一种牙鲆精子介导转基因过程中保持精子活力的方法
【专利摘要】本发明提供一种牙鲆精子介导转基因过程中保持精子活力的方法，是利用脂质体将外源DNA包裹起来形成两者的复合物，然后将精子12000rpm高速离心15min，去除精清，再将复合物与精子共同孵育，从而用于精子介导的转基因实验和生产中。脂质体与外源质粒形成复合物的N/P参数为5，形成脂质体-DNA复合物的时间为15min，外源质粒的浓度为100ng/μl，每10μl精子与10μg外源质粒混合，混合的时间在10min至50min。通过与质粒直接与精子混合作为比较，本发明的优点为，利用脂质体将外源质粒包裹起来，有效避免外源质粒对精子的损伤，利用细胞转化的原理，即脂质体和精子质膜间的静电作用，提高外源基因的导入率，操作简便，处理时间的跨度广，便于实际操作。
【专利说明】一种牙鲆精子介导转基因过程中保持精子活力的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于海洋经济鱼类遗传育种【技术领域】，具体涉及一种牙鲆精子介导转基因 过程中保持精子活力的方法。
【背景技术】
[0002] 精子介导的转基因技术（sperm mediated gene transfer, SMGT)是近几十年来应 用越来越多的一种转基因的新技术。它利用精子将外源基因携带进入动物的胚胎中。该操 作过程简便，对胚胎的机械损伤，化学损伤等危害程度低，而且动物受精是一个生理过程， 应用的范围广，克服了传统转基因技术的局限性。通过少量精子就可以获得大量后代，转基 因后代的数量也随之增加。这些都使得SMGT能够有效地用于实际生产当中。早在1971年 起，就有利用SMGT方法进行的哺乳动物转基因实验，如小鼠、猪等。
[0003] SMGT方法最初是利用质粒和精子直接共同孵育一段时间，这样做虽然简便，但是 转基因的效率并不稳定。首先精液中的非细胞成分中有抑制DNA与精子特定部位结合的因 子，Lanes等证明巴西牙鲆精液中的精清成分，具有DnaseI活性，能够降解外源DNA，降低了 外源DNA进入精子的可能性。而且外源DNA分子结合到精子的质膜上会发生一系列的级联 反应，引起精子的凋亡。因此，提高外源DNA进入精子的可能性，并避免外源质粒对精子造 成损伤，是利用精子介导的转基因方法产生转基因动物的关键步骤之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种牙鲆精子介导转基因过程中保持精子活力的方法，即 利用脂质体和外源DNA形成复合物，可以避免外源DNA分子与精子的直接接触，避免精子的 凋亡。
[0005] 本发明的方法，包括如下的步骤：
[0006] 1)外源质粒的构建
[0007] 利用限制性内切酶XhoI和AccI分别切开带有目的基因的质粒和带有mCherry红 色荧光的质粒，并回收切开的质粒片段；再使用T4连接酶将目的基因片段和带有mCherry 红色荧光的质粒相连接起来，构成转基因的外源DNA质粒；
[0008] 2)高速离心除去精液中的非细胞成分
[0009] 取新鲜牙鲆精子，离心后弃透明上清，得到去除非细胞成分的精子；
[0010] 3)制备脂质体和外源DNA质粒复合物
[0011] 每1 μ g外源DNA质粒溶于150mM Nacl buffer中稀释至50 μ 1，震荡并混勻制成 外源DNA质粒复合物；
[0012] 每2 μ 1脂质体转染试剂溶于150mM Nacl buffer稀释至50 μ 1，轻轻震荡并混勻；
[0013] 将稀释完毕的脂质体转染试剂加入到稀释完毕的外源DNA质粒复合物中，然后迅 速颠倒混匀，在室温下放置15至30min形成脂质体-DNA复合物；
[0014] 4)将脂质体-DNA复合物与去除非细胞成分的精子共同孵育；然后进行人工受精。
[0015] 其中步骤1)中的目的基因为follistatin基因，其质粒的构建方法如下：
[0016] 在牙鲆follistatin基因设计一对两端带有限制性酶切位点的PCR引物，其5'和 3'引物上加入了一个XhoI和AccI的酶切位点，其引物如下：
[0017] 5' -primer :5' -GAGAGAGACTCGAGGAATGTTTAGATGCTGAAACAC-3，，
[0018] 3， -primer -GAGAGAGAGTCTACTTACTTACAGTTGCAAGATCC-3 ;；
[0019] PCR反应程序如下：95°C预变性5min，95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 90sec，循环 30 次，72°C延伸 IOmin ;
[0020] 回收扩增的目的基因片段，连接在PMD18 - T载体上，利用氨苄抗性筛选带有目的 片段的阳性菌。
[0021] 步骤2)中的离心条件在12000rpm下离心15min。
[0022] 本发明优点如下：1、方法转基因效率高；2、脂质体的化学性质可以有效的保护携 带有目的基因的质粒，防止被降解，并且脂质体的带电性可以促进其与精子表面结合；3、月旨 质体对精子的破坏作用小，大部分精子仍然保持较高的活力
【具体实施方式】
[0023] 下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述。
[0024] 实施例1
[0025] 1.外源质粒的构建
[0026] 1)根据NCBI中，牙鲆follistatin基因设计一对两端带有限制性酶切位点的PCR 引物，其5'和3'引物上加入了一个XhoI和AccI的酶切位点，进行PCR。其引物如下：
[0027] 5' -primer :5' -GAGAGAGACTCGAGGAATGTTTAGATGCTGAAACAC-3'，
[0028] 3' -primer :5' -GAGAGAGAGTCTACTTACTTACAGTTGCAAGATCC-3'
[0029] PCR反应程序如下：95°C预变性5min，95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 90sec，循环 30 次，72°C延伸 lOmin。
[0030] 2)利用胶回收试剂盒（TM16090646)回收扩增的follistatin目的片段，连接在 PMD18 - T载体上，利用氨苄抗性筛选带有目的片段的阳性菌
[0031] 3)利用限制性内切酶XhoI和AccI分别切开带有follistatin的质粒和带有 mCherry红色突光的质粒，并使用质粒回收试剂盒（TM16090646)将切开的质粒分别回收
[0032] 4)使用T4连接酶将follistatin片段和带有mCherry红色突光的质粒相连接起 来，构成转基因的外源DNA质粒
[0033] 2.高速离心除去精液中的非细胞成分
[0034] 取IOOul挤出的新鲜牙鲆精子,放在I. 5mlEP管中，12000rpm高速离心15min，小 心地丢弃透明上清
[0035] 3.制备脂质体和DNA复合物
[0036] 1)每 IugDNA 溶于 150mM Nacl buffer ( FuGENE? 6Transfection Reagent 试剂 盒，Promega(北京）生物技术有限公司，货号：E2693)稀释至50ul，轻轻震荡并混匀
[0037] 2)每2ul转染试剂溶于150mM Nacl buffer稀释至50ul，轻轻震荡并混勻
[0038] 3)将稀释完毕的转染试剂加入到稀释完毕的DNA中，然后迅速颠倒混匀，此步中 一定是转染试剂加入到DNA中，切记顺序不可以颠倒
[0039] 4)将4)中的混合物在室温下放置15至30min即可形成脂质体-DNA复合物。从 此时开始计算，复合物在室温下可以稳定存在2小时，在4°C条件下可以稳定存在24小时
[0040] 4.将脂质体-DNA复合物与去除精清的精子共同孵育一段时间
[0041] 5.将处理后的精子分成两部分，一部分利用2. 5%的戊二醛固定，利用扫描电镜 进行观察；另一部分进行人工受精
[0042] N/P系数和脂质体-DNA复合物与精子共同孵育的时间，与脂质体对精子的保护能 力，对精子功能的影响以及外源目的基因导入精子内效率等有关。因此采用单因子变量法， 获得最优的N/P系数和孵育时间。
[0043] 1)N/P参数的获得
[0044] N/P系数的计算，根据脂质体试剂盒
[0045] FuGENE? 6Transfection Reagent ( FuGENE? 6 转染试齐[J )提供的计算公式
[0046] 脂质体转染是利用细胞转化的原理，脂质体-DNA复合物要带有正电荷，才能与精 子质膜表面的负电荷相互吸附，因此N/P系数应大于3。在精子与复合物共同孵育的时间相 同的情况下，分别设计了以下N/P系数，然后统计其受精率。结果如下表1 :
[0047]
【权利要求】
1. 一种牙鲆精子介导转基因过程中保持精子活力的方法，其特征在于，所述的方法包 括有如下的步骤： 1) 外源质粒的构建： 利用限制性内切酶Xhol和AccI分别切开带有目的基因的质粒和带有mCherry红色荧 光的质粒，并回收切开的质粒片段；再使用T4连接酶将目的基因片段和带有mCherry红色 荧光的质粒相连接起来，构成转基因的外源DNA质粒； 2) 高速离心除去精液中的非细胞成分 取新鲜牙鲆精子，离心后弃透明上清，得到去除非细胞成分的精子； 3) 制备脂质体和外源DNA质粒复合物 每lug外源DNA质粒溶于150mM Nacl buffer中稀释至50iil，震荡并混勻制成外源 DNA质粒复合物； 每1脂质体转染试剂溶于150mM Nacl buffer稀释至50ii 1，轻轻震荡并混勻； 将稀释完毕的脂质体转染试剂加入到稀释完毕的外源DNA质粒复合物中，然后迅速颠 倒混匀，在室温下放置15至30min形成脂质体-DNA复合物； 4) 将脂质体-DNA复合物与去除非细胞成分的精子共同孵育；然后进行人工受精。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的目的基因为 follistatin 基因。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中转基因的外源DNA质粒的 构建方法如下： 在牙鲆follistatin基因设计一对两端带有限制性酶切位点的PCR引物，其5'和3' 引物上加入了一个Xhol和AccI的酶切位点，其引物如下： 5' -primer^' -GAGAGAGACTCGAGGAATGTTTAGATGCTGAAACAC-3', 3' -primer^' -GAGAGAGAGTCTACTTACTT ACAGTTGCA AGATCC-3/ ； PCR反应程序如下：95°C预变性5min，95°C变性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸 90sec，循环 30 次，72°C延伸 lOmin ; 回收扩增的目的基因片段，连接在PMD18 - T载体上，利用氨苄抗性筛选带有目的片段 的阳性菌。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的离心条件是在12000rpm 下离心15min。
【文档编号】C12N15/85GK104372022SQ201410624598
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月6日 优先权日:2014年11月6日
【发明者】齐洁, 王振伟, 辛念, 张全启, 王志刚, 王旭波, 于海洋, 贺艳 申请人:中国海洋大学