专利名称：慢病毒介导的针对VEGF-C基因siRNA重组体970的构建及用途的制作方法
慢病毒介导的针对VEGF-C基因s i RNA重组体970的构建及用途技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种RNAi慢病毒重组表达载体的构建及其肿瘤基因治疗中的应用。
背景技术：
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是通过实验手段向细胞内导入长的双链 RNA或者细胞内源性产生一些短片段的双链RNA，这些短片段的双链RNA ( double stand RNA, dsRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因的表达，使细胞出现特定基因缺失的表型，siRNA ( small interference RNA)就是这种短片段双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA，最终使相应的基因沉默。由于这种现象发生在转录后，故又称为转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)0
RNAi技术不仅揭示了细胞内基因沉默的机制，而且有望成为后基因组时代基因功能分析的有力工具，是继酵母杂交系、DNA芯片、基因敲除、反义RNA等技术之后的又一解读基因功能的有效研究手段，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程。目前RNAi技术已经广泛用于基因功能研究和肿瘤基因治疗研究领域，其在肿瘤基因治疗上与基因替代、 反义寡核苷酸治疗、细胞因子基因治疗等传统基因治疗方法相比，具有特异、高效和毒性小的特点，因此可用来对一些肿瘤进行基因治疗。
慢病毒载体(Lentiviral vector)较传统的质粒载体及逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA的携带者，不但具备特异性地使基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载体自身所具备的优势，如①该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。该载体介导的基因改造后的肿瘤细胞可以产生大量的克隆，并且可以弥散分布于肿瘤实体；②不易诱发宿主免疫反应；③在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大大提高目的基因转导效率，为RNAi、cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径，也为基因功能的研究和肿瘤的基因治疗研究提供了更强有力的工具。
肿瘤的侵袭和转移是决定人类癌症恶性表型的关键因素，也是导致死亡的主要原因。肿瘤细胞通常是通过表达某一生长因子及其特异受体而组成其自身的自分泌信号通路来获得侵袭和迁移能力。有研究显示许多生长因子及其受体参与肿瘤的侵犯和转移过程， 其中就包括VEGF-C/VEGFR-3淋巴管生长信号轴，如何中断这些生长因子及其受体组成的信号通路，目前已经成为研发抗癌新药物的主要策略之一。近年来，肿瘤的淋巴管生成备受学者关注，多种与淋巴管生成的因子被发现，其中血管内皮生长因子C(VEGF-C)被认为是目前发现的特异性淋巴管生成因子。VEGF-C可以激活其受体VEGFR-2和VEGFR-3而诱导肿瘤血管、淋巴管生成和促进肿瘤淋巴道转移，是一种重要的血管、淋巴管内皮细胞调节因子，与肿瘤的淋巴管生成、淋巴道扩散及淋巴结转移有关。许多研究显示，VEGF-C在胃癌、 前列腺癌、直肠癌、乳腺癌、肺癌等恶性肿瘤组织中过表达，并与淋巴结转移和淋巴管生成正相关，是理想的肿瘤基因治疗靶点。
基于上述研究，我们设计了针对VEGF-C基因的寡核苷酸序列，应用慢病毒表达载体构建siRNA表达体系并转染非小细胞肺癌细胞株，经real time RT-PCR、western blot 检测VEGF-C mRNA和蛋白质的表达水平，研究其干扰VEGF-C基因表达的效应，为进一步研究VEGF-C功能及其作为抗肿瘤淋巴转移靶点可行性等研究奠定基础。发明内容
本发明的目的在于提供针对VEGF-C基因RNAi慢病毒重组表达载体 pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA970的构建及制备方法，为肿瘤基因治疗提供新策略。本发明的另一目的是提供新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
本发明的技术解决方案是，慢病毒介导的针对VEGF-C基因siRNA重组体970，其碱基序列为5’ CCTCAGCAAGACGTTATTT3，。
慢病毒载体介导的siRNA970的制备方法，它是构建的慢病毒表达载体介导的重组体pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA970，应用慢病毒介导的该重组体感染肿瘤细胞后，该重组体可以将VEGF-CsiRNA970整合到肿瘤细胞及宿主染色体上，从而达到持久性表达，有效地阻断肿瘤组织表达VEGF-C。
本发明的技术效果在于，该重组体能够显著抑制非小细胞肺癌细胞中VEGF-C基因的表达。包括肺癌在内的实体肿瘤，血管和淋巴管的新生程度是其转移潜能大小的直接影响因素。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族及其受体(VEGFRs)是肿瘤发展过程中，参与血管和淋巴管生成的主要因子，已经成为以病理性血管和淋巴管生成信号通路为标靶的肿瘤靶向治疗的首选靶点！该家族成员VEGF-C作为肿瘤生物治疗的靶点，可能优于已公认而且已经应用于临床的生物治疗靶点VEGF-A。本发明提供的重组体可干预肿瘤细胞VEGF-C的表达，可用于制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
本发明选定VEGF-C基因作为肿瘤治疗靶点，根据VEGF-C (NM_005429)基因信息，使用不同(主要参考的软件有dnvitrogen BLOCK-iT RNAi Designer、ambion公司的 siRNA Target Finder 以及 GeMcript 公司的 siRNA Target Finder 等。实际上，我们根据多个软件算法综合考虑选择一条siRNA序列)的在线siRNA序列设计软件设计了针对VEGF-C编码区(CDS区)，起始位置为970的siRNA序列VEGF-C siRNA9 70 (序列为 5’ CCTCAGCAAGACGTTATTT3’)。根据siRNA序列，设计两条互补的DNA模板单链，模板链包括siRNA的正义链和反义链，中间以12个脱氧核苷酸的Loop结构(5’ - CTTCCTGTCAGA -3’)相连，后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点(TTTTT)，同时模板链两端分别添加 BamHI和EcoR I酶切位点，合成相应的DNA单链(PAGE级别)。单链经退火后克隆入慢病毒表达载体(pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector)，并应用酶切鉴定和DNA测序技术进行筛选鉴定重组质粒。
图 1 慢病毒重组体 pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA 结构2慢病毒重组体pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA测序结果图3稳定转染后非小细胞肺癌细胞的荧光表达检测图4稳定转染细胞VEGF-C基因mRNA表达的实时定量RT-PCR扩增曲线图 5 Western blot 检测图。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，以下实例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的范围。
实施例一干扰序列的设计根据人VEGF-C (NM_005429)基因信息，使用不同的在线siRNA序列设计软件， 设计siRNA970(序列为:5，CCTCAGCAAGACGTTATTT3 ’ )；再设计一组无关序列(序列为 5，CGTTTAACTCTCCCAACCA 3，)作为阴性对照。
实施例二 重组慢病毒表达体的构建根据siRNA970序列，设计两条互补的DNA模板单链，模板链包括siRNA的正义链和反义链，中间以12个脱氧核苷酸的Loop结构(5’ - CTTCCTGTCAGA -3’ )相连，后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点(TTTTT)，同时模板链两端分别添加BamHI和EcoR I酶切位点，合成相应的DNA单链(PAGE级别)。
GATCCCCTCAGCAAGACGTTATTTCTTCCTGTCAGAAAATAACGTCTTGCTGAGGTTTTTG3~ 5、AATTCAAAAACCTCAGCAAGACGTTATTTTCTGACAGGAAGAAATAACGTCTTGCTGAGGG3、相应的DNA单链送上海hvitrogen公司人工合成后，将两条链退火形成双链。用BamH I内切酶与EcoR I内切酶双酶切表达载体pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector (表达载体图谱如图1)，然后将双链DNA连接至经过线性化处理的载体pSIHl-Hl-copGFP shRNA Vector, 转化至DH5a感受态细胞，使用载体多克隆位点两端的引物进行PCR扩增检测阳性菌落，阳性重组克隆进行DNA测序鉴定(测序图谱如图2)。
实施例三慢病毒颗粒的包装和生产本实验米用 Lentivirus Package systerm (System Biosciences,Cat. # LV500A-1) 进行慢病毒颗粒的包装和生产，病毒生产细胞系为Producer Cell Line (System Biosciences, Cat. # LV900A-1)。使用慢病毒包装质粒混合物和siRNA970对应的重组质粒共转染293TN细胞，病毒包装过程中共转染293TN细胞48小时后拍片观察，视野内有较强的绿色荧光，即证明慢病毒颗粒包装成功。
使用梯度稀释法进行病毒滴度测定，病毒原液进行10次稀释后，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。即在镜下计数细胞总数以及有荧光表达的细胞数目，将得到的数值除以相应的稀释倍数就得到了病毒原液的滴度值。
病毒滴度的计算ifu/ml (感染单位/ml)——具有感染能力的假病毒颗粒的相对浓度；MOI (感染复数)——在所有被感染的宿主细胞中，平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒数或基因组数。即取了体积为ν(μ )的病毒原液进行十倍稀释，在加入了第A次十倍稀释后(即稀释倍数为IOa)的病毒稀释液的空中看到了 B个带有荧光的细胞，则病毒的滴度计算公式为病毒滴度=(B/V)*10A。
本实验测定的病毒滴度为(126. 33/10) X IO3=L 26*104ifu/ μ L·使用 dPBS (pH7. 8，实验室配制)将病毒颗粒浓度调整至1 X 104ifu/ μ 1，按Iml每管浓度调整后的病毒液进行分装，_70°C保存待用。
实施例四慢病毒感染A549细胞，建立VEGF-C RNAi稳定表达细胞株使用标准copGFP标记的病毒液(1 X IO4Ifu/μ 1)感染Α549细胞(分别加入10，20，30， 40，50和100 μ 1病毒液)，荧光倒置显微镜下观察，绿色荧光表达比较稳定，使用胰酶消化的方法对细胞进行计数，进行数据分析，获得能够使Α549细胞达到100%的最少病毒用量为 6ul，那么慢病毒感染 A549 细胞的最佳 MOI 值为:M0I=40ul X 104ifu/ μ 1 + [ (125+116+146) + 3Χ104Χ0· 05] ^ 6。
在最佳MOI值条件下进行Α549细胞感染实验，感染后96小时，镜下观察，细胞状况较好，贴壁密度达到80%以上。使用胰蛋白酶消化细胞，计数后制备细胞悬液，放大培养细胞克隆，挑取最稳定的克隆，进行传代培养(建立的VEGF-C RNAi稳定表达细胞如图3所示)，提取 total RNA 和总蛋白，进行 Real-Time RT-PCR 和 western blot 检测。
实施例五实时定量RT-PCR检测重组体对VEGF-C基因mRNA水平的影响取A549细胞、VEGF-C RNAi稳定表达细胞株和VEGF-C RNAi阴性稳定表达细胞株，以 Trizol法提取总RNA，并对提取的RNA样品进行电泳确认和OD值测定。采用STOR Green I荧光染料嵌合法，real time RT-PCR反应确认引物反应性。以样本Total RNA为模板， 进行反转录反应得到的cDNA溶液，使用2 Step Real Time PCR方法，扩增β-actin及 VEGF-C目的基因(扩增曲线如图4所示)，检测其表达情况。结果发现，慢病毒重组表达载体pSIHl-Hl-copGFP- VEGF-CsiRNA可以显著抑制非小细胞肺癌细胞VEGF-C基因mRNA表达，抑制效率为67. 77%。
实施例六Western blot检测重组体对VEGF-C基因蛋白表达的抑制取A549细胞、VEGF-C RNAi稳定表达细胞株和VEGF-C RNAi阴性稳定表达细胞株， 用蛋白提取液分别处理各组细胞，收集总蛋白，蛋白定量后进行SDS-PAGE电泳、转膜，应用VEGF-C抗体进行免疫反应，化学发光剂检测，以GAPDH为内参照(检测结果如图5所示)。使用扫描仪扫描图像，条带的灰度分析采用TotalLab软件处理，以目的基因产物灰度值与GAPDH产物灰度值之比作为蛋白相对表达量。结果发现，慢病毒重组表达载体 pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA可以显著抑制非小细胞肺癌细胞VEGF-C蛋白表达，抑制效率为 60. 88%ο
在肿瘤的发生、发展过程中，新生血管和淋巴管的形成是关键步骤。在实体肿瘤体积大于1 2mm3时，补充新生血管和淋巴管以清除代谢废物和提供充足的氧和养分，对处于发生和发展阶段的肿瘤来说，是使其具有无可控制的增殖能力所必需的关键步骤和过程。同时，新生的血管和淋巴管也为肿瘤的转移提供了新的转移路径。目前认为，实体肿瘤血管和淋巴管的新生程度是实体肿瘤转移潜能大小的直接影响因素。
在新血管和新淋巴管形成前，由于处于发展状态的实体肿瘤通常处于氧气缺乏或氧含量低的状态，所以会随即促发了一系列血管生成因子和生长因子的释放，进而促使局部基底膜的降解、内皮细胞的浸润、迁移和增殖，最终导致微血管和微淋巴管的形成，如何应用新的治疗方法控制和阻断这一复杂的血管、淋巴管生成路径，以期达到阻断肿瘤细胞的氧和养分供应的目的，进而“饿死”肿瘤细胞，成为研究者努力地焦点。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)家族及其受体(VEGFRs)是肿瘤发展过程中，参与血管和淋巴管生成的主要因子，已经成为以病理性血管和淋巴管生成信号通路为标靶的肿瘤靶向治疗的首选靶点！VEGF家族中VEGF-C可以与表达于淋巴管内皮细胞或成骨细胞等非内皮细胞，以及多数肿瘤细胞的酪氨酸激酶受体VEGFR-3结合，也具有相对较弱的与VEGFR-2结合的能力，而 VEGFR-2则被认为是细胞表面调控血管生成的酪氨酸激酶受体，还可以与表达于静脉和淋巴管的复合受体如neuropilin-2结合，因此，普遍认为VEGF-C的主要生理功能是诱导淋巴管生成。
最初，人们只是认为VEGF-C在肿瘤细胞中表达，可以诱导肿瘤组织和局部淋巴结的淋巴管生成而促使肿瘤细胞经淋巴管道转移，然而，越来越多的研究显示，VEGF-C参与和影响许多肿瘤的恶性表型，其中包括非小细胞肺癌、直肠和乳腺癌等多发肿瘤。然而，近期的研究显示，VEGF-C/VEGFRs信号轴可以通过自分泌途径调控肿瘤细胞的迁移，进而诱使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移。U) VEGF-C通过自分泌途径调控VEGFR-3/VEGFR-2的表达，诱使肿瘤血管和淋巴管生成VEGF-C通过自分泌途径调控CXCR4、CCR7等细胞因子受体的表达，诱使肿瘤细胞的定向迁移；(3) VEGF-C可通过VEGFRs通路直接作用于肿瘤细胞，影响肿瘤细胞的侵袭和迁移；(4) VEGF-C可以直接作用于肿瘤细胞，影响肿瘤细胞的细胞周期，进而影响肿瘤增殖。(5) VEGF-C可以调控VEGF家族中的其他因子如VEGF_A(目前认为VEGF-A是最主要的血管生成促进因子，因而抑制VEGF-A表达的抑制剂目前已经应用于临床，但效果并不理想)的表达，因而研究者认为，目前临床应用的抑制肿瘤血管生成的VEGF-A生物制剂疗效不显著的原因，可能是由于VEGF-C未受干预所造成的。因而，我们认为VEGF-C作为肿瘤生物治疗的靶点，可能优于已公认而且已经应用于临床的生物治疗靶点VEGF-A。本发明提供的重组体可干预VEGF-C的表达，有望为VEGF-C生物制剂的研制提供可靠依据。
权利要求
1.慢病毒介导的针对VEGF-C基因SiRNA重组体970，其特征在于，其碱基序列为 CCTCAGCAAGACGTTATTT3~。
2.慢病毒载体介导的siRNA970的制备方法，其特征在于，它是构建的慢病毒表达载体介导的重组体pSIHl-Hl-copGFP-VEGF-CsiRNA970，应用慢病毒介导的该重组体感染肿瘤细胞后，该重组体可以将VEGF-CsiRNA970整合到肿瘤细胞及宿主染色体上，从而达到持久性表达，有效地阻断肿瘤组织表达VEGF-C。
3.根据权利要求2所述的慢病毒载体介导的siRNA970的制备方法，其特征在于，所述慢病毒表达载体介导的重组体pSIHl-Hl-cOpGFP-VEGF-CsiRNA970，构建所用慢病毒表达载体和DNA片段包括含RNA PolyIII聚合酶与Hl启动子的载体pSIHl-Hl_copGFP shRNA Vector和编码特异地抑制VEGF-C基因表达的siRNA970的DNA片段。
4.根据权利要求3所述的慢病毒载体介导的siRNA970的制备方法，其特征在于，所述的编码特异地抑制VEGF-C基因表达的siRNA970的DNA片段，其碱基序列为·5.GATCCCCTCAGCAAGACGTTATTTCTTCCTGTCAGAAAATAACGTCTTGCTGAGGTTTTTG3、·5、AATTCAAAAACCTCAGCAAGACGTTATTTTCTGACAGGAAGAAATAACGTCTTGCTGAGGG3、。
全文摘要
本发明公开了一种针对VEGF-C基因的RNAi慢病毒表达载体介导的重组体pSIH1-H1-copGFP-VEGF-CsiRNA970的构建及其抑制非小细胞肺癌细胞VEGF-C基因表达的作用。利用RNAi技术原理，设计出以VEGF-C为靶基因的siRNA970，设计合成了能转录出shRNA的模板DNA，并将其克隆到慢病毒表达载体pSIH1-H1-copGFPshRNAVector，并用酶切鉴定和DNA测序技术进行筛选，成功构建了慢病毒介导的针对VEGF-C基因siRNA重组体pSIH1-H1-copGFP-VEGF-CsiRNA970。该重组体能够显著抑制非小细胞肺癌细胞中VEGF-C基因的表达，可用于制备新的抗肿瘤生物制剂和抗肿瘤基因药物。
文档编号A61K48/00GK102533763SQ20111044003
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月26日 优先权日2011年12月26日
发明者冯克俭, 冯玉宽, 刘贵波, 张雅芳, 曹艳丽, 潘艳明, 胡静 申请人:冯玉宽