.，FuruichiT.，TokiH.，NishimuraG.，KawabataH.，YokoyamaH.，YoshidaA.，TominagaS.，NaganoJ.(2007)Anoveldominant-negativemutationinGdf5generatedbyENUmutagenesisimpairsjointformationandcausesosteoarthritisinmice.HumMolGenet.，16，2366-2375。WeedonM.N.，LangoH.，LindgrenC.M.，WallaceC.，EvansD.M.，ManginoM.，FreathyR.M.，PerryJ.R.B.，StevensS.，HallA.S.，SamaniN.J.，ShieldsB.，ProkopenkoI.，FarrallM.，DominiczakA.，JohnsonT.，BergmannS.，BeckmannJ.S.，VollenweiderP.，WaterworthD.M.，MooserV.，PalmerC.N.A.，MorrisA.D.，OuwehandW.H.，CaulfieldM.，MunroeP.B.，HattersleyA.T.，McCarthyM丄，FraylingT.M.(2008)Genome-wideassociationanalysisidentifies20locithatinfluenceadultheight.Nat.Genet.，40，575-583。SannaS.，JacksonA.U.，NagarajaR.，WilierC.J.，ChenW.M，BonnycastleL丄.，ShenH.Q.，TimpsonN.，LettreG.，UsalaG.，ChinesP.S.，StringhamH.M.，ScottL.J.，DeiM.，LaiS.，AlbaiG.，CrisponiL.，NaitzaS.，DohenyK.F.,PughE.W.，ShlomoY.B.，EbrahimS.，LawlorD.A.，BergmanR.N.，WatanabeR.M.，UdaM.，TuomilehtoJ.，CoreshJ.，HirschhomJ.N.，ShuldinerA.R.，SchlessingerD.，CollinsF.S.，SmithG.D.，BoerwinkleE.，CaoA.，BoehnkeM.，AbecasisG.R.，MohlkeK丄.(2008)CommonvariantsintheGDF5-UQCCregionareassociatedwithvariationinhumanheight.Nat.Genet.,40，198-203。[11]LettreG.A.，JacksonA.U.，GiegerC.，SchumacherF.R.，BemdtS丄,SannaS.,EyheramendyS.，VoightB.F.，ButlerJ丄.，GuiducciC.，IlligT.,HackettR.，HeidI.M.，JacobsK.B.，LyssenkoV.,UdaM.，BoehnkeM.,ChanockS丄，GroopL.C,,HuF.B.，IsomaaB.,KraftP.，PeltonenL,SalomaaV.，SchlessingerD.，HunterD丄，HayesR.B.，AbecasisG.R.，WichmannH.E.,MohlkeK.L.，HirschhomJ.N.(2008)Identificationoftenlociassociatedwithheighthighlightsnewbiologicalpathwaysinhumangrowth.Nat.Genet.,40，584-591。SouthamL.，Rodriguez-lopezJ.,WilkinsJ.M.，Pombo-suarezM.，SnellingS.，Gomez-reinoJ丄,CharpmanK.，GonzalezA.,LoughlinJ.(2007)AnSNPinthe5-UTRofGDF5isassociatedwithosteoarthritissusceptibilityinEuropeansandwithinvivodifferencesinallelicexpressioninarticularcartilage.Hum.Mol,Genet.,16，2226~2232。ChangS.C.,HoangB.，ThomasJ.T.，VukicevicS.，LuytenF.P.，RybaN丄，KozakC.A.，ReddiA.H,，MoosM.(1994)Cartilage-derivedmorphogeneticproteins.Newmembersofthetransforminggrowthfactor-bsuperfamilypredominantlyexpressedinlongbonesduringhumanembryonicdevelopment.J.Biol.Chem.，269，28227-28234。ChujoT.，AnhowardS.，AkedaK.，MiyamotoK.,MuehlemanC.，AttawiaM.，AnderssonG.，MasudaK.(2006)Effectsofgrowthdifferentiationfactor-5ontheintervertebraldisc—invitrobovinestudyandinvivorabbitdiscdegenerationmodelstudy-Spine.，31，2909-2917。VoightB.F.，KudaravalliS.，WenX.,PritchardJ.K.(2006)Amapofrecentpositiveselectioninthehumangenome,PLoSBioL,4，1-12。
发明内容本发明的主要目的是提供一种分子生物学技术，即采用PCR-RFLP方法来检测秦川牛基因型，从而预示和鉴定秦川牛体尺大小的分子标记方法。本发明的目的是按照以下步骤实现的步骤一，根据牛GDF5基因序列设计一对引物GDFF和GDFR:GDFF:5TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3，(如序列表中序列2所示)GDFR:5'GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3，(如序列表中序列3所示)步骤二，利用该引物对牛的基因组DNA进行PCR扩增，得到由GDFF和GDFR表示的引物扩增的第一外显子区和第一内含子区的扩增片段，该扩增片段的长度为235bp;步骤三，利用限制性内切酶MvaI消化扩增的PCR产物；步骤四，使用2.5%的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出GDF5基因外显子1的586位点处的T/C变异位点；步骤五，通过T/C变异位点检测碱基的突变，并根据基因多态性部位分成以下3种基因型当牛GDF5基因外显子1的586位点处的变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶MvaI的酶切位点(CCATGG),MvaI消化PCR产物后会产生的2个片段(181bp和54bp)，将其命名为CC基因型；当牛GDF5基因外显子1的586位点处的变异位点为T碱基(CTTGG)时，则不存在MvaI酶切位点，MvaI消化PCR产物后只有1个片段(235bp)，将其命名为TT基因型或野生型；当牛GDF5基因外显子1的586位点处的变异位点为T/C杂合时，MvaI消化PCR产物后会产生3个片段(235bp、181bp和54bp)，将其命名为TC基因型。本发明分析基因多态性的方法所带来的技术效果是1、通过检测碱基的突变而分类的基因型。2、其中用于分析基因多态性的部位是外显子。3、其中用于分析基因多态性的序列片段是由GDFF和GDFR表示的引物扩增的第一外显子区和第一内含子区。4、其中分析多态性的位点选择已知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的碱基突变GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC5、秦川牛的体尺大小包括体长和腰角宽。6、用于消化PCR产物的限制性内切酶是MvaI。经实验证明，具有TT基因型个体的体长和腰角宽明显低于具有CC基因型个体的体尺大小(P<0.05)。在申请人所研究的2个群体中，具有TT基因型个体的体长比CC基因型个体的体长低5.64cm6.87cm;具有TT基因型个体的腰角宽比CC基因型个体的腰角宽低3.46cm4.00cm。本发明巧妙地采用PCR—RFLP的方法检测秦川牛GDF5基因外显子1中T/C变异位点。本发明操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。使用本发明的标记基因型对秦〗11牛体尺进行选择时，将使决定秦711牛胴体大小最主要两个性状体长和腰角宽分别提高6.2cm和3.7cm左右。我国现有150多万头秦川牛及其改良牛，如果每头牛体长和腰角宽分别提高57cm和34cm，则每头牛将会增加体积约1500cm3，秦川牛总体增加2000多吨的牛肉，对于培育肉用秦川牛来说无疑是一个极大的优势，而且可以带来显著的经济效益。如果将其推广至其他中国良种黄牛，将为中国养牛业带来广阔的发展前景和利润空间。总之，该研究发现的标记可以用于秦川牛生长性状的标记辅助选择，有着重要的生产意义，为培育肉牛新品种提供了新的方法。图1是牛GDF5基因MvaI酶切位点的凝胶电泳分析图，图中，TT基因型仅表现235bp条带；TC基因型，表现235bp、181bp和54bp条带；CC基因型表现181bp和54bp条带。54bp条带在2.5X凝胶中没有表现，但不影响整个分型。以下结合具体实验和发明人给出的具体实施例对本发明作更详细的描述。具体实施例方式一、实验材料1.实验动物和性状测定本实验选取陕西省秦川肉牛良种繁育中心、陕西渭南山川集团秦川牛良种养殖场和陕西秦宝牧业有限公司秦川牛养殖场提供的成年秦川牛393头和秦川改良牛240头，共计633头个体实验牛。实验牛均由颈静脉采血10mL，加ACD摇匀抗凝(血液:ACD-6:1)，-20°C冻存，并测定实验牛体长和腰角宽指标。牛体长指牛肩端前缘到臀端后缘的直线距离。牛腰角宽指牛两腰角外缘的距离。2.药品和酶三羟甲基氨基甲垸(Tris)，Tris饱和酚和十二烷基磺酸钠(SDS)均为北京鼎国生物技术发展中心产品；蛋白酶K(ProteinaseK)、10xPCRbuffer、dNTPs、100bpmarker和TaqDNA聚合酶为大连宝生物公司产品；琼脂糖购自北京普博生物技术有限公司；内切酶MvaI为美国MBI公司产品。3.主要仪器GradientCyclerPTC-200基因扩增仪、TFM-40紫外可见光成像系统、SZX-ZP超净工作台、DYY-m型电泳仪及配套电泳槽、Eppendorf5810R台式高速室温离心机(德国)、BECKMAN冷冻离心机、AB204-E型电子天平、MiLLi-Q超纯水仪和、日本松下微波炉及Eppendorf移液器等。二、实验方法1、缓冲液与常规试剂的配制(1)10%SDS:10gSDS溶入90mL水中，加热至60。C助溶，加几滴浓HCl调节pH至7.2，定容至100mL。(2)1mol/LTris'HCl(pH8.0):12.114gTris溶入80mL水中，用浓HCl调pH至8.0，加水定容至100mL，高压灭菌。(3)0.5mol/LEDTA(pH8,0):18.61gNa2EDTA'2H20溶入80mL水中，加NaOH2g左右调pH至8.0，定容至100mL，高压灭菌。(4)2mol/L的NaCl:11.688g溶于水，定容至100mL，高压灭菌。(5)DNA提取液(100mL):1mol/LTris'Cl(pH8.0)lmL，0.5mol/LEDTA(pH8.0)20mL，2mol/L的NaCl5mL，定容至100mL。(6)20mg/mL蛋白酶K:20mg蛋白酶K溶入1mL灭菌超纯水中，按200nL分装储存于-20'C。(7)3mol/L乙酸钠40.81g三水乙酸钠(NaAc'3H20)溶于70mL水中用冰乙酸调pH至5.2，加水定容至100mL，高压灭菌。(8)50xTAE(忙存液)242gTris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol/LEDTA(pH=8.0),加双蒸水定容至1L。工作液为"TAE。(9)抗凝剂ACD:柠檬酸0.48g、柠檬酸钠1.32g、葡萄糖1.47g，定容100mL水中，高压灭菌。每6mL的血液中加入lmL的ACD液。(10)PBS:在800mL蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2PO4，用HCl调节pH值到7.4，加水定容到1000mL，高压灭菌20min,室温保存。2、引物的设计与合成以下引物由上海英骏生物技术有限公司合成GDFF:5'TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3，GDFR:5，GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3'3、牛基因组DNA的小量提取(1)冷冻血样室温解冻，吸取lmL血液于2mL灭菌离心管中，加入等体积的磷酸缓冲液(PBS)混匀，温和摇动10min，4°C，12000r/min离心10min，弃上清液，重复上述步骤至上清液透明、沉淀呈透明色。(2)离心管中加入DNA抽提缓冲液lmL，轻轻吹打使血细胞沉淀脱离离心管壁。(3)加蛋白酶K至终浓度为60pg/mL，混匀，55X:水浴中消化过夜(12-16h)至絮状沉淀不见，溶液澄清。(4)反应液冷却至室温，加入等体积Tris饱和酚，温和摇动10min，使其充分混匀，4°C，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管，重复上述步骤l次。(5)加入等体积Tris饱和酚氯仿异戊醇(25:24:1)，温和摇动10min，使其充分混匀，4°C,12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管。(6)加入等体积氯仿，温和摇动10min，使其充分混匀，4°C，12000r/min离心10min，将上层水相转入另一灭菌离心管。(7)加入2倍体积预冷无水乙醇(-20。C)，在-20。C放置30min后，轻轻颠倒试管使DNA呈絮状沉淀。4°C，12000r/min离心8min，弃去乙醇。(8)加入预冷的70%乙醇lmL，温和摇动10min，4°C，12000r/min离心5min漂洗DNA沉淀，4°C，12000r/min离心10min，弃上清液，重复该步骤2次。室温下使乙醇挥发干净。(9)加入200nLTE溶解DNA，4。C保存直至DNA完全溶解。4、PCR反应(1)以牛DNA为模板进行PCR扩增，15pL反应体系中包含以下溶液或试剂10xPCRbuffer1.5dNTPMixture(各2.5mM)0.8pL引物1(20pM)0.5nL引物2(20pM)0.5nLTaqDNA聚合酶(5U尔L)0.15基因组DNA(100ng/pL)1.0pL加灭菌蒸馏水至15(2)将上述溶液混合并按以下条件进行PCR反应。95°C，预变性5min;94°C，变性30sec，60°C，复性30sec，72。C延伸30sec，32个循环；72。C延伸10min。(3)反应结束后，取PCR反应液(5nL)进行琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物。5、PCR-RFLP反应体系及条件酶切体系如下Mval内切酶(lOU/pL)0.4pL10xbuffer0.6PCR产物4.0pL加灭菌蒸馏水至10)LiL将上述反应混合液混匀，于37"C培养箱中消化810小时。6、琼脂糖凝胶电泳检测将消化之后的全部反应液进行2.5%琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物酶切片段多态性。7.统计模型建立根据群体特点，构建线性模型如下Y=//+G;+S/+Bp*+Ma,+s碑，Y^—性状观察值，//一群体平均值，G,—基因型固定效应，S,—性别固定效应，BpA—种场群固定效应，Ma,—测量年龄效应，e^—随机误差。使用统计软件SAS中的GLM程序，使用最小二乘方法检验基因型与性状间的相关程度。以下是发明人给出的实施例。实施实例1:牛GDF5基因多态性与秦川牛群体体尺性状的相关利用本发明的引物(GDFF和GDFR)对秦川牛群体393个个体的基因组DNA进行PCR扩增，并利用MvaI限制性内切酶消化PCR产物，然后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳分析。在秦川牛群体中共检测到3种基因型，当牛GDF5基因外显子1中变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶MvaI的酶切位点(CCATGG)，MvaI消化PCR产物后会产生2个片段(181bp和54bp)，将其命名为CC基因型；该位点为T碱基(CTTGG)时，则不存在MvaI酶切位点，MvaI消化PCR产物后只有l个片段(235bp)，将其命名为TT基因型(野生型)；该位点为T/C杂合时，MvaI消化PCR产物后会产生3个片段(235bp、181bp和54bp)，将其命名为TC基因型(附图)。分析多态性的位点选择己知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的碱基突变GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150CACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC235对GDF5基因T/C变异位点产生的3种基因型与秦川牛群体393个个体的体长和腰角宽进行分析，结果表明基因型对秦川牛群体的体长和腰角宽有显著影响(P<0.05)，TT基因型个体的体长和腰角宽显著低于TC和CC基因型个体的体长和腰角宽(P<0.05)，具有TT基因型个体的的体长和腰角宽比CC基因型个体的体长和腰角宽分别低6.87cm和4.00cm(表1)。表1GDF5基因不同基因型对秦川牛群体体长和腰角宽性状的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>均值比较时同一列无相同字母者差异显著(abP<0.05)a=(TT—CC)/2;d=TC—(TT+CC)/2;D:显性度，D=d/a实施实例2:牛GDF5基因多态性与秦川牛改良群体体尺性状的相关利用本发明的引物(GDFF和GDFR)对秦川牛改良群体240个个体的基因组DNA进行PCR扩增，并利用MvaI限制性内切酶消化PCR产物，然后进行2.5%琼脂糖凝胶电泳分析。在秦川牛改良群体中共检测到3种基因型，当牛GDF5基因外显子1中变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶MvaI的酶切位点(CCATGG)，MvaI消化PCR产物后会产生2个片段(181bp和54bp),将其命名为CC基因型；该位点为T碱基时(CTTGG)，则不存在MvaI酶切位点，MvaI消化PCR产物后只有l个片段(235bp)，将其命名为TT基因型(野生型)；该位点为T/C杂合时，MvaI消化PCR产物后会产生3个片段(235bp、181bp和54bp),将其命名为TC基因型(附图)对GDF5基因T/C变异位点产生的3种基因型与秦川牛改良群体240个个体的体长和腰角宽进行分析，结果表明基因型对秦川牛改良群体的体长和腰角宽有显著影响(P<0.05)，TT基因型个体的体长和腰角宽显著低于TC和CC基因型个体的体长和腰角宽(P<0.05),具有TT基因型个体的体长和腰角宽比CC基因型个体的体长和腰角宽分别低5.64cm和3.46cm(表2)。表2GDF5基因不同基因型对秦川牛改良群体体长和腰角宽性状的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>核苷酸序列表<110>西北农林科技大学<120>—种用GDF5基因预示和鉴定秦川牛体尺大小的分子标记方法<140><141><160>3<210>1<211>235<212>DNA<213>家牛属普通牛(BostaurusdomesticusGmelin)<220><221〉misc一feature<222>(54)<223>N=T或C<400>1TGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCT50GGCNTGGCCAACACCATCACCAGCTTTATTGACAAAGGGCAAGGTGAGGG100GGCGGGGTGGCTGGGGCACGGCTCAGAGGGAGGGGCATCTGCATGCATGG150AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC235<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2TGTCCGATGCTGACAGAAAGG21<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA2权利要求1、一种用GDF5基因预示和鉴定秦川牛体尺大小的分子标记方法，其特征在于，包括下列步骤步骤一，根据牛GDF5基因(GenBank登录号NC_007311)序列设计一对引物GDFF和GDFRGDFF5’TGTCCGATGCTGACAGAAAGG3’(如序列表中序列2所示)GDFR5’GAGTGAGGTTAATCCCAGATACCA3’(如序列表中序列3所示)步骤二，利用该对引物GDFF和GDFR对牛的基因组DNA进行PCR扩增，得到由GDFF和GDFR表示的引物扩增的第一外显子区和第一内含子区的扩增片段，该扩增片段的长度为235bp；步骤三，利用限制性内切酶MvaI消化扩增的PCR产物；步骤四，用浓度为2.5％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出GDF5基因外显子1的586位点处的T/C变异位点；步骤五，通过T/C变异位点检测碱基的突变，并根据基因多态性部位分成下面3种基因型当T/C变异位点为C碱基时，会产生限制性内切酶MvaI的酶切位点即CC^TGG，MvaI消化PCR产物后会产生的2个片段即181bp和54bp，将其命名为CC基因型；当T/C变异位点为T碱基即CTTGG时，则不存在MvaI酶切位点，MvaI消化PCR产物后只有1个片段即235bp，将其命名为TT基因型或野生型；当T/C变异位点为T/C杂合时，MvaI消化PCR产物后会产生3个片段即235bp、181bp和54bp，将其命名为TC基因型。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的GDF5基因外显子的序列片段是由GDFF和GDFR表示的引物扩增的第一外显子区和第一内含子区。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基因多态性部位的位点为己知的牛GDF5基因如下序列中第54位的T-C的碱基突变TGTCCGATGCTGACAGAAAGGGAGGCAACAGCAGCGTGAAGTTGGAGGCT50AGGGGGCTTTAGAGCCCAGACACTGCACTGGGGGGAGATGGTGTGTGCTT200CTGGCCCGGGGTGGTATCTGGGATTAACCTCACTC。4、如权利要求1-3所述的方法，其特征在于，其中秦川牛的体尺大小包括体长和腰角宽。全文摘要本发明公开了一种用GDF5基因预示和鉴定秦川牛体尺大小的分子标记方法，该方法根据牛GDF5基因序列设计一对引物；利用该引物对牛的基因组DNA进行PCR扩增；并利用限制性内切酶MvaI消化扩增的PCR产物；然后使用2.5％的琼脂糖凝胶对消化后的PCR产物进行电泳分离，检测出GDF5基因外显子1的586位点处的T/C变异位点；分别对牛GDF5基因外显子1中变异位点为C碱基、T碱基及T/C杂合碱基进行命名。根据实验结果表明，具有TT基因型个体的体长比CC基因型个体的体长低5.64～6.87cm；具有TT基因型个体的腰角宽比CC基因型个体的腰角宽低3.46～4.00cm。该方法操作简单、费用低、精确度高，可进行快速检测。文档编号C12Q1/68GK101525662SQ20091002182公开日2009年9月9日申请日期2009年4月2日优先权日2009年4月2日发明者刘永峰,昝林森,楚秋霞申请人:西北农林科技大学