专利名称：一种高效介导dc基因转移的重组腺病毒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体为一种高效介导DC基因转移的重组 腺病毒。
背景技术：
自1973年Steinman和Cohn首次报道树突状细胞(Dendritic cell,DC)以来，人 们对DC的认识不断深入。目前认为DC是人体内最重要，抗原递呈能力最强，体内唯一能活 化静息T淋巴细胞的抗原递呈细胞，是机体免疫应答的始动者，它具有摄取、加工抗原，以 主要组织相容性复合物(MHC) I、II类肽复合物的形式递呈抗原，促进T、B淋巴细胞增殖的 能力，在天然免疫和获得性免疫中都发挥着极其重要的作用。研究表明，肿瘤的发生、发展与患者体内的T淋巴细胞功能缺陷有关，特别是晚期 肿瘤患者，其体内往往存在体液免疫和细胞免疫功能的普遍低下，且其低下程度与其临床 分期密切相关。进一步的研究发现，导致免疫功能低下的根本原因在于机体对成熟DC的功 能下调。体外实验证实即使由晚期肿瘤患者体内分离出的淋巴细胞对多种外界刺激仍然保 持着很好的反应能力。因此，通过体外培养DC，制备DC瘤苗免疫荷瘤宿主，有望成为肿瘤的 理想疗法。基因修饰免疫细胞是目前肿瘤治疗研究领域的热点之一，其具体策略是通过基因 转移技术将目的基因导入免疫细胞，然后将表达目的基因的免疫细胞输入患者体内，从而 提高免疫系统对肿瘤细胞的识别或杀伤能力。基因修饰DC介导的肿瘤治疗成为当今肿瘤 生物治疗领域中备受关注的焦点之一。有效的基因治疗依赖于外源基因高效、稳定的表达。肿瘤抗原基因导入DC的方 法一般有两大类一是以腺病毒、逆转录病毒、痘病毒和腺病毒相关病毒等为载体的病毒载 体方法；二是DNA脂质体复合物、磷酸钙沉淀、电穿孔等非病毒载体方法。非病毒载体方法 转染的优势在于插入片段大小不受限制；免疫原性低；生产简便。其缺点是外源基因的转 染效率一般很低。病毒载体介导方法，以其高转染率和良好的靶向性成为肿瘤基因治疗中 应用最广泛的方法。利用病毒载体将带有肿瘤抗原的编码基因转染DC制备的疫苗，由于可 以在DC细胞内加工和持续表达相应特异性抗原，诱导产生特异性抗肿瘤免疫应答而备受 关注。其中最常用的包括逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒(adenovirus)和腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV)等载体。逆转录病毒可将转染的基因整合到染色体上，因此可以保证转基因的长期表达， 但这种整合是随机的，可能导致细胞突变而诱发癌症；逆转录病毒只感染分裂细胞；用逆 转录病毒载体介导外源基因转染DC的效率只有10% 30%，因此，介导肿瘤基因治疗存在 一定的局限性。在法国进行逆转录病毒为载体的人类基因治疗临床研究出现了诱发血液系 统恶性肿瘤的严重问题。腺病毒是众多的病毒载体基因转移方式中最常见的，其优点在于安全，有效；腺 病毒可以通过上调DC细胞表面的MHC及共刺激分子表达来促进其成熟；插入的外源片段大
3小可达37kb ；腺病毒转染后的DC可以保持正常的表型特征和功能；体内回输在肝脏短暂停 留后移行到脾脏并持续表达外源基因，血清中不产生抗Ad抗体。美国Genzyme公司和麻省 总医院MGH的学者也探索了腺病毒介导的gplOO基因转染的小鼠骨髓来源DC的性质，并通 过小鼠体内实验证明gplOO基因修饰的DC体内免疫后可诱导出gplOO特异性CTL。国内章 卫平等也报道了腺病毒介导的GM-CSF基因修饰的DC与肿瘤细胞的融合疫苗体内免疫激活 效果的研究结果。腺病毒进入细胞主要由纤维顶球与细胞表面受体的相互作用所介导，所以传统的 5型腺病毒对DC的感染效率比较低。因此，对其亲嗜性的修饰对于基于DC的基因治疗的发 展无疑起着重要作用。AdEasy腺病毒制备系统是实验室普遍使用的腺病毒包装系统，我们 基于此系统对5型腺病毒纤维基因进行修饰，将AdEasy-1载体中5型腺病毒的纤维顶球和 柄部替换为lip型腺病毒的相应部分。通过这种方法改构腺病毒，不仅可以提高重组腺病 毒对DC的感染效率，而且还可以实现纤维基因与目的基因在不同的载体同时进行操作。综上所述，制备一种能够高效感染DC的重组腺病毒，为肿瘤的基因治疗提供一种 特异、高效的方法，具有重大的理论和现实意义。
发明内容
本发明的目的是在于建立一种能够高效介导DC基因转移的腺病毒制备体系，为 基于DC的靶向基因治疗提供一种新的策略。我们的发明是以腺病毒载体系统AdEasy为基础，改造其骨架质粒AdEasy-1中的 纤维基因，将其中编码5型腺病毒纤维基因杆部和顶球部的序列替换为lip型腺病毒的相 应序列。Adllp为B族腺病毒，其可以通过高效结合造血细胞表面⑶46分子而感染造血系 统来源细胞。带有目的基因的穿梭质粒与骨架质粒AdEasy-1/Fllp重组最终制备的腺病毒 将含有Adllp的纤维顶球，具有Adllp的靶向性。选择GFP作为报告基因观察改造的腺病 毒载体(AdEasy-1/Fllp-GFP)对DC细胞的感染效率，同时还观察了改构腺病毒对DC生物 学特性的影响。具体为1、构建携带嵌合基因的腺病毒载体本发明重组腺病毒能否高效感染DC细胞，关键在于该病毒与细胞表面受体的结 合能力。由于介导AdEasy-1型腺病毒进入细胞的表面受体为CAR，而DC细胞CAR表达较 低；介导Adllp型腺病毒进入细胞的表面受体为⑶46，DC细胞⑶46表达率非常高，达99% 以上。因此，我们将pAdEasy-1的纤维基因替换为Ad5型腺病毒纤维尾部与Adllp纤维杆 部和顶球部的嵌合基因，成功构建pAdEasy-l/Fl lp。2、pAdEasy-l/Fllp_GFP 质粒的构建及鉴定为验证本发明重组腺病毒对DC的感染效率，我们选用绿色荧光蛋白作为示踪蛋 白，构建携带GFP的pAdEasy-1/Fllp-GFP质粒。3、制备重组腺病毒 AdEasy-1/Fllp-GFP 重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP，携带GFP基因，方便观察其对DC细胞的感染效率。4、对照重组腺病毒的制备；
为了评价AdEasy-1/Fllp-GFP对DC细胞的感染效率，我们制备了对照腺病毒，为 AdEasy-1/GFP。5、重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP对DC感染效率的检测将AdEasy-1/Fllp-GFP和对照病毒AdEasy-1/GFP以不同感染滴度感染DC细胞， 24h后流式细胞术检测绿色荧光蛋白GFP的表达。6、重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP对DC细胞表型的影响将重组腺病毒感染DC细胞24h后，流式细胞术检测DC细胞表面分子的表达。7、重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP对DC细胞凋亡的影响本发明采用Armexin V_PE或PI染色法，利用流式细胞术检测DC细胞凋亡与死亡。8、重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP对混合淋巴细胞反应中DC对T细胞的刺激作 用的影响本发明利用尼龙棉柱法分离人外周血⑶3+细胞。采用3H_TdR掺入法检测混合淋 巴细胞反应。本发明的创新点在于对5型腺病毒的纤维顶球进行改造，使之能够高效感染DC细 胞，操作简单。
附图lpAdEasy-1/Fllp的构建示意图 PCR扩增合成嵌合基因中Agel和Mfel位点之间的DNA序列，替换pFiber5中Agel 与Mf el之间编码AdEasy-1纤维基因的片段，得到含有嵌合基因的新质粒pAdEasy-l/Fl lp。附图2骨架质粒pAdEasy-l/F lip的酶切鉴定M为A /HindiII Marker ； 1_6为不同克隆的Xbal I和Hindlll双酶切产物。骨 架质粒全长为8872bp，酶切产物长度为2399bp和6463bp，其中克隆5为非目的克隆。附图3AdEasy-l/Fllp_GFP的构建示意图1表示pShuttle-cmv经Pmel酶切，并电转BJ5183感受态细胞，与AdEasy-1/ Fllp-GFP 同源重组，得到 AdEasy-1/Fllp-GFP ；2 表示 AdEasy-1/Fllp-GFP 经 PacI 酶切线 性化；3表示线性化AdEasy-1/Fllp-GFP转染HEK293细胞，包装产生重组腺病毒。附图4重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP的鉴定采用PCR法鉴定；1、质粒AdEasy-1/Fllp为模板扩增Adllp纤维基因阳性对照； 2、AdEasy-1/Fllp-GFP基因组DNA为模板扩增Adllp纤维基因；3、AdEasy-1/GFP基因组 DNA为模板扩增Adllp纤维基因；4、质粒AdEasy-1为模板扩增Ad5纤维基因阳性对照；5、 AdEasy-1/GFP基因组DNA为模板扩增Ad5纤维基因；6、AdEasy-l/Fllp_GFP基因组DNA为模 板扩增Ad5纤维基因；7、AdEasy-l/GFP基因组DNA为模板扩增GFP ；8、AdEasy-l/Fllp_GFP 基因组DNA为模板扩增GFP ；M、DL2000Marker附图5经GM-CSF和IL-4诱导的成熟DC细胞附图6重组腺病毒Ad5_GFP和Ad5Fllp-GFP对DC感染效率的检测重组腺病毒感染DC细胞后，流式细胞术检测GFP蛋白的表达情况。横坐标代表重 组腺病毒的不同感染滴度，纵坐标代表GFP+细胞的比例。1代表0M0I，2代表50M0I感染， 3代表100M0I感染，4代表200M0I感染，5代表300M0I感染，6代表400M0I感染。
附图7DC细胞表面⑶46表达情况流式检测结果附图8重组腺病毒对DC细胞表型的影响利用流式细胞术检测重组腺病毒AdEasy-1/Fllp-GFP感染后DC细胞表面标志的 改变。Con代表对照组；G200M代表AdEasy_l/GFP200M0I感染细胞；P200M代表AdEasy-1/ Fllp-GFP 200M0I感染细胞。1代表⑶14，2代表⑶80，3代表⑶86，4代表HLA-DR，5代表 CDla，6 代表 CD83。附图9重组腺病毒对DC细胞凋亡的影响通过Armexin V_PE或PI染色法，利用流式细胞术检测DC细胞凋亡与死亡。Con 代表对照组；G200M 代表 AdEasy-l/GFP 200M0I 感染细胞；P200M 代表 AdEasy-l/Fl lp-GFP 200M0I感染细胞。1代表Annexin V，2代表PI。附图10重组腺病毒对混合淋巴细胞反应中DC对T细胞的刺激作用的影响采用3H_TdR掺入法检测混合淋巴细胞反应。Con代表对照组；G200M代表 AdEasy-l/GFP 200M0I 感染细胞；P200M 代表 AdEasy-l/Fllp-GFP 200M0I 感染细胞。横坐 标代表DC与同种异体T细胞的比例，纵坐标代表每分钟脉冲值(CPM值)。
具体实施例方式实施例1经纤维基因改造的骨架质粒AdEasy-1/Fllp的构建采用EcoRI酶切AdEasy-1骨架质粒，得到大片段和小片段，小片段环化形成 质粒pFiber5。PCR方式人工合成分F llp，取代pFiber5中的部分序列，得到重组质粒 pFiber5/llp。EcoRI线性化pFiber5/llp后，与EcoRI酶切AdEasy-1得到的大片段连接， 得到改造的骨架质粒AdEasy-l/Fllp(如附图1所示)。具体为(l)pFiber5 质粒的构建限制性内切酶EcoRI酶切pAdEasy-1，得到长度分别为23825bp和9625bp的两个 片段。其中小片段(9625bp)序列中包含纤维基因、AdEasy-1左臂同源区、pBR322复制起始 区和氨苄抗性基因的开放读码框，将其自连制备成小质粒，经酶切鉴定正确，该质粒命名为 pFiber5。(2)Flip相关序列的合成根据GeneBank中Adllp-fiber的基因序列(GI =33465830)自行设计的22条引物， 见序列表序列1 序列22，采用重叠延伸PCR方法，人工合成flip基因序列。具体为第 一轮分别扩增得到222bp，255bp，122bp，127bp，121bp和288bp，共6条条带；第二轮将1 3号产物合成得到527bp条带，将4 6号产物合成得到443bp条带；第三轮最终得到全长 F lip序列，其大小为984bp。Flip的全序列见序列表序列23。(3)质粒 pFiber5/llp 的构建将合成的F1 lp的DNA序列，经酶切连接替换pFiber5中的部分序列。具体为AgeI 和Mfel双酶切pFiber5质粒，回收大片段，并将其与Flip片段连接得到目的质粒，经酶切、 PCR和测序鉴定正确，将该质粒命名为pFiber5/llp。该质粒的全序列见序列表序列24。(4)经纤维基因改造的骨架质粒AdEasy-1/Fllp的构建用EcoRI酶切pFiber5/llp，去磷酸化，与AdEasy-1的长度为23825bp片段相连， 经氨苄青霉素筛选得到骨架质粒AdEasy-1/Fllp。经酶切鉴定正确(如附图2所示)。
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实施例2穿梭质粒pShuttle-cmv-GFP的构建其方法是以pEGFP-Cl质粒为模板，扩增得到GFP基因，将其通过酶切、连接的方法 克隆到穿梭质粒pShuttle-cmv上。具体为(1)目的基因GFP的扩增根据pEGFP-Cl 的序列(B. D. Clontech, Palo Alto, CA, USA)设计引物，见序列表 序列25 序列26。以pEGFP-Cl为模板，PCR扩增得到GFP基因。(2)pShuttle-cmv_GFP 的构建Bglll和EcoRV分别酶切穿梭质粒pShuttle-cmv和目的基因GFP，连接，并采用 Kana+筛选得到携带GFP的穿梭质粒pShuttle-cmv-GFP，经酶切、PCR和测序鉴定正确。实施例3重组腺病毒Ad5Fl lp-GFP和Ad5_GFP的制备其方法是Pmel酶切穿梭质粒pshuttle-cmv-GFP，电转BJ5183感受态细胞，与 Ad5Fllp或AdEasy-1同源重组获得重组腺病毒质粒Ad5Fllp_GFP和Ad5_GFP(如附图3所 示)。PacI酶切重组腺病毒质粒，并将其转染HEK293细胞制备病毒。鉴定正确后，进行扩 增、纯化和滴度测定(如附图4所示)。(1)重组腺病毒质粒的产生将穿梭质粒pshuttle-cmv-GFP进行Pmel酶切，并去磷酸化，以“200Q，2. 5KV, 25 u F”的条件电击转化BJ5183-AdEasy-l (购自 Stratagene 公司)或者 BJ5183_AdEasy-l/ Flip感受态细胞(自行制备)同源重组，Kana+筛选得到腺病毒质粒AdEasy-1/Fllp-GFP和 AdEasy-l/GFP。PacI酶切鉴定正确后进行重组腺病毒的制备。(2)重组腺病毒的制备鉴定正确的重组腺病毒质粒pAdEasy-l/Fl lp-GFP和pAdEasy-1/GFP，经PacI酶切 和酚氯仿抽提纯化，转染包装细胞HEK293(保藏号C12-7-14)，8天噬斑形成，lid细胞完全 病变。收集细胞及上清，反复冻溶3次后离心收集上清。制备得到的重组腺病毒能够表达 GFP蛋白。(3)重组腺病毒的鉴定病毒上清感染HEK293细胞，48 72h出现细胞病变。收集细胞，荧光显微镜观察 或者流式细胞仪检测，可以观察到绿色荧光蛋白的表达。以上结果表明我们成功制备了重 组腺病毒AdEasy-l/Fl lp-GFP及对照腺病毒AdEasy-1/GFP。(4)重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定重组腺病毒感染HEK293细胞后进行病毒扩增，收集病变细胞。氯化铯密度梯度法 纯化后于_80°C保存在含10%甘油的Hank’ s液中备用。用紫外分光光度计法和有限稀释 法分别测定重组腺病毒AdEasy-1/GFP和AdEasy-1/Fllp-GFP的颗粒滴度(viral particle units permilliliter, vp/ml)，纯度(0D260nm/280nm)禾口感染滴度(infection unitsper milliliter, IU/ml)，这些指标均符合实验需要，结果见表1。表1重组腺病毒AdEasy-1/GFP和AdEasy-l/Fl lp-GFP滴度测定结果
权利要求
1. 一种用于DC高效基因转移的重组腺病毒载体，其特征在于以AdEasy-I载体系统为 基础，将AdEasy-I载体中编码5型腺病毒纤维顶球和柄部的DNA序列替换为Ilp型腺病毒 的相应部分。
2.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于Flip具有序列表中序列23所 述的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于其包括序列表中序列24所述的 核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于该腺病毒载体的构建方法是将携带 目的基因的穿梭质粒和改构的腺病毒骨架质粒AdEasy-1/FllP在细菌内同源重组获得重 组腺病毒质粒；PacI线性化后转染到293细胞制备得到重组腺病毒。
5.一种重组腺病毒，其特征在于蛋白序列由权利要求1-4所述的腺病毒载体所编码。
6.权利要求1-5任一项所述的重组腺病毒在DC生物治疗中的应用。
全文摘要
一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒，该发明涉及生物技术和基因治疗领域的一种高效介导DC基因转移的重组腺病毒载体系统的建立(摘要附图1)，及其对DC感染效率的验证以及对DC生物学特性影响的检测。该重组腺病毒可以高效感染DC细胞，进而介导示踪基因GFP在DC细胞内高效表达；该重组腺病毒本身不会影响DC的细胞表型、细胞凋亡以及DC对T细胞的刺激活性。
文档编号C12N15/861GK102002513SQ201010154620
公开日2011年4月6日 申请日期2010年4月26日 优先权日2010年4月26日
发明者吴祖泽, 杨月峰, 王 华, 王立生, 胡泽斌, 鲁茁壮 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所